王華卿 張浩 沈東海 魏炳玉 王梓卉 許瑾瑾 鐘曉鳴

475000 開封，河南大學(xué)淮河醫(yī)院心內(nèi)科

中性粒細胞是人體含量最多的天然免疫細胞，起到重要的免疫防御作用。通常認為中性粒細胞通過吞噬、釋放抗菌肽抵抗微生物入侵，近年來，研究者發(fā)現(xiàn)了一種新機制—中性粒細胞外誘捕網(wǎng)(neutrophils extracellular traps，NETs)[1]。2004年，有研究者初次發(fā)現(xiàn)NETs的存在，在體外用白細胞介素8(interleukin，IL-8)、佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)或脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激中性粒細胞后，發(fā)現(xiàn)細胞表面形成明顯突起，一段時間后在電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細胞周圍存在一種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[2]。NETs是中性粒細胞在活性氧(reactive oxygen species，ROS)、肽?；彼崦搧啺泵?(peptidylarginine deiminase 4，PAD4)、自噬等多種因素[3]的影響下釋放出的一種以DNA為基本骨架，附著以顆粒蛋白和組蛋白的高濃度絲網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。NETs的釋放過程稱為NETosis，這是一種區(qū)別于細胞壞死與細胞凋亡的過程，目前并不清楚NETosis的具體機制是什么，但通常認為與細胞膜的破裂或囊泡的釋放有關(guān)[4]。

1 NETs產(chǎn)生、釋放及與凋亡、壞死的區(qū)別

高分辨率掃描電子顯微鏡顯示，NETs由DNA片段和蛋白質(zhì)組成。經(jīng)過染色后發(fā)現(xiàn)DNA是NETs的主要結(jié)構(gòu)成分，在使用脫氧核糖核酸酶(DNase Ⅰ)短暫處理后造成了NETs的崩解。相反，蛋白酶處理后NETs骨架較為完整，這表示DNA不受影響[2]。通過免疫熒光分析證實，NETs含有中性粒細胞彈性蛋白酶、組織蛋白酶G、髓過氧化物酶、乳鐵蛋白和明膠酶等蛋白質(zhì)，但NETs中不存在常見的胞質(zhì)蛋白[2]。

NETosis包括細胞的去核化，染色質(zhì)的去濃縮、核膜以及顆粒膜的崩解[1]，并不一定造成細胞死亡[5-6]。NETosis可以由微生物和內(nèi)源性刺激引發(fā)，例如損傷相關(guān)模式分子和免疫復(fù)合物、膽固醇晶體、細菌、真菌、病毒等[7]。NETosis不同于細胞凋亡和細胞壞死：發(fā)生NETosis時核膜分解后核內(nèi)容物與顆粒蛋白合并、染色質(zhì)去濃縮，細胞收縮將DNA和蛋白質(zhì)排出形成NETs，NETs在細胞外固定病原微生物，使其成為免疫細胞的靶點；細胞凋亡是程序化死亡，細胞收縮、染色質(zhì)凝聚、細胞核分段化、細胞質(zhì)出現(xiàn)空泡；壞死源于急性細胞損傷，細胞膨脹，失去分葉核核型直到細胞膜破裂并釋放內(nèi)容物到胞外。與凋亡不同的是，NETosis和壞死都導(dǎo)致組織炎癥的發(fā)生[1]。

NETs的釋放方式有兩種(圖1)，第一種是由金黃色葡萄球菌通過補體受體或Toll樣受體2(toll-like receptor 2，TLR2)，或通過大腸桿菌作用于TLR4或TLR4激活的血小板誘導(dǎo)。在幾分鐘內(nèi)發(fā)生NETosis，可獨立于細胞死亡而發(fā)生，包括核膜破裂排出染色質(zhì)，釋放顆粒蛋白。釋放NETs后留下活化的無核細胞質(zhì)，繼續(xù)發(fā)揮吞噬作用；第二種是PMA、抗體、膽固醇晶體誘發(fā)的NETosis，在刺激數(shù)小時后細胞膜破裂排出NETs，中性粒細胞死亡[7]。

圖1 NETs的兩種釋放方式

我們還發(fā)現(xiàn)，不同的研究者對NETs的釋放過程以及釋放出NETs后細胞死亡的定義有所不同，在相應(yīng)定義下涉及的細胞類型也有所區(qū)別。例如有研究者將NETs釋放后的死亡方式稱為NETotic細胞死亡[8]，但這種方式仍缺乏較為明確的表型[9]，本文仍使用NETosis對中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)的釋放過程進行稱謂，認為NETs釋放后的細胞死亡是NETosis發(fā)生后的一種結(jié)果。

2 調(diào)控NETs形成的關(guān)鍵因素

PAD4在NETs形成中也起到關(guān)鍵作用，其將組蛋白的精氨酸殘基瓜氨酸化形成瓜氨酸化的組蛋白(CitH3)，只有染色質(zhì)去濃縮才能形成NETs，而瓜氨酸化的組蛋白直接參與了這一過程。用PAD4敲除小鼠與野生型小鼠共同實驗，給予相同的LPS與PMA處理后用蛋白印跡法檢測發(fā)現(xiàn)PAD4敲除小鼠體內(nèi)沒有CitH3，且沒有發(fā)現(xiàn)NETs的形成[10]。如果對PAD4敲除小鼠進行處理，使其PAD4過表達后會發(fā)現(xiàn)小鼠在36 h內(nèi)出現(xiàn)高密度的CitH3、去濃縮的染色質(zhì)，之后形成了大量細胞外網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。此過程中未發(fā)現(xiàn)caspase-3的剪切，這也證明了PAD4過表達后引起的不是細胞凋亡而是NETosis[11]。細胞內(nèi)Ca2+峰值對于在中性粒細胞激活時細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是十分重要，并且PAD4由Ca2+激活[3]。

中性粒細胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)與髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)也在調(diào)節(jié)NETs形成過程中起到了重要作用。中性粒細胞未受刺激時，NE和MPO儲存在胞質(zhì)的顆粒中。在活化和ROS產(chǎn)生后，NE從顆粒易位至細胞核并切割組蛋白以及促進染色質(zhì)去濃縮。隨后MPO與染色質(zhì)結(jié)合促進染色質(zhì)去濃縮。NE對于NETs形成是必不可少的，NE和MPO協(xié)同增強染色質(zhì)去濃縮，導(dǎo)致細胞膜破裂和NETs的釋放。實驗還發(fā)現(xiàn)NE基因敲除小鼠無法形成NETs[12]。

自噬參與NETs的釋放。mTOR(雷帕霉素靶蛋白)是在包括中性粒細胞在內(nèi)的許多哺乳動物細胞中參與自噬的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。抑制mTOR活化可以驅(qū)動自噬發(fā)生，誘導(dǎo)組蛋白瓜氨酸化與NETs的釋放[13]。在使用針對自噬的抑制劑渥曼青霉素時發(fā)現(xiàn)細胞不再出現(xiàn)空泡化、染色質(zhì)也無法去濃縮，導(dǎo)致了NETosis的減少與細胞凋亡的增加[14]。

3 NETs與I/R損傷

大量研究表明NETs加劇I/R損傷。動脈搭橋術(shù)、溶栓療法、經(jīng)皮腔內(nèi)冠脈血管成形術(shù)、心臟外科體外循環(huán)、心肺腦復(fù)蘇，斷肢再植和器官移植等方法的建立和推廣應(yīng)用，使許多組織器官缺血后重新得到血液再灌注。其目的在于恢復(fù)組織器官功能并起到修復(fù)作用，但同時也導(dǎo)致了I/R損傷。其發(fā)生機制尚未闡明，但認為線粒體損傷、自由基生成增多、鈣超載、炎癥反應(yīng)過度激活可能是主要原因。

3.1 心臟I/R損傷

目前，臨床上主張早期進行再灌注作為急性心肌梗死的主要治療方式之一。溶栓治療和經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈介入治療都旨在降低心肌損傷的程度。然而，大量的實驗和臨床證據(jù)表明，再灌注可以通過阻塞的冠狀動脈恢復(fù)血流，但加劇了心肌損傷程度[15]。心肌I/R存在多種病理生理學(xué)現(xiàn)象，包括心律失常、心肌頓抑、無復(fù)流現(xiàn)象、炎癥等[16]。影響其發(fā)生的關(guān)鍵因素有氧化應(yīng)激、鈣超載、pH的快速恢復(fù)、線粒體膜電位的破壞等[17]。在受到I/R損傷的心肌中發(fā)現(xiàn)了NETs的存在[18]。心肌I/R損傷導(dǎo)致細胞因子增加、自噬激活和ROS的生成，對NETosis的發(fā)生十分關(guān)鍵。在心肌缺氧部位的血液循環(huán)中，NETs的形成不僅為血栓形成提供了支架，而且會加重內(nèi)皮細胞的損傷，這兩者都是造成冠狀動脈無復(fù)流的重要原因。在使用rt-PA的基礎(chǔ)上加入DNase Ⅰ處理后發(fā)現(xiàn)心梗面積下降，M型超聲心動圖顯示心臟功能改善且比單一使用纖溶酶原激活劑(recombinant tissue plasminogen activator，rt-PA)或DNase Ⅰ效果顯著[19]。這證明了NETs在心肌I/R中發(fā)揮了加劇損傷的作用。rt-PA和DNase Ⅰ聯(lián)合治療主要針對I/R中NETs引起的無復(fù)流現(xiàn)象。

3.2 腦I/R損傷

在研究缺血性中風(fēng)的實驗中建立了大鼠永久大腦中動脈堵塞再灌注模型(middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MACO/R)的模型，中性粒細胞在受傷后很快滲入受損的腦組織并加重炎癥，隨后在不同的時間點于軟腦膜、紋狀體、腦實質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了CitH3，證明了NETs的存在。一種損傷相關(guān)模式分子(DAMP)—HMGB1，在MACO/R模型中大量積累在血清中，促進了CitH3的形成。全巰基和二硫化物類型的HMGB1分別通過其特異性受體CXCR4和TLR4誘導(dǎo)CitH3。重要的是，HMGB1不僅誘導(dǎo)了NETosis，而且作為NETs的一部分被排出細胞外，有助于NETosis介導(dǎo)的神經(jīng)元死亡。在神經(jīng)細胞死亡和NETosis之間存在惡性循環(huán)[20]。腦缺血后處理(ischemic post-conditioning，IPOC)已被證明對腦I/R損傷具有神經(jīng)保護作用。IPOC可以抑制自噬與HMGB1釋放。自噬[21]與HMGB1[22]均已被證實在腦I/R損傷中發(fā)揮了作用；自噬[3]與HMGB1[20]也在NETs形成中發(fā)揮了作用，因此我們考慮自噬與HMGB1可能是通過NETs的形成加劇了腦I/R損傷。

3.3 肝I/R損傷

在肝臟I/R損傷模型中，重組HMGB1蛋白處理后通過TLR4/9增加CitH3表達和NETs的形成參與了I/R損傷[20]。聚環(huán)氧乙烷(DRP)是一種用于減少血管內(nèi)阻力的無毒聚合物，在小鼠肝臟缺血-再灌注損傷后發(fā)現(xiàn)高水平CitH3，用DRP處理后其含量下降，而且與對照相比，在DRP處理的肝臟I/R的小鼠中，MPO-DNA復(fù)合物在血清中的含量降低。DRP也會減少肝臟中血小板聚集和微血栓形成，可能是通過作用于NETs來實現(xiàn)的，這也證明了NETs可能通過嵌頓血管的無復(fù)流現(xiàn)象造成缺血-再灌注損傷。

3.4 腸I/R損傷

當(dāng)大鼠發(fā)生腸I/R損傷時，大量中性粒細胞就會滲入腸道組織，然后發(fā)生NETosis導(dǎo)致游離DNA(cfDNA)大量釋放到血液中。在缺血1 h和再灌注2 h后，大鼠血清和回腸組織中很容易檢測到細胞外DNA。這與先前的諸多研究結(jié)果相吻合，認為這證明了NETs的存在。NETs可以破壞腸上皮細胞而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，加劇了腸道損傷，腸道I/R損傷后細胞緊密連接和細胞骨架結(jié)構(gòu)的功能完整性被破壞。因此認為NETs參與了I/R損傷后的腸道炎癥的發(fā)生[23]。

3.5 腎I/R損傷

PAD4在I/R誘導(dǎo)的急性腎損傷中起關(guān)鍵作用。在小鼠腎I/R之前，用DNase Ⅰ處理可以抑制NETs形成并且部分保護小鼠免受I/R誘導(dǎo)的腎損傷。PAD4特異性抑制劑YW3-56有效抑制I/R誘導(dǎo)的小鼠腎損傷。在PAD4缺陷小鼠中，來自野生型小鼠的中性粒細胞的轉(zhuǎn)移足以促進腎臟中的NETs形成和I/R后腎功能的降低。相比之下，在接受來自PAD4缺陷小鼠的嗜中性粒細胞的PAD4敲除小鼠腎臟中未顯示出可檢測的NETs，并且受到I/R誘導(dǎo)的腎損傷的保護。通過該實驗發(fā)現(xiàn)NETs的有無和腎功能的降低與否是同步的[24]。

3.6 肢體I/R損傷

TLR已被證明在介導(dǎo)靜脈血栓形成和心臟和大腦的I/R損傷中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，且TLR在NETs形成中發(fā)揮了重要作用[7]。TLR4突變小鼠后肢I/R損傷的減輕也與NETs的減少有關(guān)。通過野生型(WT)小鼠與TLR4突變(TLR4m)小鼠進行實驗，將小鼠后肢進行I/R，發(fā)現(xiàn)WT組的肌纖維損傷顯著大于TLR4m組，WT組的MPO陽性細胞顯著多于TLR4m組，顯現(xiàn)出MPO標(biāo)記陽性的細胞即中性粒細胞密度增加的區(qū)域也顯示NETs含量的增高。NETs主要存在于間質(zhì)組織，血管周圍和微血管血栓中。經(jīng)免疫熒光顯示在TLR4m 組中NETs的量較低，并且在對照對側(cè)后肢組織切片中檢測不到NETs的存在，而在DNase Ⅰ處理后對WT組織切片進行NETs染色后發(fā)現(xiàn)免疫熒光顯示間質(zhì)中NETs顯著減少[25]。

NETs在器官I/R損傷中起到了負面的作用，表現(xiàn)為降低器官功能、引起炎癥、與內(nèi)皮細胞作用并造成損傷、導(dǎo)致神經(jīng)細胞死亡、嵌頓微血管等。

4 結(jié)論

中性粒細胞在I/R損傷中起到關(guān)鍵作用，NETs由中性粒細胞釋放，且NETosis與I/R損傷的機制存在交集，例如通過NADPH產(chǎn)生ROS、Ca2+超載與對PAD4的激活、TLR家族的TLR4在炎癥反應(yīng)與NETs形成中均發(fā)揮作用，因此NETs參與并影響了組織器官的I/R損傷?，F(xiàn)在，尚不明確NETs是通過何種機制參與并影響I/R損傷，我們猜測可能是NETs作用于血管內(nèi)皮細胞造成水腫以及細胞間隙增大并在損傷部位聚集造成了微血管嵌頓、損傷黏膜上皮細胞及細胞聯(lián)接加劇炎癥、NETs上附著的顆粒蛋白具有細胞毒性造成組織細胞損傷并延緩組織修復(fù)、刺激巨噬細胞與樹突狀細胞產(chǎn)生細胞因子造成炎癥反應(yīng)過度激活等，以此為研究方向可能會有所進展。通過減弱I/R損傷后的氧化應(yīng)激、抑制PAD4的活性、防止Ca2+濃度劇烈變化、抑制TLR4參與的信號通路活性、減弱NETs上的顆粒蛋白毒性可能會緩解NETs造成的損傷[26-27]。將NETs作為治療的靶點或采用針對NETs的治療方案可以減緩I/R損傷，這對疾病治療具有重要意義。

利益沖突：無