朱奕潼 曹明強(qiáng)

215009 蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院蘇州檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(朱奕潼)；215006 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科(曹明強(qiáng))

在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，大多數(shù)蛋白質(zhì)處于動(dòng)態(tài)流動(dòng)狀態(tài)。每個(gè)細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成和降解的平衡受到高度調(diào)控，并以特定的方式發(fā)生以維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。然而，在心臟重構(gòu)的情況下，這種平衡被打破，導(dǎo)致毒性蛋白質(zhì)蓄積。為確保錯(cuò)誤折疊或異常蓄積的蛋白質(zhì)得到及時(shí)修復(fù)或清除，需要一套分子機(jī)制單獨(dú)或協(xié)作進(jìn)行質(zhì)量控制，包括分子伴侶和共伴侶、自噬-溶酶體通路和泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system，UPS)[1]。近年來，UPS的變化在家族性心肌病中的作用越來越受到認(rèn)可。心肌病指的是一組以心臟結(jié)構(gòu)和功能異常為特征的疾病，且排除冠心病、高血壓、瓣膜病和先天性心臟病等繼發(fā)性改變，主要分為肥厚型、擴(kuò)張型、限制性和致心律失常性右心室心肌病[2]。最常見的家族遺傳性心肌病為肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy，HCM)和擴(kuò)張型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)，通常與編碼肌節(jié)、細(xì)胞骨架、肌漿網(wǎng)、t小管等蛋白的基因突變有關(guān)[3]。本文對UPS進(jìn)行文獻(xiàn)綜述，在HCM和DCM的背景下，討論UPS參與的發(fā)病機(jī)制并提出潛在的干預(yù)靶點(diǎn)。

1 UPS簡介

UPS是大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)胞漿蛋白、核蛋白和肌原纖維蛋白高選擇性降解不可缺少的部分，控制許多生理過程，如細(xì)胞周期、細(xì)胞分裂、免疫反應(yīng)、抗原呈遞、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞信號傳導(dǎo)等。UPS不僅可以降解底物，而且在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄活性[4]。

UPS對蛋白質(zhì)的降解作用是一個(gè)ATP依賴的多階段過程，降解前通過26S蛋白酶體對目標(biāo)蛋白進(jìn)行首次泛素化。目標(biāo)蛋白的泛素化是一個(gè)涉及E1(泛素激活)、E2(泛素偶聯(lián))和E3(泛素連接酶)在內(nèi)的酶促級聯(lián)反應(yīng)[5]。哺乳動(dòng)物目前已知有2種E1、40種E2和600多種E3酶。泛素化過程的發(fā)生具有空間、時(shí)間和底物特異性，這取決于E3泛素連接酶。泛素化過程中，泛素C端羧基通過異肽鍵與賴氨酸殘基胺共價(jià)結(jié)合。根據(jù)泛素分子中7個(gè)可用賴氨酸殘基的使用情況，形成不同連接方式的泛素鏈，如K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63。泛素鏈分為線性泛素化、單泛素化、多泛素化、支鏈泛素化或混合泛素鏈，不同的鏈被不同的蛋白質(zhì)識別并靶向不同的信號通路[6]。

UPS功能的評估方法有很多，使用Western Blot方法可測定泛素化蛋白質(zhì)的穩(wěn)定水平，泛素化和去泛素化酶，以及蛋白酶體亞基。此外，熒光合成基質(zhì)法常用來測定蛋白質(zhì)的水解活性，缺點(diǎn)是這些小的基質(zhì)很容易以非泛素化的方式進(jìn)入20S的核心。為了深入觀察進(jìn)入活體細(xì)胞中UPS的動(dòng)態(tài)行為可采用熒光標(biāo)記UPS組件，包括熒光泛素和熒光標(biāo)記的蛋白酶體亞基[7]。目前，表達(dá)UPS熒光底物的轉(zhuǎn)基因小鼠模型已經(jīng)建立用以破譯UPS在整個(gè)動(dòng)物中的作用[8-9]。

2 UPS與家族性原發(fā)性心肌病

UPS功能的損傷足以引起一系列心臟疾病，包括心力衰竭、心肌疾病、肥厚、萎縮、缺血再灌注和動(dòng)脈粥樣硬化，究其原因，至少部分是由于泛素化蛋白積累、蛋白異常聚集(如前淀粉樣低聚體形成)以及蛋白酶體活性改變所致[10-11]。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，家族性HCM和DCM中UPS發(fā)生了顯著的變化。

2.1 UPS與HCM

HCM是最常見的心臟遺傳性疾病，呈常染色體顯性遺傳，60%～70%為家族性，30%～40%為散發(fā)性，家族性病例和散發(fā)病例、兒童病例具有同樣的致病基因突變[12]。目前已證實(shí)，至少14種基因突變與HCM的發(fā)病有關(guān)，其中有10種是編碼肌小節(jié)結(jié)構(gòu)蛋白的基因，最常見的突變基因是編碼心肌肌凝結(jié)合蛋白C(cMyBP-C)的MYBPC3[13]。人類MYBPC3基因突變導(dǎo)致的cMyBP-C破壞后性質(zhì)不穩(wěn)定，不能很好地與肌節(jié)結(jié)合[14]。在純合子MYBPC3靶向敲入和敲除小鼠發(fā)生左心室肥大伴收縮和舒張功能障礙的同時(shí)，檢測到其蛋白酶體活性升高，且在出生后的前3個(gè)月，與左心室肥大的程度呈正相關(guān)[15]。除了MYBPC3，MuRF E3連接酶的作用也越來越受到重視。MuRF1是MuRF E3連接酶的成員之一，已被證實(shí)可以維持肌細(xì)胞內(nèi)肥大和反肥大信號的平衡，這種平衡是通過抑制肌細(xì)胞中蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)介導(dǎo)的信號來實(shí)現(xiàn)的。PKCs是心肌肥厚的重要觸發(fā)器，PKCε的激活主要通過Gαq過表達(dá)或與活化的蛋白激酶C受體1結(jié)合兩種方式，最終導(dǎo)致心肌肥厚[16-17]。MuRF1還調(diào)節(jié)三碘甲狀腺原氨酸，這是一種活躍的甲狀腺激素，MuRF1可抑制三碘甲狀腺原氨酸誘導(dǎo)的生理性心肌肥厚以維持心臟穩(wěn)態(tài)[18]。TnT突變約占HCM病例的7%，Gilda等[19]發(fā)現(xiàn)3月齡的嚴(yán)重TnT相關(guān)HCM小鼠的心臟UPS功能受損，在這些轉(zhuǎn)基因小鼠模型上進(jìn)行的蛋白組學(xué)研究表明，多個(gè)蛋白酶體亞基的表達(dá)受到影響。其他致病基因的突變較為罕見，僅在孤立的HCM中被發(fā)現(xiàn)，例如編碼錨蛋白重復(fù)域1的FHL1發(fā)生突變的錯(cuò)義和截?cái)啾磉_(dá)以及ANKRD1的錯(cuò)義突變，ANKRD1與MuRF1和MuRF2相互作用，提示其可通過MuRF1介導(dǎo)降解[20]。

2.2 UPS與DCM

DCM的特點(diǎn)是心室增大、收縮功能障礙和心肌纖維化[21]。20%～50%的DCM是常染色體顯性遺傳的家族性疾病[3]。與HCM相比，DCM的基因基礎(chǔ)更加多樣化，與其相關(guān)的單基因大約有50多種[22]。研究發(fā)現(xiàn)，DCM心臟中蛋白酶體受損以及泛素化途徑發(fā)生改變，泛素化途徑中不同蛋白的丟失或突變與DCM的發(fā)病有關(guān)[23]。DCM主要是編碼α-B-crystallin的CRYAB和編碼desmin 的DES突變引起的。CRYAB或DES突變導(dǎo)致異常蛋白積累，在desmin相關(guān)性心肌病(desmin-related myopathy，DRM)中發(fā)生嚴(yán)重的DCM[24]。通過CRYAB和Des-D7突變獲得的DRM轉(zhuǎn)基因小鼠模型在心力衰竭前便出現(xiàn)了UPS系統(tǒng)的損傷，可能與泛素化蛋白進(jìn)入20S蛋白酶體的傳遞相關(guān)[25-26]。Murata等[27]發(fā)現(xiàn)，小鼠幼年期心臟PRMT1缺失可誘導(dǎo)DCM，并在PRMT1-cKO小鼠中鑒定出從選擇性剪接mRNA轉(zhuǎn)譯而來的Eif4a2蛋白亞型可被UPS差異泛素化和降解。Li等[28]發(fā)現(xiàn)，血漿LMO7基因水平與左室舒張末徑、左室舒張末容積、腦鈉肽呈負(fù)相關(guān)，提示LMO7基因可能在漢族人群DCM發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。DCM患者心肌組織的E3連接酶MAFbx蛋白表達(dá)量明顯下降[29]，Watanabe等[30]發(fā)現(xiàn)，心臟E3連接酶FBXO32(Atrogin 1/MAFbx)純合子突變(Gly243Arg)與DCM有一定的相關(guān)性。與DCM相關(guān)的其他基因也受UPS介導(dǎo)監(jiān)管，如編碼核纖層蛋白A/C的LMNA，它們是核膜的蛋白質(zhì)，LMNA突變易誘發(fā)DCM，出現(xiàn)傳導(dǎo)和(或)節(jié)律缺陷[31]。

3 UPS損害的機(jī)制和對心肌的影響

基因突變導(dǎo)致UPS受損的機(jī)制尚未完全闡明。錯(cuò)誤折疊突變蛋白逃脫了伴侶和UPS的監(jiān)視容易形成聚集物，對細(xì)胞有潛在的毒性。Robins等[32]研究表明，人類HCM或DCM心肌細(xì)胞普遍發(fā)生淀粉樣變性。而UPS工作不足本身可能會(huì)刺激細(xì)胞從適應(yīng)性反應(yīng)向促凋亡反應(yīng)轉(zhuǎn)變。值得注意的是，累加和(或)錯(cuò)誤折疊蛋白的聚集本身可能導(dǎo)致UPS受損，從而形成一個(gè)有害的反饋回路，造成惡性循環(huán)(圖1)。

Ca2+：鈣離子；UPS：泛素-蛋白酶體系統(tǒng)；E1/E2/E3：泛素激活/泛素偶聯(lián)/泛素連接酶；HCM：肥厚型心肌?。籇CM：擴(kuò)張型心肌病

UPS損傷可能會(huì)對心臟造成多種后果，介導(dǎo)心肌纖維生成和分化的幾個(gè)信號蛋白，如β-catenin和calcineurin通常由UPS降解[34]。同時(shí)，p53是E3泛素連接酶MDM2的靶點(diǎn)[35]。因此，蛋白酶體損傷可引起促肥大和促凋亡因子水平的升高。研究表明，UPS損傷可激活鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶-NFAT通路，促進(jìn)心肌細(xì)胞非適應(yīng)性重構(gòu)[36]。HCM患者心肌細(xì)胞PGlu334LysMYBPC3突變的表達(dá)引起UPS損傷，造成促凋亡因子的蓄積和鈣離子活動(dòng)的改變，可導(dǎo)致心律失常[37]。

4 針對心肌病的UPS干預(yù)措施

UPS在維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面具有中心地位。由于其參與多種重要的調(diào)控過程，許多參與泛素化、去泛素化或泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解被認(rèn)為是潛在的藥物靶點(diǎn)。近年來，蛋白酶體的抑制成為心臟疾病治療的熱點(diǎn)。不可逆蛋白酶體抑制劑環(huán)氧米星已被證實(shí)可以完全阻止大鼠主動(dòng)脈橫向收縮(transverse contraction of aorta，TAC)[38]。此外，在TAC發(fā)生2周后即明顯肥大階段給予環(huán)氧酶素，可引起小鼠心肌肥大消退，穩(wěn)定心功能[39]。相比之下，使用不可逆蛋白酶體抑制劑PS-519治療小鼠異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥大則效果不明顯。然而，關(guān)于蛋白酶體抑制劑的心臟保護(hù)作用，存在著相互矛盾的數(shù)據(jù)。硼替佐米是一種新型的二肽硼酸，是第一個(gè)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的蛋白酶體抑制劑，用于治療多發(fā)性骨髓瘤患者。長期服用硼替佐米誘導(dǎo)左心室肥厚的程度與TAC相似，可導(dǎo)致小鼠心力衰竭和早亡[36]。長期使用可逆抑制劑MLN-273(硼替佐米的類似物)進(jìn)行治療可導(dǎo)致模型豬的左心室肥厚、舒張功能障礙和心排血量下降。重要的是，包括老年患者或已存在心臟問題的患者使用硼替佐米后會(huì)出現(xiàn)心功能障礙甚至心力衰竭等并發(fā)癥。故在UPS功能失調(diào)的情況下，持續(xù)的蛋白酶體抑制劑預(yù)計(jì)會(huì)惡化病情，部分或短期的蛋白酶體抑制劑可能具有心臟保護(hù)作用。

另一方面，鑒于在人類和心肌疾病實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭杏^察到的蛋白酶體功能的整體降低，蛋白酶體功能的重新激活被認(rèn)為是更合適和有益的。Li等研究表明，蛋白酶體增強(qiáng)誘導(dǎo)的超表達(dá)蛋白酶體活化劑28α(PA28α)可減少心臟肥大，推遲過早死亡，防止DRM小鼠模型的急性心肌缺血/再灌注損傷，但目前尚無藥物可以模擬這種效果。另一種增強(qiáng)蛋白酶體功能的方法是靶向蛋白激酶G。蛋白激酶G可被PDE5抑制劑西地那非激活以提高cGMP水平。西地那非在心力衰竭患者和動(dòng)物模型中可誘導(dǎo)逆轉(zhuǎn)重構(gòu)和改善左室舒張功能，可能是一種新的治療方法。

此外，泛素化過程可通過去泛素化酶(DUBs)逆轉(zhuǎn)。Liu等[41]研究發(fā)現(xiàn)，泛素特異性蛋白酶14去泛素酶活性降低導(dǎo)致心肌肥厚特異性標(biāo)志物b-MHC表達(dá)水平降低，進(jìn)而導(dǎo)致GSK-3b磷酸化水平降低，表明泛素特異性蛋白酶14可能是心肌肥厚治療的新靶點(diǎn)。

5 小結(jié)

UPS功能不全的病因及其引起心肌疾病的機(jī)制尚處于探究的起步階段，尚需對UPS在心肌疾病中的病因和作用進(jìn)行深入研究。對于家族遺傳性心肌病的治療而言，蛋白酶體的整體抑制可能是有害的，蛋白酶體功能的重新激活是一個(gè)更有前途的治療方法。今后仍需在心臟的細(xì)胞模型、動(dòng)物模型和人體模型中尋找UPS的特異性靶點(diǎn)，以提高心肌病的療效。

利益沖突：無