王玥慧 王芬 李鈺鑫 周杰 李志明 劉傳波

摘要 目的：采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法探究西黃丸防治非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）潛在分子機(jī)制。方法：在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）及BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫中篩選分析西黃丸的有效活性成分及作用靶點。在GeneCards數(shù)據(jù)庫與人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM）中檢索獲取NSCLC的相關(guān)靶點，選取與西黃丸的交集靶點作為研究靶點。利用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖。采用Cytoscape 3.7.0軟件構(gòu)建藥物-靶點-疾病可視化互作網(wǎng)絡(luò)圖。使用DAVID數(shù)據(jù)對篩選分析出的關(guān)鍵靶點，進(jìn)行基因本體（GO）功能富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，最后運(yùn)用AutoDock Vina軟件和Pymol軟件對藥物有效活性成分和關(guān)鍵靶點進(jìn)行分子對接驗證。結(jié)果：通過篩選得到西黃丸51個主要活性成分，包括槲皮素、β-谷甾醇等，其中作用于NSCLC的靶點有178個，關(guān)鍵靶點有MAPK1、JUN、AKT1、TP53、RELA等。GO和KEGG分析結(jié)果顯示，西黃丸治療NSCLC的機(jī)制涉及多個生物學(xué)過程及PI3K-AKT信號通路、MAPK信號通路、TNF信號通路等多種信號通路。藥物有效活性成分與關(guān)鍵靶點對接活性良好。結(jié)論：網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析顯示西黃丸治療NSCLC是多成分、多靶點、多通路協(xié)同起效，為后續(xù)相關(guān)實驗提供了充分的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 西黃丸;非小細(xì)胞肺癌;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);分子對接;機(jī)制研究

Abstract To explore the potential molecular mechanism of Xihuang Pills in preventing and treating non-small cell lung cancer（NSCLC） by means of network pharmacology and molecular docking.Methods：The effective active components and targets of Xihuang Pills were screened and analyzed in TCM MSP and BATMAN-TCM database.We searched the related targets of NSCLC in GeneCards database and OMIM database，and selected the intersection target with Xihuang Pills as the research target.Protein-protein interaction network diagram was constructed by using STRING database.The network diagram of drug-target-disease visual interaction was constructed by using Cytoscape 3.7.0 software.GO function enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis were carried out on the selected key targets by using DAVID data.Finally，the effective active ingredients and key targets of drugs were verified by molecular docking with AutoDock Vina software and Pymol software.Results：A total of 51 main active components of Xihuang Pills were screened，including quercetin，β-sitosterol，etc.Among them，there were 178 targets acting on NSCLC，and the key targets were MAPK1，JUN，AKT1，TP53，RELA，etc.GO and KEGG analysis showed that the mechanism of Xihuang Pills in treating NSCLC involved many biological processes and PI3K-Akt signal pathway，MAPK signal pathway，TNF signal pathway and other signal transduction pathways.The active ingredients of medicine had good docking activity with key targets.Conclusion：Network pharmacological analysis shows that Xihuang Pills is a multi-component，multi-target，multi-channel synergistic effect in the treatment of NSCLC，which provides sufficient theoretical basis for subsequent related experiments.

Keywords Xihuang Pills; NSCLC;Network pharmacology; Molecular docking; Mechanism research

中圖分類號：R285文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.24.001

肺癌是最常見的癌癥，組織學(xué)類型中80%為非小細(xì)胞肺癌（Non-small Cell Lung Carcinoma，NSCLC）[1]，大部分患者就診時已經(jīng)處于中晚期，錯過最佳治療時期，預(yù)后極差。很多現(xiàn)代研究證明中醫(yī)藥能夠有效減輕癌癥患者的臨床癥狀，提高生命質(zhì)量，減少治療帶來的不良反應(yīng)，更好地幫助NSCLC患者實現(xiàn)“帶瘤生存”[2]。

西黃丸由清代名醫(yī)王洪緒所創(chuàng)，首載于《外科證治全生集》，由牛黃、麝香、乳香、沒藥組成，具有清熱解毒、活血祛瘀、化痰消堅、解毒散癰等功效?，F(xiàn)在西黃丸常應(yīng)用于肺癌、乳腺癌、胃癌、腸癌等多種惡性腫瘤的輔助治療?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，西黃丸具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移、促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡、抑制血管生成、調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境等作用[3-6]。其中，牛黃能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)其凋亡[7-8]。麝香可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，逆轉(zhuǎn)化療藥物的多藥耐藥[9-10]。乳香、沒藥能夠通過抑制細(xì)胞增殖來發(fā)揮強(qiáng)大的抗腫瘤作用等[11]。但西黃丸具體抗NSCLC的機(jī)制尚不明確。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，推測西黃丸防治NSCLC的有效活性成分、作用靶點及參與調(diào)控的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等，闡釋西黃丸抗NSCLC的作用機(jī)制，為后續(xù)相關(guān)研究提供更充分的科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 西黃丸活性成分的搜索與篩選 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）和中藥分子機(jī)制的生物信息學(xué)分析工具（BATMAN-TCM，http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）分別檢索西黃丸中各藥味的化學(xué)成分。在TCMSP數(shù)據(jù)庫中，以口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%，類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18為篩選條件，獲得主要有效活性成分化合物。

1.2 西黃丸活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 在UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）將所有蛋白質(zhì)名稱轉(zhuǎn)換成基因名稱。通過Cytoscape 3.7.0軟件（https：//cytoscape.org/）構(gòu)建活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.3 NSCLC疾病靶點的篩選 以“Non-Small Cell Lung Cancer”為關(guān)鍵詞在GeneCards（人類基因數(shù)據(jù)庫，https：//www.genecards.org/）和OMIM數(shù)據(jù)庫（Online Mendelian Inheritance in Man，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim）中搜索非小細(xì)胞肺癌的相關(guān)基因，剔除重復(fù)基因。

1.4 西黃丸-NSCLC共同靶點篩選及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將西黃丸-NSCLC共同靶點導(dǎo)入STRING 11.0（https：//string-db.org/）數(shù)據(jù)庫，物種選擇“Homo Sapiens”，最低相互作用域值設(shè)為0.9（Highest Confidence），其他參數(shù)保持默認(rèn)數(shù)值，獲得靶點聯(lián)系網(wǎng)絡(luò)圖，將該圖進(jìn)一步導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。

1.5 基因本體（GO）功能富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 將西黃丸-NSCLC共同靶點以Gene Symbol的格式導(dǎo)入DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/），分別選擇生物過程（Biological Process，BP）、分子功能（Molecular Function，MF）和細(xì)胞組分（Cellular Component，CC）進(jìn)行基因本體（GO）富集分析，選擇KEGG進(jìn)行共同靶點基因通路富集分析。

1.6 “西黃丸-靶點-NSCLC-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 在KEGG富集分析中，選取與NSCLC相關(guān)性較強(qiáng)的通路，在Cytoscape 3.6.0軟件中構(gòu)建“西黃丸-靶點-NSCLC-通路”可視化網(wǎng)絡(luò)圖。

1.7 分子對接分析 根據(jù)西黃丸-靶點-NSCLC關(guān)系網(wǎng)中的Degree值，篩選5個關(guān)鍵靶點，從PubChem數(shù)據(jù)庫中確定活性成分的化合物名稱、分子量和2D結(jié)構(gòu)，然后在RCSB PDB數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/）中下載活性成分所對應(yīng)的3D結(jié)構(gòu)。然后利用AutoDock Vina軟件（http：//vina.scripps.edu/），準(zhǔn)備分子對接所需的配體和蛋白質(zhì)，對于目標(biāo)蛋白，其晶體結(jié)構(gòu)須預(yù)處理，包括去除水分子、加氫、修飾氨基酸、優(yōu)化能量和調(diào)整力場參數(shù)，之后滿足配體結(jié)構(gòu)的低能量構(gòu)象。最后將這5個關(guān)鍵靶點結(jié)構(gòu)與西黃丸的活性成分結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子對接，其Affinity（kcal/mol）值即代表二者結(jié)合的結(jié)合能力，結(jié)合能力越低，配體與受體結(jié)合越穩(wěn)定。最后，使用Pymol軟件分析和觀察對接結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 西黃丸活性成分及其靶點 檢索到西黃丸有效活性成分共51個，對應(yīng)的靶點共470個，經(jīng)篩選后，牛黃、麝香、乳香、沒藥有效成分分別為5、9、5、32個，靶點分別有5、30、10、153個。見表1。

2.2 西黃丸活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖 采用Cytoscape 3.7.0軟件構(gòu)建西黃丸活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，去除獨(dú)立節(jié)點后共有236個節(jié)點，517條邊。其中粉色節(jié)點代表靶點，黃色節(jié)點代表作用牛黃的活性成分，紫色節(jié)點代表麝香的活性成分，橙色節(jié)點代表乳香的活性成分，綠色節(jié)點代表沒藥的活性成分，邊代表節(jié)點間的相互作用關(guān)系。Degree值顯示活性成分中槲皮素（Degree=124），Β-谷甾醇（Degree=33），豆甾醇（Degree=26），雄甾酮（Degree=26），3α-羥基-5α-17-酮（Degree=26）等在西黃丸中發(fā)揮著主要作用。見圖1。

2.3 共同靶點及PPI網(wǎng)絡(luò) 在GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫中分別找到相關(guān)靶點4 911和468個，合并去重，將西黃丸靶點與NSCLS靶點進(jìn)行篩選得到506個相關(guān)靶點，將其導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，去除獨(dú)立節(jié)點，最終得到195個節(jié)點與732條交互關(guān)系。導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0制作可視化網(wǎng)絡(luò)圖，其中紅色和紫色節(jié)點由Degree值的中位值分開，顏色越深，Degree值越大，其Degree值前5位分別為MAPK1、JUN、AKT1、TP53、RELA。見圖2～4，表2。

2.4 分子對接 以2.3中得到的5個關(guān)鍵靶點為配體，以西黃丸51種活性成分為受體，通過AutoDock Vina軟件進(jìn)行分子對接，驗證活性成分與靶點作用位點結(jié)合力的強(qiáng)弱。通過篩選，得出5個關(guān)鍵靶點與西黃丸中活性成分結(jié)合能力較強(qiáng)，選取最低結(jié)合自由能組合，使用Pymol軟件進(jìn)行繪圖。見圖5～6。

2.5 GO分析和KEGG通路富集分析 使用DAVID數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路富集分析，其中GO分析中生物學(xué)行為主要富集在RNA轉(zhuǎn)錄和信號轉(zhuǎn)導(dǎo);細(xì)胞組分富集在細(xì)胞核和質(zhì)膜;分子功能富集在蛋白質(zhì)結(jié)合和酶結(jié)合。KEGG富集分析顯示西黃丸通過多條信號通路治療NSCLC，涉及的富集通路有：癌癥蛋白聚糖、PI3K-AKT信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路、NSCLC信號通路、鉑類耐藥相關(guān)通路等。選取前50個富集通路中的NSCLC信號通路、TNF信號通路、PI3K-AKT信號通路、MAPK信號通路，構(gòu)建“西黃丸-靶點-NSCLC-通路”網(wǎng)絡(luò)，其中綠色為共同靶點，黃色為通路，粉色為活性成分，紫色為藥物名稱，橙色為疾病名稱。見圖8～9。

3 討論

本研究通過構(gòu)建活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，得知西黃丸關(guān)鍵活性成分有槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、雄甾酮、3α-羥基-5α-17-酮等?，F(xiàn)代研究表明槲皮素能夠通過抑制Src基因，下調(diào)Fn14/NF-kappaB信號通路的表達(dá)，最終抑制NSCLC的增殖和轉(zhuǎn)移，發(fā)揮抗NSCLC作用[12];通過調(diào)節(jié)miR-16-5p/WEE1軸增強(qiáng)NSCLC對放療的敏感性[13];通過下調(diào)IL-6/STAT-3信號的表達(dá)，促進(jìn)誘導(dǎo)NSCLC A549細(xì)胞系凋亡[14];通過抑制snail依賴性AKT的激活和非snail依賴性ADAM9的表達(dá)抑制NSCLC的遷移能力[15]。這些研究不僅為抑制NSCLC轉(zhuǎn)移提供了新的見解，也提示槲皮素在治療轉(zhuǎn)移性NSCLC中具有潛在的應(yīng)用價值。β-谷甾醇不僅可以有效誘導(dǎo)口腔鱗狀細(xì)胞癌SCC9細(xì)胞凋亡，對H22荷瘤小鼠具有一定的抑瘤作用，還能夠有效提高NK細(xì)胞對胰腺癌SW-1990細(xì)胞的殺傷力[16-18]。且Wang等[19]研究表明，β-谷甾醇聯(lián)合BAMBI過表達(dá)，可以誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞G0/G1細(xì)胞周期阻滯，抑制細(xì)胞增殖。豆甾醇則不僅可以通過抑制Nrf2信號通路增強(qiáng)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞對化療敏感性，還能夠誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡，抑制胃癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移遷移[20-22]。因此，西黃丸能夠通過相關(guān)通路抑制腫瘤細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)凋亡。

通過分析西黃丸-NSCLC靶點互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖得知，西黃丸治療NSCLC的潛在靶點主要有MAPK1（絲裂原活化蛋白激酶1）、JUN（轉(zhuǎn)錄因子AP-1）、AKT1（蛋白激酶1）、TP53（腫瘤壞死蛋白53）、RELA（轉(zhuǎn)錄因子P65）等。MAPK是絲氨酸/蘇氨酸激酶構(gòu)成的蛋白激酶，處于許多分子信號網(wǎng)絡(luò)的核心，調(diào)控著細(xì)胞的增殖、分化及轉(zhuǎn)錄表達(dá)等[23]。研究表明MAPK1的轉(zhuǎn)錄及翻譯的表達(dá)量在NSCLC組織中較正常肺組織明顯升高[24]。且MAPK1/ERK2通路在肺癌形成早期就已被激活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，可見MAPK1是腫瘤早期防治的潛在重要靶點[25]。原癌基因JUN和FOS被磷酸化激活后，以JUN和FOS異源二聚體或JUN同源二聚體的形式結(jié)合到轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白AP-1啟動子結(jié)合位點，參與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，促進(jìn)肺癌發(fā)生發(fā)展[26]。有體內(nèi)實驗研究顯示，在致癌物誘導(dǎo)的小鼠肺癌發(fā)生模型中，肺上皮細(xì)胞選擇性表達(dá)TAM67顯性陰性突變體能夠抑制AP-1的活性，進(jìn)而有效抑制由化學(xué)致癌物誘導(dǎo)的肺癌發(fā)生，AP-1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是介導(dǎo)小鼠肺癌發(fā)生的重要機(jī)制[27]。AKT是PI3K下游的關(guān)鍵分子，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、代謝、凋亡，可被各種致癌驅(qū)動因素（如EGFR和KRAS突變）不當(dāng)激活，對腫瘤細(xì)胞的生長和成活至關(guān)重要[28-29]。AKT1是AKT激酶家族的一員，研究顯示AKT1不僅能夠促進(jìn)K-RAS或EGFR突變的NSCLC細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，還可以提高NSCLC細(xì)胞對化療藥物的敏感性[30-31]。TP53，又稱P53基因，是一種著名的腫瘤抑制基因，可引發(fā)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖，然而50%的人類癌癥中存在著P53突變，突變會導(dǎo)致TP53因構(gòu)象變化而產(chǎn)生致癌轉(zhuǎn)化，使細(xì)胞生長、凋亡和DNA修復(fù)的規(guī)律被打亂，導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[32-34]。野生型TP53和變異型TP53的預(yù)計生存期分別是27個月和19個月，TP53突變是NSCLC的負(fù)預(yù)后因子，不同變異外向具有不同的預(yù)后值，可以輔助我們更好地判斷NSCLC患者的預(yù)后[35]。RELA是NF-κB轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的一種亞型，能夠靶向促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、生存、轉(zhuǎn)移、侵襲、血管生成、抗化療及放射治療[36]。

本研究GO富集分析顯示，西黃丸治療NSCLC的生物功能主要定位在RNA轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控及對藥物的反應(yīng)等;參與了蛋白質(zhì)結(jié)合和酶結(jié)合等分子功能;KEGG富集分析顯示，西黃丸治療NSCL涉及了多條信號通路，包括PI3K-AKT信號通路、MAPK信號通路、TNF信號通路、癌癥相關(guān)信號通路等。PI3K-AKT信號通路調(diào)控著細(xì)胞生長、代謝和凋亡，在癌癥中常常被激活，PIK3CA突變率為3.7%[37]。目前在SCLC細(xì)胞系中并未發(fā)現(xiàn)PIK3CA突變，但在NSCLC中PIK3CA突變率日益增加，尤其是鱗狀細(xì)胞癌，因此瞄準(zhǔn)PI3K-AKT通路是鱗狀細(xì)胞肺癌的潛在治療選擇[38]。TNF信號通路不僅能夠誘導(dǎo)NSCLC的發(fā)生，還能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和淋巴轉(zhuǎn)移[39-40]。還有研究證明，MAPK信號通路可以通過調(diào)節(jié)肺腺癌PD-L1，改善腫瘤微環(huán)境[41]。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選分析西黃丸和NSCLC的相關(guān)靶點，構(gòu)建活性藥物-靶點-疾病互作網(wǎng)絡(luò)圖，實現(xiàn)活性成分和關(guān)鍵靶點的分子對接，結(jié)果顯示活性成分和關(guān)鍵靶點對接良好，進(jìn)而初步推測西黃丸發(fā)揮作用的主要活性成分是槲皮素，β-谷甾醇，豆甾醇等;潛在治療靶點是MAPK1、JUN、AKT1、TP53等;涉及PI3K-AKT信號通路、MAPK信號通路等多條信號通路，體現(xiàn)西黃丸治療NSCLC多成分、多靶點、多通路協(xié)同作用的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)機(jī)制，為西黃丸的后續(xù)實驗研究提供了更多的理論依據(jù)。

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（2020-12-29收稿 責(zé)任編輯：魏慶雙）