蔣鋒利 黃茂 蔡松 任士杰 孫文麗 張晶 趙明鏡 張立山

摘要 目的：基于“IPF患者存在肺絡干血”假說，觀察大黃蟲丸含藥血清對TGF-β1誘導后A549細胞上皮-間充質轉化（EMT）及Smad3，Collagen Ⅲ表達的影響，探討其防治特發(fā)性肺纖維化（IPF）的作用機制。方法：正常培養(yǎng)并取對數(shù)生長期A549細胞，TGF-β1對其誘導48 h，電子顯微鏡下觀察A549細胞的形態(tài)學變化;選擇吡非尼酮（PFD）為陽性對照藥，RT-PCR法檢測EMT相關基因及Smad3 mRNA的表達;Western Blottingting法檢測Smad3，p-Smad3，Collagen Ⅲ蛋白表達。結果：成功獲取發(fā)生EMT的A549細胞;以α-SMA mRNA表達情況判斷EMT程度由高到低依次為：模型組（M），大黃蟲丸含藥血清大劑量組（D），西藥組（P），大黃蟲丸含藥血清中劑量組（Z），大黃蟲丸含藥血清小劑量組（X），空白對照組（K）;與M組比較，Z組，X組，P組中Collagen Ⅲ表達不同程度降低（P<0.05），且其在Z組與K組中表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;與M組及K組比較，各觀察組Smad3表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），但對其基因及磷酸化，即Smad3 mRNA及p-Smad3的表達有影響，且與M組比較，Z組，X組，P組中均不同程度降低（P<0.05），D組中表達雖低于M組，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結論：大黃蟲丸對TGF-β1誘導后A549細胞發(fā)生EMT程度與Smad3 mRNA及Collagen Ⅲ的表達有影響，推測大黃蟲丸對IPF的保護機制可能與不同程度阻斷或逆轉了TGF-β1/Smad3介導的EMT有關。

關鍵詞 大黃蟲丸;肺絡干血;特發(fā)性肺纖維化;含藥血清;上皮細胞-間充質轉化;轉化生長因子-β1;α-平滑肌肌動蛋白;Ⅲ型膠原蛋白

Abstract Objective：To observe the effects of Dahuang Zhechong Pills-containing serum on EMT and the expression of Smad3 and Collagen Ⅲ Protein in A549 cells after TGF-β1 induction based on the hypothesis of “the presence of pulmonary collateral hard blood in IPF patients”，and to explore its role in the prevention and treatment of idiopathic pulmonary fibrosis mechanism.Methods：Normally we grew and took A549 cells in logarithmic growth phase，TGF-β1 intervened for 48 h，observed the morphological changes of A549 cells under electron microscope; choosed pirfenidone as a positive control drug，RT-PCR method to detect the expression of EMT related genes and Smad3 mRNA; Western Blotting was used to detect the expression of Smad3，p-smad3，Collagen Ⅲ protein.Results：The A549 cells with EMT were successfully obtained; the degree of EMT was determined from α-SMA mRNA expression in order from high to low：model group（M），large-dose group of Dahuang Zhechong Pills containing serum（D），Western medicine group（P），middle-dose group of Dahuang Zhechong Pills containing serum（Z），little-dose group of Dahuang Zhechong Pills containing serum（X），blank control group（K）; Compared with M，the expression of Collagen Ⅲ in Z，X，and P decreased to varying degrees（P<0.05），and there was no difference in the expression of Z and K（P>0.05）; compared with M and K，there was no difference in the expression of Smad3 in each experimental group（P>0.05），but it had an effect on the expression of its genes and phosphorylation，that is，the expression of Smad3 mRNA and p-smad3.All of them decreased in different degrees（P<0.05）.Although the expression in D was lower than M，it was not statistically significant（P>0.05）.Conclusion：Dahuang Zhechong Pills has the effect on EMT and the expression of Smad3 mRNA and Collagen Ⅲ in A549 cells after TGF-β1 induction.It is speculated that the protective mechanism of Dahuang Zhechong Pills on IPF may be related to the blocking or reversal of EMT mediated by TGF-β/Smad3 to varying degrees.

Keywords Dahuang Zhechong Pills; Pulmonary collateral hard blood; IPF; Drug-containing serum; EMT; TGF-β1; α-SMA; Collagen Ⅲ

中圖分類號：R289.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.24.007

特發(fā)性肺纖維化（Idiopathic Pulmonary Fibrosis，IPF）是一種原因不明，慢性進展，致死性間質性肺病，隸屬中醫(yī)“肺痿”“肺痹”范疇，亦有醫(yī)家將其歸為“喘證”，病性為本虛標實。該病以間充質細胞聚集體和能表達α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA），且能促進有絲分裂及細胞外基質（ECM）分泌增加的肌成纖維細胞構成的“成纖維細胞灶”為其病理特征[1]。武維屏，姜良鐸為代表的中醫(yī)肺病專家提出“肺系絡病”理論，將其病機概括為“氣虛血瘀，痰熱互結，痹阻肺絡”[2-3]?；谝陨险J識，我們提出“IPF患者存在肺絡干血”的假說，認為“肺絡干血是肺纖維化病因，細胞外基質沉積是干血實質”[4]。針對“干血”一證，張仲景治以“緩中補虛”之大黃蟲丸，尤在涇將本方治法概括為“潤以濡其干，蟲以動其瘀，通以去其閉”，實為仲景治療“干血”的三大法門。

前期實驗中，我們證實大黃蟲丸對博來霉素致IPF大鼠的保護作用可能通過抑制MMP-2的產(chǎn)生來實現(xiàn)[5]。本實驗通過制備不同濃度大黃蟲丸含藥血清，正常培養(yǎng)并取對數(shù)生長期A549細胞進行實驗，TGF-β1（5 ng/mL）對其誘導48 h，電子顯微鏡下觀察A549細胞的形態(tài)學變化;選擇吡非尼酮作為陽性對照藥，RT-PCR法檢測EMT相關基因及Smad3 mRNA的表達;Western Blotting法檢測Smad3，p-Smad3，Collagen Ⅲ蛋白表達，以期探索大黃蟲丸對IPF防治作用的更多內(nèi)在機制，進一步豐富捜剔肺絡法防治IPF的學術內(nèi)涵。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與細胞 選取健康SD雄性大鼠60只，體質量250～300 g。由北京維通利華試驗動物技術有限公司提供，SPF/VAF級，許可證號：SCXK（京）2016-0006。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境，濕度為5%～10%，溫度（22±2）℃，12 h/12 h光照/暗循環(huán)，可以自由獲取食物和飲水。本實驗通過北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院倫理委員會審批（倫理審批號：19-34）。

人肺泡上皮A549細胞株（中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，北京）。

1.1.2 藥物 大黃蟲丸（北京同仁堂，國藥準字：Z11020002，批號：17013170）;注射用鹽酸博來霉素（杭州瀚暉制藥有限公司，國藥準字：H20055883，批號：19033911）;吡非尼酮膠囊（北京康蒂尼藥業(yè)，國藥準字：H20133376，批號：190505）。

1.1.3 試劑與儀器 總RNA提取試劑盒（北京基譜生物，貨號：GPQ1801），Smad3抗體（Abcam公司，美國，貨號：ab40854），p-Smad3抗體（CST公司，美國，貨號：9520），Ⅲ型膠原蛋白抗體（Proteintech公司，美國，貨號：22734-1-AP），Actin抗體（Abcam公司，美國，貨號：ab6276），山羊抗鼠IgG，HRP（Abcam公司，美國，貨號：ab6789）。二氧化碳培養(yǎng)箱（SANYO公司，日本，型號：MC0175），離心機（Eppendorf公司，德國，型號：Centrifuge 5415D），倒置顯微鏡（OLYMPUS公司，日本，型號：CKX41），熒光定量PCR儀（杭州博日科技，型號：9600Plus），分光光度計（Thermo scientific公司，美國，型號：GENESYSTM 50），溫控搖床（海門其林貝爾，型號：TS-2000A），電泳儀（北京凱元信瑞，型號：PP-1150）。

1.2 方法

1.2.1 大黃蟲丸含藥血清的制備及保存 SD大鼠適應性喂養(yǎng)3 d后，參照盧磊等[6]方法制備含藥血清。按人與動物等效劑量換算法，分別算得大黃蟲丸大，中，小及吡非尼酮的給藥劑量為1.8 g/（kg·d），0.9 g/（kg·d），0.45 g/（kg·d）及0.18 g/（kg·d），以上劑量分別各給10只SD大鼠灌服，1次/d，持續(xù)7 d。末次給藥1 h后，3%戊巴比妥鈉（0.15 mL/100 g）腹腔內(nèi)麻醉，無菌條件腹主動脈取血，冰上靜置2 h，4 ℃，3 000 r/min（離心半徑13.5 cm）離心15 min取上清液，分裝并標記，56 ℃滅活30 min，-80 ℃快速凍固保存，待用。剩余20只SD大鼠灌以等量等滲鹽水，以同樣方法制備空白血清并保存，待用。

1.2.2 實驗分組與造模 實驗分為空白對照組（K組），模型組（M組），西藥組（P組），模型+大黃蟲丸含藥血清大劑量組（D組），模型+大黃蟲丸含藥血清中劑量組（Z），模型+大黃蟲丸含藥血清小劑量組（X組）。參照Hidenori Kasai等的方法復制IPF細胞模型[7]。收集對數(shù)生長期A549細胞，調整細胞懸液濃度至5×104/mL，每孔2.5 mL接種于6孔板，2組均設3個復孔，37 ℃，5%CO2條件下，培養(yǎng)24 h。換液，均加入無血清DMEM/F-12培養(yǎng)基2.5 mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。換液，K組每孔加入2.5 mL培養(yǎng)基，其余各組每孔加入2.5 mL相應含TGF-β1（5 ng/mL）及藥物血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，倒置顯微鏡下觀察并拍照。見圖1。結合2.2中，M組與K組比較，E-cadherin mRNA表達顯著降低（P<0.01），間充質標志α-SMA mRNA表達顯著升高（P<0.01），表明IPF細胞模型成功[8]。

1.2.3 RT-PCR法檢測EMT及Smad3相關基因表達 不同濃度大黃蟲丸含藥血清對TGF-β1誘導48 h后A549細胞表達上皮性鈣黏蛋白（E-cadherin）mRNA，α-SMA mRNA，Smad3 mRNA情況的影響。獲取1.2.2中各觀察組細胞，按總RNA提取試劑盒（DNaseⅠ）試劑盒說明提取細胞樣本中總RNA并定量，1%瓊脂糖凝膠進行電泳，檢測RNA的完整性。按mRNA cDNA合成試劑盒說明逆轉錄合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。按mRNA/lncRNA qPCR試劑盒說明進行擴增，反應程序為95 ℃ 30 s，（95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s）×45個循環(huán)，同時在60～95 ℃進行融解曲線分析，采用2-△△Ct法進行數(shù)據(jù)的相對表達強度分析，所有樣本均設3個重復。引物設計由北京基譜生物科技有限公司完成。見表1。

1.2.4 Western Blotting法檢測Smad3，p-Smad3，Collagen Ⅲ蛋白表達

Western Blotting法檢測不同濃度大黃蟲丸含藥血清對TGF-β1誘導48 h后A549細胞表達Smad3，p-Smad3，Collagen Ⅲ蛋白情況的影響。重復1.2.2實驗分組及細胞培養(yǎng)過程，獲取TGF-β1誘導48 h后A549細胞。按蛋白質提取試劑盒（北京基譜生物，貨號：GPP1815）說明進行蛋白提取，BCA法蛋白定量，依照電泳上樣量需要用SDS-PAGE上樣緩沖液（5×）調整蛋白濃度，100 ℃煮沸變性10 min備用。配制12%的分離膠，5%濃縮膠。算得待檢測蛋白樣品上樣量60 μg，濃縮膠恒壓80 V，約20 min;分離膠恒壓120 V，電泳至溴酚藍到凝膠底部。2 h恒流300 mA轉膜至PVDF膜，5%BSA室溫封閉1 h。將PVDF膜置于雜交袋中，分別加入配制好的一抗4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，10 min/次，加入相應二抗，室溫孵育1 h。TBST洗膜3次，10 min/次。按ECL Plus Western Blotting Kit試劑盒說明暗室中曝光，顯影并定影。

條帶灰度值采用Quantity One v.4.6.2軟件進行讀取，除以內(nèi)參Actin灰度值，即得樣品中目標蛋白的相對表達量，所有樣本均設3個重復。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，各組間差異用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 M組和K組組織學結果

M組中A549細胞經(jīng)TGF-β1誘導48 h，形態(tài)逐漸由鵝卵石狀變?yōu)樯扉L的紡錘形或梭形，細胞圓形度降低，與成纖維細胞，肌纖維母細胞形態(tài)相似。見圖1。

2.3 各組Smad3，p-Smad3，Collagen Ⅲ蛋白表達 ? 與K組比較，M組中Collagen Ⅲ、Smad3和p-Smad3的表達較K組顯著增加（P<0.01），說明TGF-β1誘導48 h后的A549細胞核轉錄過程十分活躍。PFD處理后，與M組比較，P中Collagen Ⅲ、Smad3和p-Smad3的表達顯著降低（P<0.05）。同樣的，在D組、Z組和X組中也觀察到這種現(xiàn)象。當劑量為0.45 g/（kg·d）時，則顯示出較好的治療效果。見圖2，表3。

3 討論

轉化生長因子-β（TGF-β）是一種多功能細胞因子，具有促進細胞增殖，分化，凋亡及ECM形成等生物活性，被認為是誘導包括肺在內(nèi)諸多臟器纖維化的“主開關”[9]。肺損傷的患者和動物的肺纖維化中已發(fā)現(xiàn)TGF-β1過表達[10-11]，且TGF-β1作為上皮-間充質轉化（Epithelial-mesenchymal Transition，EMT）誘導劑在包括肝臟，腎近端小管，晶體等上皮細胞中已被證實[12]。在IPF進展中，肺泡及氣道上皮中均發(fā)現(xiàn)存在EMT，其中肺泡上皮細胞（AEC）是肺纖維化的主要致病介質[13]。α-SMA表達說明成纖維細胞分化為成肌纖維細胞，是ECM信號的來源，且這一過程促進了肺損傷的發(fā)展[14]。另外，α-SMA，I型膠原，Ⅲ型膠原，纖連蛋白及波形蛋白消融可減輕小鼠肺組織樣本中的纖維化[15]。Smads是TGF-β超家族細胞內(nèi)重要的信號轉導和調節(jié)分子，該信號通路與人類諸多疾病的發(fā)生密切相關[16]。除Smads介導的細胞核轉錄外，TGF-β還可以激活包括促分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）途徑，Rho樣GTPase信號轉導途徑及磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/AKT等多種信號途徑來促使臟器纖維化[17]。

前期研究中證實，EMT可以被多種中藥制劑阻斷或逆轉，表現(xiàn)出對IPF的保護。柴胡皂苷D可通過mTOR信號通路抑制A549細胞EMT，且呈明顯的劑量-時間依賴關系[18]。姜黃素通過Wnt3a/β-catenin信號通路抑制EMT，從而阻斷胃癌細胞（MKN45）的增殖，遷移及侵襲[19];姜黃素可逆轉缺氧誘導的肝癌細胞（HepG2）增殖和遷移能力增加，可能與其抑制缺氧誘導的HIF1-α蛋白上調和EMT有關[20]。黃芩苷通過TGF-β/Smads信號轉導途徑減輕因輻射誘導Ⅱ型AEC發(fā)生的EMT[21]。穿心蓮內(nèi)酯通過TGF-β1介導的Smads依賴性和非依賴性途徑抑制T細胞的增殖和成纖維細胞分化，從而改善了博萊霉素誘導的肺纖維化[22]。槲皮素通過增加E-cadherin表達，降低神經(jīng)性鈣黏蛋白（N-cadherin），波形蛋白（Vimentin）表達，使得TGF-β1誘導的肝癌細胞（SMMC-7721）EMT得到明顯抑制[23]。白藜蘆醇通過阻斷TGF-β1/Smad3信號通路轉導，抑制了TGF-β1誘導的人肺上皮細胞A549的增殖及上皮間質轉化[24]。人參皂苷Rg1可能通過抑制EMT來改善COPD大鼠小氣道纖維化[25]。黃芪甲苷可通過AKT/β-catenin信號通路抑制TGF-β1誘導的人腹膜間皮細胞（HMrSV5）EMT程度[26]。大黃素通過抑制TGF-β1/ADAMTS-1信號抑制肺成纖維細胞增殖及其EMT，并減少Ⅰ/Ⅲ型膠原合成[27]。

本研究中，E-cadherin mRNA表達降低與α-SMA mRNA表達升高為發(fā)生EMT的標志。如結果所示，α-SMA mRNA表達由高到低依次為：M組，D組，P組，Z組，X組，K組。與M組比較，除D組外其余組，作為間充質細胞標志α-SMA mRNA表達均顯著降低（P<0.01），提示中小劑量大黃蟲丸可顯著改善TGF-β1誘導48 h后A549細胞EMT程度，且效果上X組優(yōu)于P組（P>0.05）。作為衡量IPF程度的重要指標，亦是ECM重要成分的Collagen Ⅲ表達由高到低依次為：M組，D組，P組，Z組，X組，K組。本研究結果還提示大黃蟲丸可不同程度抑制TGF-β1誘導48 h后A549細胞表達Smad3 mRNA及p-Smad3，且大體上與劑量呈負相關，進而影響TGF-β1/Smad3信號通路介導的EMT程度，起到抗纖維化作用，且此過程可能受到其他與EMT相關信號通路的影響，尚需進一步研究證實。此外，與M組比較，D組中表達α-SMA mRNA，Collagen Ⅲ雖不同程度降低，但均無差異（P>0.05），且E-cadherin mRNA的表達甚至為各用藥組最低，即其抑制EMT效果最差。提示大黃蟲丸對IPF的保護作用可呈雙向性，劑量的選擇是主要影響因素。

綜上所述，TGF-β1/Smads信號通路在IPF的發(fā)生與進展中起重要作用，作為正向調節(jié)劑，磷酸化Smad3過表達可促進與TGF-β1信號密切相關的EMT發(fā)生。本研究結果表明，大黃蟲丸對TGF-β1誘導后A549細胞發(fā)生EMT程度與Smad3基因及磷酸化的表達有影響，推測大黃蟲丸對IPF的保護機制可能與不同程度阻斷或逆轉了TGF-β1/Smad3介導的EMT有關，為大黃蟲丸可作為IPF患者的潛在有效治療藥物提供了更多科學依據(jù)。

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（2020-06-16收稿 責任編輯：張雄杰）