安佳星，伍時華，黃嘉齊，曾令杰，黃錦翔，豐丕雪，易 弋

（1.廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西柳州 545006；2.廣西科技大學(xué)廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西柳州 545006；3.廣西科技大學(xué)廣西高校糖資源加工重點實驗室，廣西柳州 545006）

核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）提取和純化是分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)內(nèi)容，在進行體外反轉(zhuǎn)錄、RNA序列分析、基因克隆等研究時都需要完整性好、純度高的RNA。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作為重要的模式生物，也是最早被研究的生物之一[1]，它的RNA提取實際上是酵母菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜破裂后釋放出其中的營養(yǎng)物質(zhì)[2]，通過不同的方法去除細(xì)胞中的其他內(nèi)含物，如糖類、脂類和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，最后得到高質(zhì)量RNA的過程。然而釀酒酵母細(xì)胞壁呈甘露聚糖-蛋白質(zhì)-葡聚糖的三明治結(jié)構(gòu)[3-4]，成分復(fù)雜，細(xì)胞壁堅韌且厚[5]，如果破壁效果不佳，胞內(nèi)產(chǎn)物就不能完全釋放，從而干擾RNA的提取。細(xì)胞壁的破碎方法有很多[6-9]，按是否存在外加作用力，分為兩種：機械法[10-12]（超聲破碎法、磁珠法、高壓均質(zhì)化法等）和非機械法[13-15]（酶解法[16]、反復(fù)凍融法、自溶法、堿法等），無論哪種方法，都有自身的局限性和不足。目前人們用酶法對酵母細(xì)胞壁優(yōu)化條件的研究很多，但用酶法提取酵母總RNA最優(yōu)條件的選擇還在探索之中。商安全等[17]選用改良TRIzol試劑破壁法及溶菌酶破壁法提取白假絲酵母菌的總RNA，結(jié)果顯示改良TRIzol試劑破壁法提取獲得的白假絲酵母菌總RNA濃度及純度均顯著高于溶壁酶（lyticase）破壁法（P＜0.05）。張金桃等[18]通過加入2.5%蝸牛酶并伴隨超聲波混合處理4 h，以去除酵母菌細(xì)胞壁。許甘霏等[19]使用TRIzol試劑裂解聯(lián)用研磨珠破碎法、單酶酶解法、雙酶酶解法、液氮研磨法4種細(xì)胞壁破碎方法提取表皮葡萄球菌總RNA，結(jié)果顯示雙酶酶解法和液氮研磨法提取的總RNA完整性好，質(zhì)量高。

雖然有研究利用酵母破壁酶和蝸牛酶輔助破壁來提高RNA的提取效率[20-21]，尚鮮見將兩者放在同一體系下進行比較。本研究采用酵母破壁酶和蝸牛酶輔助破壁，并對這兩種酶在不同提取溫度、提取時間、加酶量進行優(yōu)化，再利用TRIzol試劑法提取總RNA，通過對提取的總RNA進行濃度和純度分析，比較酶處理條件對酵母菌總RNA提取的影響，為酵母菌總RNA的提取提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）GGSF16：廣西科技大學(xué)發(fā)酵工程研究所。

1.1.2 試劑

蝸牛酶（破壁率90%），酵母破壁酶溶液：北京索萊寶科技有限公司；TRIzol試劑：賽默飛世爾科技公司；焦炭酸二乙酯（分析純）：上海吉至生化科技有限公司；β-巰基乙醇（分析純）：上海索萊寶生物科技有限公司；山梨醇（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.1.3 培養(yǎng)基及試劑配方

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，115 ℃滅菌20 min。

0.1%焦炭酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）處理水：取1 mL DEPC溶液，用超純水定容至1 L，處于振蕩狀態(tài)下過夜放置，121 ℃滅菌40 min。

1 mol/L山梨醇緩沖液：取1.8217 g山梨醇溶于10 mL 0.1%DEPC處理水中，用0.45 nm的濾膜進行過濾。

蝸牛酶溶液的配制：取相應(yīng)質(zhì)量的蝸牛酶溶于1 mL 1 mol/L山梨醇溶液中。

1.2 儀器與設(shè)備

H2100R低溫高速離心機：湖南湘儀離心機儀器有限公司；HH系列數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市科析儀器有限公司；B-500超微量分光光度計：上海元析儀器有限公司；JY02S紫外分析儀：北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；ZWYR-C2402C疊式恒溫調(diào)速搖床：上海智誠分析儀器制造有限公司；DYY-6D電泳儀：北京市六一儀器廠；BHC-1300 IIA2生物安全柜：阿爾泰實驗室設(shè)備（北京）有限公司；LDZH-100KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 實驗器材預(yù)處理

在本次實驗中，所有實驗器材均用含有0.1%DEPC水過夜浸泡，121 ℃滅菌40 min。在整個實驗操作中始終佩戴一次性手套，并及時更換，以避免RNA污染。

1.3.2 釀酒酵母的種子液活化及生長曲線繪制

從YPD平板上挑取釀酒酵母GGSF16單菌落到Y(jié)PD培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min培養(yǎng)10 h，按10%接種量接種至YPD培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min繼續(xù)培養(yǎng)至OD600nm值為1.0，此為酵母菌菌懸液。

1.3.3 酶處理條件優(yōu)化

取750μL酵母菌菌懸液，12 000 r/min、4 ℃條件下離心2 min，棄去上清液，保留菌體。

（1）提取溫度

①酵母破壁酶：向菌體中加入25 μL酵母破壁酶，470 μL山梨醇緩沖液，5 μLβ-巰基乙醇，用移液槍輕輕吹打均勻后，分別置于27 ℃、30 ℃、33 ℃、37 ℃恒溫水浴鍋中處理45 min，期間每隔15 min上下顛倒混勻。

②蝸牛酶：向菌體中加入250μL30mg/mL蝸牛酶，2.5μLβ-巰基乙醇，用移液槍輕輕吹打均勻后，分別置于33 ℃、37 ℃、40 ℃、43 ℃恒溫水浴鍋中處理1 h，期間每隔15 min上下顛倒混勻。

（2）提取時間

①酵母破壁酶：向菌體中加入25 μL酵母破壁酶，470 μL山梨醇緩沖液，5 μLβ-巰基乙醇，用移液槍輕輕吹打混勻，選取酵母破壁酶的最適提取溫度，置于恒溫水浴鍋中分別處理15 min、30 min、45 min、60 min、75 min，期間每隔15 min上下顛倒混勻。

②蝸牛酶：向菌體中加入250 μL 蝸牛酶，2.5 μLβ-巰基乙醇，用移液槍輕輕吹打混勻，選取蝸牛酶的最適提取溫度，置于恒溫水浴鍋中分別處理30 min、45 min、60 min、75 min、90 min，期間每隔15 min上下顛倒混勻。

（3）加酶量

①酵母破壁酶：向菌體中分別加入0、12.5 μL、25.0 μL、37.5 μL酵母破壁酶，對應(yīng)加入495 μL、482.5 μL、470.0 μL、457.5 μL山梨醇緩沖液，再各加5 μLβ-巰基乙醇，選取酵母破壁酶最適提取溫度及最適提取時間。

②蝸牛酶：向菌體中分別加入250μL10mg/mL、20mg/mL、30 mg/mL、40 mg/mL蝸牛酶，再加2.5 μLβ-巰基乙醇，選取蝸牛酶最適提取溫度及最適提取時間。

1.3.4 RNA提取

分別向酵母破壁酶及蝸牛酶處理后的樣品中加入750μL TRIzol試劑，按商品提供的說明書抽提總RNA。

1.3.5 分析檢測

（1）總RNA濃度及純度檢測

利用超微量分光光度計測定總RNA溶液的質(zhì)量濃度及在波長260 nm、280 nm處的吸光度值，以A260nm/A280nm（評估蛋白質(zhì)污染），A260nm/A230nm（評估有機溶劑殘留）的大小判斷RNA樣品的純度。

（2）總RNA完整性檢測

取1 μL提取得到的RNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳（180 V、10 min），用紫外分析儀觀察RNA濃度及降解情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母GGSF16生長曲線

為探究釀酒酵母GGSF16的生長情況，選取最佳的接種時間，使用分光光度計測定樣品在波長600 nm處的吸光度值，結(jié)果見圖1。

圖1 釀酒酵母GGSF16的生長曲線Fig.1 Growth curve of Saccharomyces cerevisiae GGSF16

由圖1可以看出，釀酒酵母GGSF16在6～16 h處于對數(shù)生長期，選取10 h的菌體進行擴大培養(yǎng)。

2.2 不同提取溫度對酵母總RNA提取的影響

取750 μL釀酒酵母培養(yǎng)液，按1.3.3所述的方法分別提取酵母總RNA，并進行濃度、純度和電泳分析，結(jié)果分別見表1和圖2。

表1 不同提取溫度獲得的RNA濃度和純度Table 1 RNA concentration and purity obtained at different extraction temperature

酵母破壁酶是蝸牛酶、纖維素酶等多種酶的混合酶。根據(jù)酵母破壁酶的說明書，建議在不超過5×107的酵母培養(yǎng)物離心后加入25 μL酵母破壁酶，30 ℃處理1～2 h，因此，設(shè)置酵母破壁酶的溫度為27～37 ℃。由圖2可以看出，泳道1，2，3均有兩條明顯的28S rRNA和18S rRNA條帶，但也伴有輕微的小片段RNA彌散帶，泳道4的兩條條帶幾乎不可見，RNA降解嚴(yán)重。綜合表1可以看出，用酵母破壁酶處理后提取的RNA質(zhì)量濃度較高，均在800 ng/μL以上，A260nm/A280nm均在2.0左右，說明蛋白質(zhì)或酚類物質(zhì)污染小，RNA的純度較高。根據(jù)核酸的質(zhì)量濃度，當(dāng)提取溫度為27 ℃時，核酸質(zhì)量濃度最高為1 526.128 ng/μL。綜合圖2和表1，酵母破壁酶的最適提取溫度為27 ℃。

圖2 不同提取溫度提取酵母總RNA電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of total RNA extracted from yeast with different extraction temperature

蝸牛酶是蝸牛消化液中的一種混合酶制劑，主要含有纖維素酶、蛋白水解酶和果膠酶等二、三十種酶。根據(jù)蝸牛酶的說明書，建議每克細(xì)胞經(jīng)30～40 mg酶在37 ℃保溫1 h即可溶解酵母細(xì)胞壁，因此，設(shè)置蝸牛酶的處理溫度為33～43 ℃。由表1可以看出，蝸牛酶處理后的核酸濃度很高，在2 000 ng/μL左右，A260nm/A280nm在2.0以下，說明有蛋白質(zhì)污染，A260nm/A230nm在2.0范圍，說明幾乎沒有其他鹽類或雜質(zhì)的污染。綜合圖2的電泳圖可以看出，泳道5中RNA降解嚴(yán)重，僅能看到28S rRNA，泳道6可以看到較為清晰的28S rRNA和18S rRNA條帶，但也出現(xiàn)了降解現(xiàn)象，泳道7，8僅出現(xiàn)了5S rRNA，說明溫度太高，RNA已經(jīng)完全降解。綜合圖2和表1，蝸牛酶的最適提取溫度為37 ℃。

2.3 不同提取時間對酵母總RNA提取的影響

取750 μL釀酒酵母培養(yǎng)液，按1.3.3所述的方法分別提取酵母總RNA，并進行濃度、純度和電泳分析，結(jié)果分別見表2和圖3。

根據(jù)酵母破壁酶說明書，酵母破壁酶的最佳溫育時間為1～2 h，而在預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)當(dāng)設(shè)置為45 min～2 h時，RNA濃度變化不大，但隨著時間的延長，RNA降解嚴(yán)重。因此，適當(dāng)調(diào)整溫育時間為15～75 min。從表2可以看出，經(jīng)酵母破壁酶處理后，不同酶處理時間下提取的RNA濃度均很高，在1 500 ng/μL以上，A260nm/A280nm和A260nm/A230nm均在2.0左右，說明基本無蛋白質(zhì)或其他鹽類等雜質(zhì)污染。綜合圖2，泳道1，2，3均有亮度較高，條帶較好的28S rRNA和18S rRNA條帶，而泳道4，5可能由于酶處理時間太長，RNA降解，從而導(dǎo)致電泳圖中幾乎無條帶出現(xiàn)。由于延長酶處理時間可能會使RNA降解，綜合圖3和表2，當(dāng)酵母破壁酶處理15 min時RNA濃度和純度均很高，因此，酵母破壁酶的最適提取時間為15 min。

表2 不同提取時間獲得的RNA濃度和純度Table 2 RNA concentration and purity obtained with different extraction time

圖3 不同提取時間提取酵母總RNA電泳圖Fig.3 Electrophoretogram of total RNA extracted from yeast with different extraction time

根據(jù)蝸牛酶的說明書，蝸牛酶溫育1 h即可溶解酵母細(xì)胞壁，因此，設(shè)置蝸牛酶的溫育時間為30～90 min。由表2可以看出，蝸牛酶處理后的核酸濃度很高，當(dāng)提取時間＞45 min時，核酸質(zhì)量濃度在2 000 ng/μL以上，但A260nm/A280nm和A260nm/A230nm卻不理想，均在2.0以下，說明有蛋白質(zhì)或其他鹽類等雜質(zhì)污染，導(dǎo)致泳道7～10只有5S rRNA條帶。當(dāng)蝸牛酶的處理時間為30 min時，雖然核酸濃度相對較小，為1 108.209 ng/μL，但泳道6有28S rRNA和18S rRNA條帶，只不過條帶中伴隨有小片段RNA的彌散帶，可能是由于A260nm/A230nm在2.0以下，有其他裂解液雜質(zhì)的殘留造成的。綜合圖3和表2，蝸牛酶的最適提取時間為30 min。

2.4 不同加酶量對酵母總RNA提取的影響

取750 μL釀酒酵母培養(yǎng)液，按1.3.3所述的方法分別提取酵母總RNA，并進行濃度、純度和電泳分析，結(jié)果見表3和圖4。

表3 不同加酶量獲得的RNA濃度和純度Table 3 RNA concentration and purity obtained with different enzyme addition

圖4 不同加酶量提取酵母總RNA電泳圖Fig.4 Electrophoretogram of total RNA extracted from yeast with different enzyme addition

根據(jù)酵母破壁酶的說明書，建議在不超過5×107的酵母培養(yǎng)物離心后加入25 μL酵母破壁酶即可溶解酵母細(xì)胞壁，因此，設(shè)置酵母破壁酶的用量為0～37.5 μL。由圖4可以看出，泳道2，3，4有28S rRNA和18S rRNA兩條條帶，且泳道4的條帶相對較亮，綜合表3可以看出，隨著酵母破壁酶用量的增加，核酸的濃度也在不斷的增大，A260nm/A280nm基本在2.0左右，說明無蛋白質(zhì)或酚類物質(zhì)污染，而A260nm/A230nm除了酶用量在37.5 μL時為2.0左右，其他酶用量下均在2.0以下，說明只有酵母破壁酶用量在37.5 μL時，基本無其他裂解液雜質(zhì)的污染。綜合圖4和表3，酵母破壁酶的最適加酶量為37.5 μL。

根據(jù)蝸牛酶的說明書，建議每克細(xì)胞經(jīng)30～40 mg酶處理即可溶解酵母細(xì)胞壁，因此，設(shè)置蝸牛酶的用量為10～40mg/mL。由圖4的電泳圖可以看出，泳道5，6的兩條28SrRNA和18S rRNA條帶基本降解完全，泳道8只有5S rRNA條帶，提取效果不佳，而泳道7可以看出，有較為明顯的28S rRNA和18S rRNA條帶，綜合表3，當(dāng)蝸牛酶的用量為30 mg/mL時，核酸質(zhì)量濃度達到最大值為1 673.394 ng/μL，此時的A260nm/A280nm為1.99，說明RNA中基本無蛋白質(zhì)污染。因此，蝸牛酶的最適加酶量為30 mg/mL。

3 結(jié)論

在本次實驗中酵母破壁酶的最佳提取條件為加酶量37.5 μL，提取溫度27 ℃，提取時間15 min；蝸牛酶的最佳提取條件為加酶量30 mg/mL，提取溫度37 ℃，提取時間30 min。這次實驗表明利用酵母破壁酶輔助破壁可以提取到高質(zhì)量的酵母總RNA，而利用蝸牛酶輔助破壁只能提取到高濃度的RNA而并不能提取到高質(zhì)量的RNA，說明蝸牛酶可以較好的破除酵母細(xì)胞壁，但不適合利用蝸牛酶輔助破壁提取酵母總RNA，可能不同來源的蝸牛酶及其酶活力，操作過程中酶的添加順序等都會影響酵母總RNA的提取。