周常義 ，沈會(huì)玲，江 鋒，江曉穎，林偉言，彭愛(ài)紅，劉 玉，蘇國(guó)成

（1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建廈門 361021；2.廈門中集信檢測(cè)技術(shù)有限公司，福建廈門 361021）

發(fā)酵食品是人類長(zhǎng)期歷史進(jìn)程中，在一定自然環(huán)境條件下形成的具有獨(dú)特風(fēng)味、豐富營(yíng)養(yǎng)和良好保藏性的食品。通過(guò)發(fā)酵不僅可以改變食品的風(fēng)味，還可以提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，延長(zhǎng)保藏期。世界各地的傳統(tǒng)發(fā)酵制品分布廣泛，許多國(guó)家都具有各具特色的發(fā)酵制品，如中國(guó)的腐乳、醬油、魚(yú)露等，日本的納豆，韓國(guó)的泡菜以及歐美的干酪、酸奶等[1]。趙培城等[2]采用紹興腐乳毛霉對(duì)低值海產(chǎn)魚(yú)糜固態(tài)發(fā)酵，制成與豆腐乳形態(tài)相似口感細(xì)膩的魚(yú)糜腐乳；周緒霞等[3]對(duì)魚(yú)糜接種真菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵；LADISLAUS K[4]使用豆豉發(fā)酵劑發(fā)酵魚(yú)醬，發(fā)現(xiàn)魚(yú)醬的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和生物活性都有顯著提高；ANUPAM G等[5]利用曲霉發(fā)酵魚(yú)糜制作魚(yú)醬，并對(duì)魚(yú)醬發(fā)酵過(guò)程中抗氧化性、還原性的變化規(guī)律以及蛋白降解的規(guī)律進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在魚(yú)醬制作的過(guò)程中抗氧化性和還原性呈逐漸升高的趨勢(shì)，且大分子蛋白逐漸降解為小分子。目前世界各國(guó)的魚(yú)業(yè)生產(chǎn)都存在著經(jīng)濟(jì)魚(yú)類逐年減少，低值小雜魚(yú)產(chǎn)量逐年增多的問(wèn)題，因此如何加工利用低值小雜魚(yú)開(kāi)發(fā)新蛋白產(chǎn)品，已引起世界各國(guó)的重視。

本研究以魚(yú)糜制品為研究對(duì)象，借鑒傳統(tǒng)發(fā)酵食品的發(fā)酵工藝和原理，采用混合菌發(fā)酵魚(yú)腐乳，前期使用毛霉發(fā)酵，后期采用紅曲鹵汁發(fā)酵制作魚(yú)腐乳，研究魚(yú)腐乳在發(fā)酵的過(guò)程中游離氨基酸（free amino acid，F(xiàn)AA）及抗氧化活性的變化規(guī)律，旨在為開(kāi)發(fā)魚(yú)腐乳產(chǎn)品優(yōu)化風(fēng)味及穩(wěn)定產(chǎn)品品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

FA級(jí)冷凍魚(yú)糜：福建某水產(chǎn)開(kāi)發(fā)有限公司；總狀毛霉（Mucor recemosus）：百惠生物科技有限公司；紅曲霉（Monascus）F1：本實(shí)驗(yàn)室保存菌株。

17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品（分析純）：美國(guó)Sigma公司；水楊酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鹽酸、氫氧化鈉、過(guò)氧化氫、鄰苯二甲醛、芴甲氧羰酰氯、乙腈（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（分析純）：北京索萊寶公司；食鹽、淀粉、高粱酒均為食品級(jí)：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent100高效液相色譜儀：美國(guó)安捷倫公司；3-30 K冷凍離心機(jī)：德國(guó)SIGMA公司；FD-1-50真空冷凍干燥器：北京博醫(yī)康儀器公司；UV-2000紫外分光光度計(jì)：上海尤尼柯儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：北京國(guó)華科技集團(tuán)有限公司；PHX150生化培養(yǎng)箱：寧波萊福科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 魚(yú)腐乳的制作工藝及操作要點(diǎn)[6]

冷凍魚(yú)糜在4 ℃冰箱解凍后，空擂5 min，加入魚(yú)漿質(zhì)量3%的NaCl后再鹽擂10 min，加入淀粉，繼續(xù)擂潰10 min，加熱成型，冷卻后接種毛霉菌，27 ℃前發(fā)酵培養(yǎng)4 d，得到毛坯；撮毛后表面包裹10%食鹽，腌制1 d后置于經(jīng)過(guò)消毒的玻璃瓶?jī)?nèi)，將制備好的紅曲鹵，兌入玻璃瓶?jī)?nèi)，密封，后期發(fā)酵。

分別取前發(fā)酵期第0天、第2天、第4天，咸坯，后發(fā)酵期第7天、第14天、第21天、第28天的樣品進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2 游離氨基酸的測(cè)定

樣品前處理：稱取0.5 g樣品，加0.01 mol/L鹽酸，均質(zhì)1 min，靜置提取30 min，離心，取上清液定容至5 mL，過(guò)0.2 μm水系濾膜，上機(jī)分析。

檢測(cè)條件：參考張洵[7]的方法，采用在線柱前衍生（安捷倫公司自動(dòng)在線衍生化方法），一級(jí)氨基酸與鄰苯二甲醛、二級(jí)氨基酸與芴甲氧羰酰氯衍生后過(guò)柱檢測(cè)。

色譜條件：色譜柱為ZORBAX Eclipse AAA（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）。流動(dòng)相A：40 mmol/L磷酸二氫鈉（pH7.8）；流動(dòng)相B：乙腈∶甲醇∶水=45∶45∶10（V/V）。

檢測(cè)信號(hào)：除脯氨酸使用熒光檢測(cè)外，其他氨基酸使用紫外檢測(cè)。紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為338 nm，熒光激發(fā)波長(zhǎng)為266 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為305 nm。

1.3.3 游離氨基酸對(duì)魚(yú)腐乳滋味的貢獻(xiàn)評(píng)價(jià)方法

采用呈味強(qiáng)度值（taste active value，TAV）法評(píng)價(jià)單個(gè)游離氨基酸對(duì)魚(yú)腐乳滋味的貢獻(xiàn)，TAV表示各個(gè)呈味物質(zhì)的含量與其閾值的比值[8]。計(jì)算公式如下：

式中：C1為某氨基酸的質(zhì)量濃度；C2為相應(yīng)氨基酸的閾值濃度。

1.3.4 抗氧化活性的測(cè)定

樣品前處理：參照ANUPAM G等[5]提取抗氧化活性物質(zhì)的方法，稱取5 g樣品。加入pH為7.2的0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液25 mL，低溫勻漿5 min，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，取上清，凍干備用。

DPPH自由基清除率的測(cè)定：將凍干樣品，稀釋成適當(dāng)濃度，取1 mL待測(cè)樣品，加入1 mL 50 μmol/L DPPH乙醇溶液，充分混勻，室溫下避光反應(yīng)30 min，于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)吸光度值，以1 mL乙醇代替樣品作空白。DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下：

羥自由基清除率的測(cè)定：在比色管中一次加入9 mmol/L FeSO4，9 mmol/L乙醇-水楊酸，加入適量去離子水，最后加入8.8 mmol/L H2O2后搖勻，37 ℃水浴加熱，15 min后取出，測(cè)其吸光度值A(chǔ)0，其計(jì)算公式如下：

式中：A0為空白對(duì)照的吸光度值，AX為加樣品的吸光度值，AX0為不加顯色劑吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚(yú)腐乳發(fā)酵過(guò)程中游離氨基酸的變化

用高效液相色譜對(duì)魚(yú)腐乳發(fā)酵過(guò)程中各階段的游離氨基酸進(jìn)行分析，魚(yú)腐乳發(fā)酵過(guò)程中游離氨基酸含量的變化情況見(jiàn)表1。

表1 魚(yú)腐乳發(fā)酵過(guò)程中游離氨基酸含量的變化Table 1 Changes of free amino acid contents during fish sufu fermentation

從表1可知，魚(yú)腐乳在發(fā)酵過(guò)程中共檢測(cè)出18種游離氨基酸，其中含有8種必需氨基酸，游離氨基酸和其含氮降解產(chǎn)物是發(fā)酵食品中重要的滋味物質(zhì)和風(fēng)味前體物質(zhì)，是衡量發(fā)酵產(chǎn)品風(fēng)味的一個(gè)重要指標(biāo)[8]，發(fā)酵過(guò)程中總游離氨基酸的含量顯著升高，前期毛霉在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中產(chǎn)生的蛋白酶會(huì)分解蛋白質(zhì)為小肽或氨基酸，所以游離氨基酸的含量迅速升高，后期紅曲鹵的加入，帶入了部分游離氨基酸，而且后期發(fā)酵的過(guò)程中蛋白質(zhì)也會(huì)發(fā)生降解，所以游離氨基酸的含量繼續(xù)升高，但后期游離氨基酸的增長(zhǎng)幅度較小，可能是因?yàn)楹笃邴}含量較高，抑制了蛋白酶的活性[9]，所以游離氨基酸的增長(zhǎng)主要發(fā)生在前期發(fā)酵的過(guò)程中，后期成熟過(guò)程中游離氨基酸的含量增長(zhǎng)緩慢。

發(fā)酵結(jié)束后總游離氨基酸的含量由52.56mg/100g增加至915.77 mg/100 g。其中8種必需氨基酸的含量由30.5 mg/100 g增加至491.68.70 mg/100 g，占總游離氨基酸的53.69%。谷氨酸和天冬氨酸是主要的鮮味物質(zhì)，鮮味氨基酸的含量在發(fā)酵28d時(shí)，增加至138.57 mg/100 g，占總游離氨基酸的15.13%，精氨酸、蛋氨酸等的苦味閾值較低[10]，適當(dāng)?shù)目辔秾?duì)產(chǎn)品的風(fēng)味有利。另外，一些甜味氨基酸如甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸都有成倍的增加，產(chǎn)品會(huì)變得更加甘甜。

2.2 魚(yú)腐乳發(fā)酵過(guò)程中各類氨基酸的變化規(guī)律

根據(jù)氨基酸的味型與味覺(jué)強(qiáng)弱，大致可將氨基酸分為鮮味氨基酸（Asp、Glu、Lys）、甜味氨基酸（Thr、Ser、Gly、Ala、His、Pro）、苦味氨基酸（Val、Met、Ile、Leu、Arg）、芳香族氨基酸（Cys、Tyr、Phe）[10]。魚(yú)腐乳發(fā)酵過(guò)程中各類氨基酸含量的變化及各類氨基酸呈味強(qiáng)度值的變化見(jiàn)圖1及圖2。

圖1 魚(yú)腐乳發(fā)酵過(guò)程中各類氨基酸含量的變化Fig.1 Changes of various types of amino acid concentration during fish sufu fermentation

圖2 魚(yú)腐乳發(fā)酵過(guò)程中各類氨基酸呈味強(qiáng)度值的變化Fig.2 Changes of various types of amino acid taste active value (TAV)during fish sufu fermentation

從圖1、圖2可以看出，在魚(yú)腐乳發(fā)酵的過(guò)程中，鮮味氨基酸、必需氨基酸、疏水氨基酸、總氨基酸的含量都呈逐漸升高的趨勢(shì)，鮮味氨基酸在白坯（0 d）、毛坯（4 d）、咸坯、發(fā)酵最終產(chǎn)品（28 d）中的含量分別是3.6 mg/100 g、77.58 mg/100 g、104.31 mg/100 g、138.57 mg/100 g，含量明顯增加。8種必需氨基酸是人體所不能合成的氨基酸，對(duì)于人體的營(yíng)養(yǎng)均衡有很重要的作用，在魚(yú)腐乳發(fā)酵的過(guò)程中，必需氨基酸在白坯、毛坯、咸坯、發(fā)酵最終產(chǎn)品中的含量分別是30.60 mg/100 g、219.90 mg/100 g、266.55 mg/100 g、491.68 mg/100 g，最終發(fā)酵魚(yú)腐乳的必需氨基酸含量較高。疏水氨基酸是側(cè)鏈具有較高疏水性的一類氨基酸，具有疏水作用，對(duì)于保持蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)以及維持生物膜結(jié)構(gòu)等方面具有重要的作用。在魚(yú)腐乳發(fā)酵的過(guò)程中，疏水氨基酸在白坯、毛坯、咸坯、發(fā)酵產(chǎn)品中的含量分別是25.92mg/100g、343.84 mg/100 g、350.22 mg/100 g、340.06 mg/100 g，在前期發(fā)酵的過(guò)程中疏水氨基酸增長(zhǎng)較快，在毛坯、咸坯以及最終產(chǎn)品中變化不是很明顯。總游離氨基酸的含量在白坯、毛坯、咸坯和產(chǎn)品中的含量分別是52.56 mg/100 g、529.24 mg/100 g、656.46 mg/100 g、915.77 mg/100 g，總游離氨基酸的含量呈持續(xù)快速增長(zhǎng)的趨勢(shì)。研究還表明，發(fā)酵過(guò)程有助于鮮味物質(zhì)增加，其中Asp、Glu和Lys三種鮮味氨基酸的呈味活性值提高顯著，在發(fā)酵開(kāi)始時(shí)分別為0.45、0.45、0.16，發(fā)酵第28天分別為19.62、16.03、4.78。此外，精氨酸的呈味活性值也有較大幅度變化。

LIN X等[12]從嗜熱真菌和嗜溫真菌中提取熱穩(wěn)定性好的亮氨酸氨基肽酶，酶活力為2 771.5 U/mL，將其應(yīng)用于大豆蛋白水解，可以顯著提高水解度，去掉N端的疏水氨基酸，降低苦味。XU Y W等[13]利用片球菌發(fā)酵魚(yú)肉香腸，在發(fā)酵過(guò)程中游離氨基酸和非蛋白氮含量逐漸增加。王蔚新[14]在研究酸魚(yú)發(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)降解及其風(fēng)味形成中發(fā)現(xiàn)經(jīng)發(fā)酵后主要游離氨基酸為Glu、His、Lys、Ala、Leu和Asp等，其中Asp和Glu兩種鮮味氨基酸的呈味活性值最高。在火腿的研究中[15-16]，發(fā)現(xiàn)游離氨基酸對(duì)火腿滋味貢獻(xiàn)大，而且不同的存儲(chǔ)條件影響火腿滋味。由此可見(jiàn)，發(fā)酵產(chǎn)品的滋味與所用原料、菌種、發(fā)酵工藝、存儲(chǔ)條件等有一定關(guān)系。

2.3 魚(yú)腐乳發(fā)酵過(guò)程中抗氧化活性的變化

魚(yú)腐乳發(fā)酵過(guò)程中的DPPH自由基清除率與羥基自由基測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，在魚(yú)腐乳前期發(fā)酵的過(guò)程中，DPPH自由基清除率顯著升高，在魚(yú)腐乳后期成熟的過(guò)程中，DPPH自由基清除率呈緩慢升高的趨勢(shì)。DPPH自由基清除率被廣泛運(yùn)用于測(cè)定產(chǎn)品抗氧化物質(zhì)的含量，包括自由基清除能力以及作為氫供體。很多研究表明肽類和蛋白質(zhì)水解物具有很強(qiáng)的抗氧化性，抗氧化肽作為一種潛在的抗氧化劑成為可能[17]。另外有一些關(guān)于魚(yú)醬的研究也發(fā)現(xiàn)，一些氨基酸比如賴氨酸、甘氨酸、纈氨酸也具有抗氧化活性[18-19]。在本研究中，魚(yú)腐乳整個(gè)發(fā)酵的過(guò)程中，賴氨酸、甘氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸以及酪氨酸都呈上升的趨勢(shì)。在發(fā)酵過(guò)程中DPPH自由基清除率呈逐漸升高的趨勢(shì)，發(fā)酵第0天和第28天時(shí)DPPH自由基清除率分別為17.21%和70.30%。發(fā)酵過(guò)程中，抗氧化能力增強(qiáng)也有可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在水解之后，部分具有抗氧化性的氨基酸殘基暴露。GUO H等[19]認(rèn)為，兩肽或三肽比單個(gè)氨基酸抗氧化能力強(qiáng)，更易于吸收。關(guān)于魚(yú)腐乳發(fā)酵中的兩肽或三肽化合物變化情況有待進(jìn)一步研究。

圖3 魚(yú)腐乳發(fā)酵過(guò)程中DPPH自由基和羥自由基清除率變化情況Fig.3 Changes of DPPH radical and hydroxyl radical scavenging rates during fish sufu fermentation

在所有的自由基中，羥自由基被認(rèn)為是目前所知破壞力最強(qiáng)、毒性最大的一種自由基。直接或間接的引起脂質(zhì)氧化，蛋白質(zhì)變性、酶失活以及機(jī)體的病變或死亡，因此可以用羥自由基清除能力來(lái)衡量抗氧化活性[20]。從圖3可以看出，在前期發(fā)酵的過(guò)程中，羥自由基清除率呈較快速升高的趨勢(shì)，發(fā)酵第0天、第4天的羥自由基清除率分別為38.97%和49.21%。后期成熟的過(guò)程中，羥自由基清除率呈緩慢升高的趨勢(shì)，在第21天時(shí)為61.54%，第28天時(shí)達(dá)到63.11%。羥自由基清除率逐漸升高可能與發(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)逐漸被水解，產(chǎn)生抗氧化肽及氨基酸有一定關(guān)系。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用毛霉和紅曲霉發(fā)酵制作魚(yú)腐乳，對(duì)魚(yú)腐乳發(fā)酵過(guò)程游離氨基酸及抗氧化活性的變化規(guī)律進(jìn)行分析。在魚(yú)腐乳發(fā)酵過(guò)程中，鮮味氨基酸、必需氨基酸、疏水氨基酸、總氨基酸的含量都呈逐漸升高的趨勢(shì)。鮮味氨基酸的含量由3.6 mg/100 g上升至138.57 mg/100 g，必需氨基酸的含量由30.60 mg/100 g升高至491.68 mg/100 g，疏水氨基酸的含量由25.92 mg/100 g上升至340.06 mg/100 g，總游離氨基酸的含量由52.56 mg/100 g升高至915.77 mg/100 g。Asp、Glu和Lys這3種鮮味氨基酸呈味活性值升高顯著。魚(yú)腐乳在發(fā)酵過(guò)程中DPPH自由基清除率和羥自由基清除率均呈逐漸升高的趨勢(shì)。綜上所述，魚(yú)腐乳發(fā)酵過(guò)程游離氨基酸總量、鮮味氨基酸及抗氧化活性均呈上升趨勢(shì)。