周 濤，許超平，肖 穎，張 倩，李 力

武漢科技大學(xué)附屬武漢市普仁醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，武漢430081

多發(fā)性硬化癥 （multiple sclerosis，MS） 是一種由免疫介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性、炎癥性脫髓鞘疾病，其病理學(xué)特征是多灶性炎癥、脫髓鞘和神經(jīng)元損傷[1]。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎 （experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）與人類MS具有高度相似的病理和臨床表現(xiàn)，為MS的最佳動物模型[2]。既往大量研究表明，MS或EAE的自身免疫反應(yīng)主要由CD4+T細(xì)胞和T輔助細(xì)胞 （T helper cell，Th）1/2的失衡引起[3]。而最近的研究表明，Th17/調(diào)節(jié)性T（regulatory T，Treg）失衡是MS/EAE神經(jīng)功能障礙機(jī)制中更重要的因素[4]。Th17細(xì)胞是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的CD4+T細(xì)胞亞群，其分泌介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的獨(dú)特促炎細(xì)胞因子會攻擊髓鞘和軸突，繼而導(dǎo)致MS/EAE發(fā)生；而Treg細(xì)胞是一種介導(dǎo)免疫耐受的負(fù)免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，上述病理過程可能受到Treg細(xì)胞的抑制，故Th17/Treg細(xì)胞平衡對MS/EAE的發(fā)生具有重要影響[5]。目前用于MS的治療藥物包括皮質(zhì)類固醇和免疫抑制劑，但長期應(yīng)用易導(dǎo)致某些嚴(yán)重不良反應(yīng)，如抑郁癥、感染、心臟毒性、惡心和貧血等[6-7]。因此MS治療迫切需要具有高效率但不良反應(yīng)小的新療法。隨著生物技術(shù)和細(xì)胞學(xué)的發(fā)展，細(xì)胞免疫療法在臨床應(yīng)用中越來越受到關(guān)注。間充質(zhì)干細(xì)胞 （mesenchymal stem cells，MSCs） 具有自我更新能力和多能性，對炎癥和免疫反應(yīng)具有調(diào)節(jié)作用，其可從臍帶、骨髓以及脂肪等多種組織中獲取，其中脂肪來源的MSCs（adipose derived MSCs，ADMSC） 的獲取相對更容易。鞘氨醇激酶1（sphingosine kinase 1，SPK1）可催化產(chǎn)生鞘氨醇-1-磷酸 （sphingosine-1-phospate，S1P），大量研究表明，S1P信號傳導(dǎo)協(xié)調(diào)許多重要的病理生理過程，包括細(xì)胞增殖、遷移和免疫調(diào)節(jié)[8]?；诖耍狙芯繃L試用SPK1基因轉(zhuǎn)染ADMSC，觀察其對EAE小鼠的治療效果及對Th17/Treg細(xì)胞平衡的影響。

材料和方法

主要試劑與抗體 表達(dá)綠色熒光蛋白基因 （adenovirus expressing green fluorescent protein， Ad-GFP） 的腺病毒由美國貝克曼醫(yī)療器械公司提供。攜帶SPK1基因的重組腺病毒 （adenovirus-sphingosine kinase 1，Ad-SPK1）在武漢科技大學(xué)生物實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建，最佳感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI） 為200。 脂肪組織取自本院風(fēng)濕免疫科，所有捐贈者均已簽署知情同意書，研究相關(guān)實(shí)驗(yàn)課題經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)；動物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)本院動物倫理委員會批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)中盡量減少動物數(shù)量并盡量降低動物痛苦。完全弗氏佐劑 （complete Freund's adjuvant，CFA）和百日咳毒素購自 Sigma Chemical Co.（Saint Louis，MO， USA）； 髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白35-55（myelin oligodendrocyte glycoprotein35-55，MOG35-55）由上海比奧實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司合成，純度大于95%；結(jié)核分枝桿菌H37RA購自Difco（Detroit，MI，USA）； 酶聯(lián)免疫吸附測定 （enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒購自 eBiosciences（San Diego，CA，USA）；小鼠抗白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-17A、小鼠抗 CD4抗原呈遞細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）、小鼠抗CD25異硫氰酸熒光素 （fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）、小鼠抗藻紅蛋白叉頭框蛋白p3（forkhead box protein p3 phycoerythrin，F(xiàn)oxp3 PE）、Foxp3染色緩沖液購自BD PharMingen（San Diego，CA，USA）；兔抗小鼠IL-17A和兔抗小鼠Foxp3分別購自Abcam（Cambridge，UK）和Cell Signaling Technology（Boston，USA）；兔多克隆抗β-微管蛋白購自Epitomics（Burlingame，USA）；蛋白質(zhì)印跡法 （Western blot）試劑盒購自Applygen Technologies Inc.（中國北京）。流式細(xì)胞儀購自Beckman Coulter Commercial Enterprise（China） Co.， Ltd。

分離人ADMSC與ADMSC-SPK1制劑 采用負(fù)壓柱塞技術(shù)從3名接受吸脂術(shù)的健康志愿者抽取腹部皮下脂肪組織各約50 ml，根據(jù)膠原酶消化方案分離和培養(yǎng) ADMSC[9]。用 Ad-GFP以200 MOI轉(zhuǎn)染 ADMSC，48 h后采用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)觀察或檢測GFP在細(xì)胞中的表達(dá)。用Ad-SPK1以200 MOI轉(zhuǎn)染ADMSC，分別于24、48、72 h回收細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用ELISA法測定上清液中免疫反應(yīng)性SPK1的濃度。Western blot：BCA法定量SPK1蛋白濃度，依據(jù)樣品蛋白的濃度設(shè)定合適的上樣量 （細(xì)胞樣品10～20μg，組織樣品20～40μg），5體積樣品加1體積上樣緩沖液，沸水煮樣10 min，冷卻至室溫后離心，進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯 （polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，用含5%脫脂牛奶的含吐溫-20的磷酸鹽緩沖液封閉1 h，加一抗4℃孵育過夜，洗滌緩沖液清洗PVDF膜5次，6 min/次，將膜進(jìn)一步與各自的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的第二抗體一起室溫?fù)u床孵育2 h，洗滌緩沖液清洗PVDF膜5次，6 min/次。采用靈敏化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒進(jìn)行蛋白條帶顯影，ImageQuant TL 2005軟件進(jìn)行圖像分析。

小鼠EAE誘導(dǎo) SPF級健康雌性C57BL/6小鼠（6～8周齡，體重16～20 g）購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，共44只，實(shí)驗(yàn)前自適應(yīng)喂養(yǎng)7 d。將具有EAE特征的小鼠用作人MS的動物模型。EAE誘導(dǎo)：將小鼠麻醉后，于側(cè)腹部采用200μg經(jīng)4 mg/ml CFA乳化制備的MOG35-55-CFA（2 mg/ml）進(jìn)行免疫，其中第0天和第7天的CFA按1:1比例添加結(jié)核分枝桿菌H37Ra。另外，分別于第0天和第1天經(jīng)腹膜內(nèi)注射200 ng百日咳毒素。免疫后每天監(jiān)測EAE臨床癥狀，并按如下量表進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分 （0～5分）：0分：無臨床癥狀；1分：尾巴松弛，步態(tài)蹣跚；2分：共濟(jì)失調(diào)伴局部肢體麻痹；2.5分：單側(cè)后肢癱瘓；3分：單側(cè)后肢癱瘓，另一側(cè)后肢部分麻痹；3.5分：雙后肢癱瘓；4分：雙后肢癱瘓并累及前肢；5分：瀕死或死亡。

分組治療將44只小鼠隨機(jī)分配到4個(gè)治療組。（1） 正常對照 （normal control， NC） 組 （11只）： 采用等體積生理鹽水取代MOG35-55-CFA和百日咳毒素模擬免疫，后續(xù)注射等容量生理鹽水模擬治療；（2）模型組 （EAE組，11只）：誘導(dǎo)EAE后注射等容量生理鹽水模擬治療；（3）ADMSC組 （11只）：EAE免疫后，分別于第7、14、21、28免疫后天數(shù) （days post immunization，dpi） 經(jīng)側(cè)尾靜脈注射 ADMSC（5.5×106/ml）100μl； （4） ADMSC-SPK1組 （11只）： EAE免疫后，經(jīng)腹膜內(nèi)注射ADMSC-SPK1 （5.5×106/ml） 100μl。 至40 dpi時(shí)，NC組與ADMSC-SPK1組小鼠未發(fā)生死亡，EAE組死亡3只，ADMSC組死亡1只。將EAE組剩余8只及其他組各隨機(jī)選擇8只用于實(shí)驗(yàn)觀察。

腦與脊髓的病理學(xué)觀察 于40 dpi時(shí)處死小鼠，解剖腦組織和脊髓，采用4%甲醛固定，石蠟包埋切片，HE染色以評估炎性細(xì)胞浸潤。炎性細(xì)胞浸潤評分標(biāo)準(zhǔn)：0分：沒有炎性細(xì)胞；1分：少數(shù)散在的炎性細(xì)胞；2分：炎性細(xì)胞聚集浸潤在血管的周圍；3分：廣泛的血管套形成并延伸入鄰近實(shí)質(zhì)區(qū)域，或?qū)嵸|(zhì)區(qū)域浸潤而無明顯的血管套形成。取小鼠腦和脊髓腰膨大處組織用環(huán)氧丙烷處理，滲透并包埋在液體樹脂中，Leica EM超薄切片機(jī)切片，在透射電子顯微鏡 （日立H-7650，日本）下觀察超結(jié)構(gòu)和脫髓鞘變化，在每組的大腦 （白質(zhì)）和脊髓中選擇10個(gè)高倍 （×10 000）視野進(jìn)行分析。脫髓鞘評分標(biāo)準(zhǔn)：0分：無髓鞘脫失；1分：1個(gè)小的脫髓鞘病灶；2分：2～3個(gè)脫髓鞘小病灶；3分：1～2個(gè)大的脫髓鞘病灶；4分：廣泛髓鞘脫失且脫髓鞘面積大于白質(zhì)總面積的20%。每只小鼠的炎性細(xì)胞浸潤評分與脫髓鞘評分取腦與脊髓的平均值。

小鼠腦組織Th17/Treg相關(guān)炎癥指標(biāo)檢測將每只小鼠的腦稱重并用冷生理鹽水均漿，3000 r/min（轉(zhuǎn)子半徑10 cm）離心20 min，收獲上清液，采用ELISA及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線測定細(xì)胞因子IL-17A、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α） 和 IL-6 的濃度， 實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照制造商提供的說明書進(jìn)行。

腦和脊髓組織中IL-17A和Foxp3蛋白表達(dá)檢測根據(jù)所用試劑制造商規(guī)定的程序進(jìn)行蛋白質(zhì)提取和定量。取20μg蛋白樣品進(jìn)行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，加抗IL-17A抗體 （1:1000）與抗Foxp3抗體 （1:2000）， 內(nèi)參選用 β-微管蛋白 （1:50 000），在封閉溶液中于4℃孵育過夜。將一抗孵育后的膜取出用緩沖液洗膜3次，10 min/次，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗IgG（1:3000）室溫孵育1 h，用緩沖液洗膜3次，10 min/次，洗膜后用免疫印記化學(xué)發(fā)光試劑顯色，數(shù)字化多功能圖像增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)曝片，采用Image-Pro Plus軟件的圖像分析確定條帶的積分光密度。

流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠脾臟免疫細(xì)胞取適量小鼠脾臟組織樣本，放置到400目細(xì)胞篩網(wǎng)中 （篩網(wǎng)放于100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中），磷酸緩沖鹽溶液 （phosphate buffer saline，PBS）浸沒，用10 ml注射器芯搗碎研磨，將研磨液收集于15 ml離心管中，4℃1500 r/min（轉(zhuǎn)子半徑10 cm）離心5 min，棄上清。PBS洗1次，再加3 ml PBS重懸細(xì)胞并混勻，細(xì)胞計(jì)數(shù)，取1×107個(gè)細(xì)胞，各兩份 （分別用于Th17與Treg細(xì)胞含量分析），4℃1500 r/min（轉(zhuǎn)子半徑10 cm）離心5 min，棄上清。

Th17細(xì)胞標(biāo)記和檢測：使用含GolgiPlug TM（BD Pharmingen，San Jose，CA，USA） 的固定/透化緩沖液避光孵育，用小鼠抗CD4熒光素FITC抗體染色細(xì)胞，加入PE綴合的抗干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ） 和熒光標(biāo)記鏈霉親和素綴合的抗IL-17室溫孵育30 min，完成后加入2 ml PBS，4℃1500 r/min（轉(zhuǎn)子半徑10 cm）離心5 min，棄上清，加入500μl PBS重懸細(xì)胞，移入流式管上機(jī)檢測。

Treg細(xì)胞標(biāo)記和檢測：采用Pharmingen染色緩沖液染色細(xì)胞，加入PE綴合的抗Foxp3和APC綴合的抗CD25，4℃避光孵育30 min，完成后加1 ml透化緩沖液洗滌細(xì)胞，加入500μl PBS重懸細(xì)胞，移入流式管上機(jī)檢測。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用IBM SPSS Statistics 19軟件和Prism6.0軟件 （GraphPad Software， San Diego， CA， USA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，將數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，如符合正態(tài)分布，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，細(xì)胞或動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果的組間比較采用單因素方差分析 （ANOVA），組內(nèi)定量資料間的兩兩比較用Bonferrioni法；如不符合正態(tài)性分布，數(shù)據(jù)以M（P25，P75）表示，組間比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)，組內(nèi)定量資料間采用Bonferroni法檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

SPK1對ADMSC的轉(zhuǎn)染效率熒光顯微鏡與流式細(xì)胞術(shù)顯示，Ad-GFP轉(zhuǎn)染ADMSC后超過90%的細(xì)胞表達(dá)GFP（圖1A、1B）；ELISA測定結(jié)果顯示，Ad-SPK1轉(zhuǎn)染ADMSC后高效表達(dá)SPK1蛋白，SPK1在細(xì)胞培養(yǎng)上清液中24 h積累至約70 ng/ml（t=13.242，P=0.024），48 h達(dá)到峰值約130 ng/ml（t=20.544， P=0.005），72 h略下降至約125 ng/ml（t=20.013， P=0.006），ADMSC組與轉(zhuǎn)染Ad-GFP組的SPK1基本穩(wěn)定維持在約15 ng/ml（圖1C）；Western blot法檢測SPK1表達(dá)的結(jié)果與ELISA法檢測結(jié)果具有良好一致性 （圖1D）。

小鼠神經(jīng)功能評估自13 dpi開始，部分小鼠陸續(xù)出現(xiàn)EAE癥狀，如尾巴松弛、步態(tài)蹣跚，神經(jīng)功能缺損評分自16～24 dpi急劇升高，部分小鼠出現(xiàn)癱瘓甚至死亡；自22 dpi開始，EAE組評分顯著高于ADMSC組（t22dpi=7.53， P=0.013； t23dpi=7.83， P=0.031；t24dpi=8.55， P=0.008； t25dpi=11.53， P=0.018；t26dpi=13.64， P=0.022； t27dpi=10.54， P=0.021；t28dpi=12.06， P=0.014； t29dpi=11.95， P=0.004；t30dpi=10.38， P=0.011； t31dpi=14.06， P=0.013；t32dpi=7.95， P=0.031； t33dpi=11.06， P=0.006；t34dpi=11.76， P=0.037； t35dpi=10.66， P=0.022；t36dpi=10.04， P=0.001； t37dpi=11.14， P=0.016；t38dpi=11.21， P=0.021； t39dpi=10.89， P=0.006；t40dpi=10.32， P=0.022） 和ADMSC-SPK1組 （t22dpi=10.02， P=0.000； t23dpi=11.83， P=0.010； t24dpi=13.74， P=0.006； t25dpi=25.97， P=0.024； t26dpi=28.05， P=0.030； t27dpi=23.66， P=0.013； t28dpi=21.06， P=0.008； t29dpi=19.77， P=0.009； t30dpi=21.86， P=0.031； t31dpi=18.47， P=0.014； t32dpi=19.04， P=0.006； t33dpi=20.65， P=0.016； t34dpi=17.66， P=0.008； t35dpi=17.464， P=0.007； t36dpi=15.20， P=0.000； t37dpi=16.05， P=0.026； t38dpi=16.73， P=0.017； t39dpi=16.93， P=0.009； t40dpi=16.04，P=0.016），自19 dpi開始，ADMSC組評分顯著高于ADMSC-SPK1組 （t19dpi=5.56，P=0.014；t20dpi=6.86， P=0.003； t21dpi=7.04， P=0.034； t22dpi=7.88， P=0.012； t23dpi=7.57， P=0.005； t24dpi=7.95， P=0.008； t25dpi=8.54， P=0.011； t26dpi=7.44， P=0.016； t27dpi=12.33， P=0.020； t28dpi=10.76， P=0.002； t29dpi=15.65， P=0.006； t30dpi=10.03， P=0.016； t31dpi=8.64， P=0.020； t32dpi=2.54， P=0.014； t33dpi=9.05， P=0.011； t34dpi=9.65， P=0.015； t35dpi=9.06， P=0.019； t36dpi=9.12， P=0.031； t37dpi=9.66， P=0.006； t38dpi=9.43， P=0.006； t39dpi=9.43， P=0.011； t40dpi=9.43， P=0.022） （圖2）。

圖1 SPK1在體外轉(zhuǎn)導(dǎo)的ADMSC中的表達(dá)Fig 1 Expression of SPK1 in ADMSC transduced in vitro

圖2 小鼠神經(jīng)功能缺損評分Fig 2 Neurological deficit scoring in mice

小鼠腦和脊髓的病理改變40 dpi時(shí)，小鼠腦和脊髓組織的HE染色結(jié)果顯示，NC組無明顯炎性細(xì)胞浸潤，EAE組發(fā)生嚴(yán)重炎性細(xì)胞浸潤，在小血管周圍已形成 “套管狀”結(jié)構(gòu)，ADMSC組和ADMSC-SPK1組炎性細(xì)胞浸潤顯著減輕 （圖3A）；小鼠腦和脊髓中髓鞘和軸突的超微結(jié)構(gòu)電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示，NC組髓鞘和軸突均正常，EAE組髓鞘脫失嚴(yán)重，相同視野下髓鞘數(shù)目明顯減少，完整性降低，軸突明顯水腫或崩解，ADMSC組與ADMSC-SPK1組脫髓鞘和軸突損傷得到改善 （圖3B）；EAE組小鼠腦和脊髓炎性細(xì)胞浸潤評分和脫髓鞘評分均高于NC組 （P=0.000，P=0.005），ADMSC組小鼠腦和脊髓炎性細(xì)胞浸潤評分和脫髓鞘評分均低于EAE組 （P=0.021，P=0.015），ADMSC-SPK1組小鼠腦和脊髓炎性細(xì)胞浸潤評分和脫髓鞘評分均低于 ADMSC組 （P=0.024， P=0.013） （表1）。

圖3 小鼠組織病理學(xué)與超微結(jié)構(gòu)病理學(xué)分析Fig 3 Histopathological and ultrastructural pathological analysis of mice

表1 小鼠腦和脊髓炎性細(xì)胞浸潤和脫髓鞘評分的比較 [M（P25，P75），分]Table 1 Comparison of inflammatory cell infiltration and demyelination score in brain and spinal cordof mice[M （P25， P75）， score]

小鼠腦組織Th17/Treg相關(guān)炎癥指標(biāo)分析40 dpi時(shí)，與EAE組比較，ADMSC組和ADMSC-SPK1組的腦組織IL-17A（Z=1.021，P=0.017；Z=1.193，P=0.009）、 TNF-α （Z=2.540， P=0.004； Z=3.005， P=0.006）、 IL-6 （Z=3.364， P=0.008； Z=3.364，P=0.006）水平均顯著降低，與ADMSC組比較，ADMSC-SPK1組的腦組織IL-17A、TNF-α水平顯著降低 （Z=1.223， P=0.011； Z=2.364， P=0.010），IL-6水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （Z=1.970，P=0.420）（表2）。

小鼠腦和脊髓組織中IL-17A和Foxp3的表達(dá) 40 dpi時(shí)，與EAE組比較，小鼠腦和脊髓組織中IL-17A在ADMSC組的表達(dá)水平顯著降低 （t=10.323，P=0.013；t=7.422，P=0.008），且ADMSC-SPK1組顯著低于ADMSC組 （t=14.244， P=0.017； t=16.865， P=0.006）；Foxp3在ADMSC組的表達(dá)水平顯著升高 （t=14.544，P=0.008； t=9.420， P=0.002）， 且 ADMSC-SPK1組顯著高于ADMSC組 （t=9.654，P=0.005；t=11.535，P=0.009） （圖4）。

小鼠脾臟Th17與Treg細(xì)胞含量40 dpi時(shí)，與EAE組和ADMSC組比較，ADMSC-SPK1組小鼠脾臟中的IL-17+IFN-γ+T細(xì)胞比例降低 （t=6.61 P=0.031；t=14.54， P=0.005）， CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例升高 （t=3.42， P=0.012； t=17.37， P=0.003）（圖5）。

表2 3組小鼠腦組織輔助性T細(xì)胞17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞相關(guān)炎癥指標(biāo)水平比較 [M（P25，P75），ng/L]Table 2 Comparison of T helper cell 17/regulatory T cells-related inflammatory markers in brain tissue of three groups of mice[M （P25， P75）， ng/L]

圖4 Western blot分析小鼠腦和脊髓組織中IL-17A和Foxp3的表達(dá)Fig 4 Western blot analysis of IL-17A and Foxp3 expression in brain and spinal cord of mice

討 論

近年來，MS的治療相關(guān)研究已聚焦干細(xì)胞移植上，包括造血干細(xì)胞[10]、骨髓基質(zhì)細(xì)胞[11]、神經(jīng)前體細(xì)胞[12]和人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞等[13-14]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的效率和安全性已在MS的臨床治療中得到證實(shí)[15]。而早在2001年，Zuk等[16]的研究就已表明，從人脂肪組織分離和培養(yǎng)獲得的梭形細(xì)胞是多能干細(xì)胞，即ADMSC，可能與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有幾乎等效的作用。此外，ADMSC還具有免疫原性低的特點(diǎn)，不會導(dǎo)致出現(xiàn)異種移植或同種異體移植排斥[17]。另有研究顯示，未經(jīng)基因修飾的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療療效不及同樣未經(jīng)基因修飾的ADMSC[18]。以上結(jié)論為本研究選擇ADMSC作為Ad-SPK1腺病毒轉(zhuǎn)染載體的重要原因。另外，SPK1也與MS有關(guān)[19]。SPK1/S1P受體信號通路參與許多細(xì)胞類型的炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)。反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞參與MS中神經(jīng)炎癥的發(fā)展和維持。MS病變中巨噬細(xì)胞上S1P受體亞型3（sphingosine-1-phospate 3，S1P3）和SPK1表達(dá)上調(diào)反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞和SPK1的表達(dá)。用促炎癥刺激脂多糖 （lipopolysaccharide，LPS）處理原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)物后，S1P3和SPK1的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)增加。通過SPK活性測定證實(shí)LPS誘導(dǎo)的SPK激活，并且可由SPK抑制劑阻斷。當(dāng)星形膠質(zhì)細(xì)胞被LPS激活時(shí)，SPK1/S1P3信號軸被上調(diào)，這種信號途徑可能在星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的建立和維持中發(fā)揮作用。本研究的細(xì)胞分離及培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)顯示，Ad-GFP轉(zhuǎn)染ADMSC后超過90%的細(xì)胞表達(dá)GFP，且Ad-SPK1轉(zhuǎn)染ADMSC后高效表達(dá)SPK1蛋白，提示Ad-SPK1對ADMSC具有高轉(zhuǎn)染效率。以上為采用ADMSC-SPK1制劑治療EAE提供了基礎(chǔ)保障。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)MOG35-55誘導(dǎo)的EAE在病理學(xué)上表現(xiàn)為神經(jīng)功能缺損評分顯著升高，腦與脊髓組織發(fā)生大量炎性細(xì)胞浸潤，并發(fā)生與脫髓鞘相關(guān)的神經(jīng)缺陷，這與既往報(bào)道一致[20]。與EAE組比較，ADMSC組和ADMSC-SPK1組神經(jīng)功能、炎癥浸潤與脫髓鞘均獲得改善，其中ADMSC-SPK1組效果更顯著，表明ADMSC對EAE小鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用，且ADMSC-SPK1在結(jié)合了ADMSC和SPK1的雙重生物效應(yīng)后的效果更好。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠脾臟IL-17+IFN-γ+T及CD25+Foxp3+Treg的細(xì)胞比例Fig 5 Flow cytometry of IL-17+IFN-γ+T and CD25+Foxp3+Treg cells in mouse spleen

在MS/EAE發(fā)病過程中，Treg細(xì)胞在維持免疫耐受和調(diào)節(jié)效應(yīng)T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[21-22]。Th17亞群細(xì)胞是介導(dǎo)MS/EAE中免疫應(yīng)答和脫髓鞘的主要效應(yīng)細(xì)胞；另一方面，CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞作為自身免疫和組織損傷過程中的保護(hù)因子，也是各種治療方法的靶標(biāo)[23]。故為了分析ADMSC-SPK1的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，本研究進(jìn)一步考察小鼠不同臟器或組織中的Th17/Treg細(xì)胞平衡改變情況。在40 dpi時(shí)，Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示IL-17A和Foxp3在小鼠腦和脊髓組織中的表達(dá)具有一致性，均為與EAE組比較，IL-17A在ADMSC組和ADMSC-SPK1組的表達(dá)水平顯著降低，且ADMSC-SPK1組顯著低于ADMSC組，F(xiàn)oxp3在ADMSC組和ADMSC-SPK1組的表達(dá)水平顯著升高，且ADMSC-SPK1組顯著高于ADMSC組；流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示與EAE組和ADMSC組比較，ADMSCSPK1組小鼠脾臟中的IL-17+IFN-γ+T細(xì)胞比例降低，CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例升高。以上結(jié)果表明，EAE小鼠中出現(xiàn)不平衡的Th17/Treg比率，即Th17/Treg比率升高，而通過ADMSC移植尤其是ADMSC-SPK1移植后可顯著降低Th17/Treg比率。

此外，本研究還顯示，在小鼠經(jīng)誘導(dǎo)發(fā)生EAE后，其腦組織 Th17/Treg相關(guān)炎癥指標(biāo) IL-17A、TNF-α、IL-6水平顯著升高。IL-17A是IL-17家族的主要功能成員，是由Th17細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子[24]。TNF-α和IL-6均可能與EAE有關(guān)，有研究通過尸檢發(fā)現(xiàn)MS患者在活動性MS病變部位的TNF-α水平升高，且腦脊液和血清中的TNF-α水平與病變的嚴(yán)重程度相關(guān)[25]。關(guān)于IL-6，研究顯示來自MS患者的B細(xì)胞比來自健康供體的B細(xì)胞產(chǎn)生更多該細(xì)胞因子，且在B細(xì)胞耗竭治療后從患者中分離的B細(xì)胞重新顯示出正常的IL-6水平[26]。此外，IL-6已被證明對EAE發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要[27]。這些炎癥細(xì)胞因子通過攻擊髓鞘和軸突，導(dǎo)致脫髓鞘和軸突損傷并促進(jìn)MS/EAE發(fā)生。故推測ADMSC或ADMSC-SPK1能抑制Th17細(xì)胞增殖，從而減少以上炎癥細(xì)胞因子的釋放并降低中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。

綜上，SPK1轉(zhuǎn)染ADMSC能有效緩解EAE小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥浸潤和髓鞘脫失，發(fā)揮顯著的神經(jīng)保護(hù)作用，且該效果優(yōu)于未經(jīng)SPK1轉(zhuǎn)染的ADMSC，其機(jī)制可能與ADMSC-SPK1能顯著降低EAE小鼠Th17/Treg細(xì)胞比率并減少相關(guān)炎癥細(xì)胞因子的釋放有關(guān)。本研究為MS提供了一種更為高效且易行的治療途徑。