楊云洪，尹朝暉，張汝一，顏登國，徐偉，趙洋，李國勝

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 肛腸外科，貴州 貴陽 550001)

小腸癌是一種少見的惡性腫瘤，占消化道惡性腫瘤的1%～2%[1-2]。近年來，隨著檢查技術(shù)的進步和飲食結(jié)構(gòu)的改變，小腸癌的發(fā)病率呈逐年升高趨勢[3-4]。目前小腸癌的治療仍以手術(shù)為主，然而確診時多為晚期，總體預(yù)后較差，5年生存率低[5]，因此如何尋求有效治療小腸癌的新藥物已經(jīng)成為了目前研究的熱點。三氧化二砷(arsenic trioxide,ATO)是中藥砒霜的主要成分，古代主要用于治療梅毒、瘟疫及瘧疾等[6-8]。上世紀70年代，ATO首次應(yīng)用于血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療，并取得了顯著的療效[9]。近年研究陸續(xù)表明，ATO在治療肝癌、結(jié)腸癌等多種實體瘤的過程中同樣發(fā)揮著巨大的抗腫瘤作用[10-12]。然而由于小腸癌的發(fā)病率低，可供研究的臨床資料較少[13]，目前國內(nèi)外關(guān)于ATO是否同樣具有抗小腸腫瘤作用的研究尚未見報道。因此，本實驗擬通過探討ATO在體外對人小腸癌HIC細胞增殖和凋亡的影響，為ATO應(yīng)用于臨床提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株及主要試劑 人小腸癌HIC細胞株購自美國ATCC細胞庫，改良型RPMI-1640培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶及雙抗(青霉素、鏈霉素)均購自美國HyClone公司，胎牛血清購自美國Gibco公司。

1.1.2主要儀器 TGL-低速臺式離心機(上海醫(yī)用儀器廠)，Millipore超純水儀(美國 Millipore公司)，超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司)，1 000、200及20 μL微量可調(diào)加樣器(上海金花)，0.5和2.5 μL微量可調(diào)加樣器(德國Eppendorf公司)，2300型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(美國SHELLAB公司)，倒置顯微鏡(日本尼康公司)，E-Plate 16檢測板和xCELLigence RTCA DP實時無標記細胞分析儀(杭州艾森生物有限公司)，F(xiàn)ACSCanto Ⅱ流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 方法

1.2.1人小腸癌HIC細胞的復(fù)蘇和培養(yǎng) 復(fù)蘇凍存的HIC細胞，加入含 10%胎牛血清、1%雙抗(100 U/mL青霉素和鏈霉素)的改良型RPMI-1640培養(yǎng)液中，5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)。每24 h加培養(yǎng)液，48 h更換培養(yǎng)液，取對數(shù)期生長的細胞用于后續(xù)研究。

1.2.2實時無標記細胞分析(real-time label-free cell analysis，RTCA)系統(tǒng)動態(tài)監(jiān)測ATO對HIC細胞的毒性作用 取生長狀態(tài)良好的對數(shù)期HIC細胞，調(diào)整細胞懸液濃度為1×108/L，向E-Plate 16檢測板中加入培養(yǎng)基50 μL并測定背景阻抗值，取出E-Plate 16檢測板，向各孔中加入100 μL調(diào)整好的細胞懸液(細胞量為5～10×102/孔)，將檢測板放回RTCA儀，5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)中孵育24 h，各孔分別加10、15、20、40及60 μmol/L ATO處理作為實驗組，加等量磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)作為空白對照組。E-Plate 16檢測板再次放回RTCA儀，監(jiān)控時長120 h、間隔30 min，連續(xù)監(jiān)測并記錄細胞指數(shù)(cell index，CI)值，通過RTCA 系統(tǒng)動力學(xué)變化反應(yīng)曲線反映各孔HIC細胞的生長狀況,并計算ATO對人小腸癌HIC細胞作用24和36 h時的增殖抑制率[細胞增殖的抑制率(%)=(空白對照組CI值-實驗組CI值)/對照組CI值×100%。

1.2.3流式細胞儀(flow cytometer，F(xiàn)CM)檢測HIC細胞的凋亡 取處于對數(shù)期HIC細胞，培養(yǎng)48 h，分別加10、15、20及40 μmol/L ATO處理作為實驗組，加等量PBS作為空白對照組，5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，以不含乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)的0.25%胰酶消化后收集細胞，將細胞密度調(diào)整為1×109/L，PBS洗滌2次，1×Binding Buffer緩沖液100 μL重懸細胞。各管中各加碘化丙啶(propidium iodide，PI) 5 μL和Annexin V-FITC染料室溫避光孵育15 min，加1×Binding Buffer緩沖液300 μL終止，用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 ATO對人小腸癌HIC細胞增殖的影響

RTCA系統(tǒng)動態(tài)監(jiān)測結(jié)果，經(jīng)過10、15、20、40及60 μmol/L ATO作用120 h，各實驗組HIC細胞CI值均較空白對照組下降，且隨著ATO濃度的增加，下降的趨勢更明顯。見圖1。

圖1 不同ATO濃度抑制HIC細胞增殖的實時監(jiān)測Fig.1 Real-time monitoring inhibitory HIC cell proliferation induced by ATO with indicated concentrations

2.2 不同濃度ATO對人小腸癌HIC細胞增殖的抑制率

不同濃度ATO對HIC細胞作用24和36 h時的增殖抑制率結(jié)果顯示，增殖抑制率隨著ATO濃度增加而增高(P<0.05)，且隨著ATO作用時間的延長而增高(P<0.05)；當ATO濃度為60 μmol/L時，ATO對小腸癌HIC細胞作用24及36 h時的增殖抑制率均接近100%。見表1。

表1 不同ATO濃度處理后HIC細胞的抑制率Tab.1 The inhibitory rates in HIC cell proliferation induced by ATO with indicated

2.3 流式細胞儀檢測人小腸癌HIC細胞的凋亡

通過FITC標記的Annexin V抗體和PI雙染色，流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，在流式細胞圖結(jié)構(gòu)中，右下(lower right,LR)象限表示早期凋亡細胞，右上(upper right,UR)象限表示中晚期凋亡細胞，將LR+UR作為總凋亡細胞，結(jié)果顯示經(jīng)10、15、20及40 μmol/L ATO對HIC細胞作用48 h后的總凋亡率均高于空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且隨著ATO濃度的升高，凋亡率亦增高(P<0.05)。見圖2。

注：A、B、C、D及E分別為不同濃度ATO作用HIC細胞48 h的凋亡流式細胞檢測結(jié)果，F(xiàn)為不同濃度ATO作用HIC細胞48 h的各組細胞凋亡率；(1)與空白對照組比較，P<0.05。圖2 不同濃度ATO 處理后HIC細胞的凋亡率Fig.2 The apoptotic rates in HIC cells induced by ATO with indicated concentrations

3 討論

2000年，美國食品藥品管理局(food and drug administration，F(xiàn)DA)正式批準ATO用于臨床治療早幼粒細胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)，治愈率近 90%[14]。ATO不僅在白血病的治療中有顯著的療效，對其他血液系統(tǒng)惡性腫瘤及多種實體瘤也具有明顯的抗腫瘤效果[15]。Kim等[16]在體內(nèi)外實驗中證實ATO可以顯著地抑制膽管細胞癌的生長，He等[17]研究表明ATO在多發(fā)性骨髓瘤的臨床治療中取得了較好的療效。本研究結(jié)果顯示，與空白對照組對比，ATO作用人小腸癌HIC細胞后，抑制率隨濃度的增加而增高(P<0.05)，且隨時間的延長而增高(P<0.05)，表明ATO可以顯著抑制人小腸癌HIC細胞等增殖。細胞增殖抑制的實驗檢測方法目前常用的為噻唑藍比色法，但其并不能連續(xù)監(jiān)測藥物的作用過程[18]，本研究使用的實時無標記細胞分析系統(tǒng)，即RTCA法能夠?qū)崟r監(jiān)測和反應(yīng)細胞生長和增殖的動態(tài)過程，相對于傳統(tǒng)的MTT法，觀察效果更加準確、可控，可以更好地篩選和確定藥物最佳濃度及最佳藥物處理時間等[19]。

ATO在體外發(fā)揮抗腫瘤作用主要是通過抑制腫瘤細胞的增殖和誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡來實現(xiàn)[20]。有研究報道，ATO可以在體外抑制結(jié)腸腺癌LS-174T細胞生長，其作用是通過抑制細胞增殖和促進凋亡兩方面協(xié)同完成的[21]。細胞凋亡是由基因編碼調(diào)控的細胞程序性細胞死亡，是調(diào)控維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和平衡的一個重要機制，凋亡調(diào)控失衡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因此為消除異常增生的腫瘤細胞提供了一個重要途徑[22]。Annexin V-FITC/PI雙染色法可以將早期凋亡細胞及中晚期凋亡細胞區(qū)分開來，相比于傳統(tǒng)的其它檢測方法，如原位末端轉(zhuǎn)移酶標記法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay，TUNEL)檢測法，其結(jié)果更加靈敏且準確可靠[23]。本研究中，通過流式細胞技術(shù)檢測不同濃度ATO作用的HIC細胞48 h后的凋亡情況，結(jié)果顯示ATO可以促進HIC細胞的凋亡，且隨著ATO濃度的增加，凋亡率亦增高(P<0.05)，因此ATO通過抑制腫瘤細胞的增殖同時促進腫瘤細胞的凋亡，來抑制腫瘤生長。

綜上所述，ATO可以在體外抑制HIC細胞的增殖，且抑制率隨濃度的增加而增高，隨時間的延長而增高，同時ATO還可以促進人HIC細胞的凋亡，且凋亡率隨濃度的增加而增高，從而發(fā)揮抗腫瘤的活性，這說明ATO具有廣泛且有效的抗腫瘤作用。但本研究并沒有對其機制進行研究，同時也沒有行動物體內(nèi)實驗，ATO 本身并不具備靶向性，對機體毒副作用也巨大，因此今后可深入研究ATO發(fā)揮其抗腫瘤作用的具體機制，同時進行動物體內(nèi)實驗，期望能發(fā)現(xiàn)某種靶向物質(zhì)與ATO連接后使其具備靶向性。本研究雖然存在一定局限性，但初步顯示了ATO對體外HIC細胞的增殖及凋亡的作用，為小腸癌的臨床治療研究提供了新的方向。