文芳，黃秀桃，劉耀文，李健偉，雷后康，周金年

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，貴州 貴陽(yáng) 550004)

子癇前期(preeclampsia，PE)是妊娠期特有疾病，一般在妊娠20周后患者可出現(xiàn)血壓升高、蛋白尿、水腫，并伴頭痛、眼花、胸悶、心慌、氣促、惡心、嘔吐和上腹不適等臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重影響了母嬰健康，亦是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒死亡率升高的原因之一[1-2]。目前，臨床對(duì)PE的病因及發(fā)病機(jī)制均尚未完全闡明，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)胎盤(pán)從母體娩出后，PE所致的相關(guān)臨床癥狀就減輕，甚至消失[3]，因此，胎盤(pán)異常在PE發(fā)病機(jī)制中的起著非常關(guān)鍵的作用。可溶性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-1(soluble vascular endothelial growth factor receptor 1，sFlt-1)認(rèn)為是抗血管生成因子，在PE孕婦的血循環(huán)中顯著升高，可拮抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(placental growth factor，PLGF)等各種促血管生成的作用，并造成廣泛的血管內(nèi)皮損傷，是導(dǎo)致患者出現(xiàn)高血壓、蛋白尿及水腫的主要抗血管形成因子，同時(shí)參與了PE的發(fā)生發(fā)展[4-5]。目前的研究表明，sFlt-1可以作為PE的預(yù)測(cè)指標(biāo)[6]。PLGF是在妊娠期起重要作用的蛋白，研究認(rèn)為PLGF可以單獨(dú)或與其他指標(biāo)聯(lián)合檢查可用于預(yù)測(cè)早孕期PE的發(fā)生[7]。胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin growth factor-1，IGF-1)是一種胎盤(pán)蛋白，在胚胎和胎盤(pán)的發(fā)育方面有重要作用，PE孕婦胎盤(pán)中IGF-1 較正常孕婦降低[8]。相關(guān)研究表明，在PE患者胎盤(pán)組織中PLGF和IGF-1的表達(dá)均低，并且隨患者病情加重有下降的趨勢(shì)，胎盤(pán)組織中兩者的表達(dá)呈正相關(guān)[9]，但尚未見(jiàn)sFlt-1、PLGF及IGF-1同時(shí)用于PE孕婦的胎盤(pán)組織相關(guān)研究。故本研究通過(guò)分析PE孕婦胎盤(pán)組織中sFlt-1、PLGF及IGF-1的表達(dá)水平和臨床意義，探討與PE的關(guān)系，為臨床早期診斷該疾病提供了依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象、主要試劑和儀器

1.1.1對(duì)象 收集2017年7月1日—2018年8月31日本院產(chǎn)科住院分娩的重度PE孕婦25例作為重度PE組，輕度PE孕婦15例作為輕度PE組，PE的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[10]，要求此次妊娠為單胎、剖宮產(chǎn)分娩、且凝血功能正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：妊娠合并糖尿病、腎臟病、心臟病、高血壓等慢性疾病病史，既往有不明原因的習(xí)慣性流產(chǎn)、死胎、死產(chǎn)、胎兒畸形等不良孕產(chǎn)史，長(zhǎng)期服用藥物史及吸煙史等，本次懷孕合并急、慢性感染性疾病及證實(shí)胎兒有畸形。同時(shí)取正常晚期孕婦30例作為對(duì)照組。所有研究對(duì)象為自愿參加本研究，且簽署知情同意書(shū)。

1.1.2主要試劑和儀器 一抗sFlt-1、PLGF及IGF-1抗體(美國(guó)Abcam公司)，PBS緩沖液(pH 7.3)、枸櫞酸修復(fù)液(pH 6.0)、二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)、乙二胺四乙酸二鈉鹽(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)及顯色試劑盒(北京中杉金橋公司)。

1.2 方法

1.2.1胎盤(pán)標(biāo)本制作 所有孕婦剖宮產(chǎn)術(shù)中胎盤(pán)娩出后，肉眼檢查胎盤(pán)，若胎盤(pán)表面無(wú)明顯病理改變，避開(kāi)胎盤(pán)母體面的出血區(qū)與鈣化區(qū)，取約2.0 cm×2.0 cm×2.0 cm全層胎盤(pán)組織，予0.9%氯化鈉沖洗掉表面血液，10%的福爾馬林固定24 h，經(jīng)脫水、石蠟包埋，用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

1.2.2免疫組織化學(xué)檢測(cè)及結(jié)果判斷 采用免疫組織化學(xué)Envsion二步法檢測(cè)胎盤(pán)組織中sFlt-1、PLGF及IGF-1的表達(dá)，其中陰性對(duì)照用PBS代替一抗。制備切片厚約4 μm，經(jīng)蘇木精-伊紅染色法( hematoxylin-eosin staining，HE)染色判斷切片的質(zhì)量。免疫組化步驟如下：65 ℃恒溫烤箱烤片1 h，二甲苯脫蠟30 min；梯度酒精水化至水，采用EDTA抗原修復(fù)液高溫高壓修復(fù)；分別加一抗sFlt-1、PLGF及IGF-1抗體(稀釋比例分別為為1 ∶200、1 ∶180和1 ∶150)，置于濕盒中4 ℃冰箱過(guò)夜；次日，加二抗充分反應(yīng)，DAB顯色。復(fù)染細(xì)胞核用蘇木素30 s，脫水于梯度酒精上進(jìn)行；用二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，染色方法按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。各組孕婦胎盤(pán)組織中sFlt-1、PLGF及IGF-1的免疫組織化學(xué)結(jié)果判定如下[11]，隨機(jī)選取高倍視野5個(gè)，聯(lián)合染色的強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行計(jì)分，其中染色強(qiáng)度不著色為0分、淺黃色為1分、棕黃色為2分及棕褐色為3分，陽(yáng)性細(xì)胞百分比小于5%為0分、6%～25%為1分、26%～50%為2分、陽(yáng)性細(xì)胞百分比>50%為3分，然后取2者得分乘積為最終分?jǐn)?shù)，規(guī)定0分為陰性(-)，1～2分為“+”，3～4分為“++”，5～6分為“+++”。免疫組織化學(xué)結(jié)果由2名高年資病理醫(yī)師采用雙盲法獨(dú)立檢測(cè)，取平均值，“+”、“++”及“+++”視為陽(yáng)性表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料采用率表示，分類資料采用χ2檢驗(yàn)和Kruskal-Wallis檢驗(yàn)進(jìn)行分析，以P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 sFlt-1、PLGF及IGF-1表達(dá)

sFlt-1、PLGF及IGF-1在胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞中主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，染色呈淺黃色、棕黃色或者棕褐色樣顆粒染色(圖1)。輕度及重度PE組孕婦胎盤(pán)組織sFlt-1陽(yáng)性表達(dá)高于對(duì)照組，且隨病情加重而增加(P<0.05)；輕度及重度PE孕婦胎盤(pán)組織中PLGF、IGF-1的陽(yáng)性表達(dá)低于對(duì)照組，且輕度PE組孕婦陽(yáng)性表達(dá)低于重度PE組(P<0.05，表1)。

圖1 3組孕婦胎盤(pán)組織sFlt-1、PLGF及IGF-1的表達(dá)(Envision，×200)Fig.1 The expression of sFlt-1, PLGF, and IGF-1 in placental tissues of 3 groups of pregnant women(Envision，×200)

表1 各組孕婦胎盤(pán)組織sFlt-1、PLGF及IGF-1的陽(yáng)性表達(dá)[n(%)]Tab.1 Comparison of the positive expression rate of sFlt-1, PLGF, and IGF-1 in placental tissues of 3 groups of pregnant women[n(%)]

2.2 sFlt-1、PLGF和IGF-1表達(dá)

輕度及重度PE組孕婦胎盤(pán)組織sFlt-1表達(dá)強(qiáng)度等級(jí)均高于對(duì)照組(P<0.05)，但輕度與重度PE組孕婦比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；輕度及重度PE組孕婦胎盤(pán)組織PLGF和IGF-1的表達(dá)強(qiáng)度等級(jí)均低于對(duì)照組(P<0.05)，且輕度組兩項(xiàng)指標(biāo)的表達(dá)強(qiáng)度低于重度組孕婦(P<0.05，表2)。

表2 各組孕婦胎盤(pán)中sFlt-1、PLGF和IGF-1表達(dá)[n(%)]Tab.2 Comparison of the intensity of sFlt-1, PLGF and IGF-1 in placental tissues of 3 groups of pregnant women[n(%)]

3 討論

由于PE可能會(huì)導(dǎo)致母兒的不良妊娠結(jié)局，故近年來(lái)PE成為妊娠期高血壓疾病的研究重點(diǎn)[12]，相關(guān)研究認(rèn)為PE的病因起源于胎盤(pán)，因早期各種因素引起胎盤(pán)缺血缺氧，胎盤(pán)缺血時(shí)分泌各類胎盤(pán)因子，廣泛作用于母體血管內(nèi)皮細(xì)胞，使母體肝臟、腎臟等全身多器官功能損傷，出現(xiàn)不良妊娠結(jié)局[13-14]。sFlt-1具有酪氨酸激酶活性，能與內(nèi)皮細(xì)胞表面受體VEGFR-1和VEGFR-2結(jié)合形成異源二聚體，可以通過(guò)抑制VEGF和PLGF的生物學(xué)活性，致血管生成障礙和血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，從而抑制了血管生成[15]。大量研究表明sFlt-1可直接參與血管形成和胎盤(pán)絨毛浸潤(rùn)[16-18]。有研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)后48 h內(nèi)sFlt-1水平明顯下降，提示過(guò)量的sFlt-1可能來(lái)源于胎盤(pán)[19]。本研究檢測(cè)胎盤(pán)中sFlt-1的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，PE組孕婦胎盤(pán)組織sFlt-1陽(yáng)性表達(dá)率比正常妊娠組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，跟既往相關(guān)報(bào)道一致，說(shuō)明sFlt-1在PE患者胎盤(pán)中的高表達(dá)在PE的發(fā)病過(guò)程中起著重要的作用。但是本研究中輕度PE組與重度PE組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與既往研究報(bào)道不一致[20-21]。分析導(dǎo)致這一結(jié)果的原因，考慮為本次研究樣本量較小。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，sFlt-1參與PE的可能機(jī)制是sFlt-1損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞后子宮內(nèi)膜細(xì)胞及其它血管收縮，胎盤(pán)組織缺血缺氧，大量的活性細(xì)胞因子得到合成和釋放，最終發(fā)生妊娠期高血壓疾病，從而加重PE患者的病情[22]。

PLGF對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞和VEGF功能具有調(diào)節(jié)作用[23]。PLGF與酪氨酸酶受體結(jié)合后，可促進(jìn)早孕時(shí)滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖，增加血管通透性，促進(jìn)新生血管生成[24]。本研究顯示病例組胎盤(pán)組織中PLGF表達(dá)顯著低于對(duì)照組，提示PLGF在PE患者胎盤(pán)組織中表達(dá)量很低。推測(cè)導(dǎo)致這一結(jié)果的原因可能為sFlt-1與PLGF結(jié)合后刺激血管生成，從而出現(xiàn)了PE的相關(guān)臨床表現(xiàn)。

IGF-1可促使血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放凝酶原激活物，從而改善胎盤(pán)功能[25]，刺激滋養(yǎng)細(xì)胞侵入、遷移以及舒張血管，參與血壓調(diào)節(jié)[26]。相對(duì)正常孕婦而言，PE孕婦胎盤(pán)中IGF-1的表達(dá)降低，這些改變與PE這種疾病密切相關(guān)[27]。本研究結(jié)果顯示PE組孕婦胎盤(pán)組織中IGF-1表達(dá)較對(duì)照組明顯下降，重度PE組較輕度PE組孕婦胎盤(pán)組織中IGF-1表達(dá)下降(P<0.05)，說(shuō)明IGF-1與PE病情的嚴(yán)重程度有關(guān)。推測(cè)PE患者IGF-1在胎盤(pán)組織中表達(dá)下降的可能機(jī)制為PE時(shí)患者全身小動(dòng)脈痙攣、胎盤(pán)缺血缺氧、供血不足，出現(xiàn)胎盤(pán)功能障礙，使得胎盤(pán)分泌的生長(zhǎng)激素減少，因?yàn)槿焉锲陂gIGF-1受血液循環(huán)中胎盤(pán)生長(zhǎng)激素的調(diào)節(jié)，所以IGF-1的合成與分泌，導(dǎo)致IGF-1表達(dá)降低。

綜上所述，胎盤(pán)組織中sFlt-1、PlGF及IGF-1的表達(dá)與PE發(fā)生發(fā)展過(guò)程有直接關(guān)系，研究sFlt-1、PlGF、IGF-1在PE發(fā)病中的作用，可為早期診斷和治療PE提供思路。