吳通前，馬嵐，金筱茜，周萍萍，李靜，袁銳，余芳***

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 臨床研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院 臨床微生物及免疫學(xué)教研室，貴州 貴陽(yáng) 550004； 3.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 臨床檢驗(yàn)中心，貴州 貴陽(yáng) 550004； 4.湖北醫(yī)科大學(xué)附屬東風(fēng)醫(yī)院 臨床檢驗(yàn)中心，湖北 十堰 442008； 5.長(zhǎng)沙市第八醫(yī)院 臨床檢驗(yàn)中心，湖南 長(zhǎng)沙 410100)

免疫佐劑(immunologic adjuvant)是一類(lèi)能非特異性增強(qiáng)或改變機(jī)體對(duì)匹配抗原的特異性免疫應(yīng)答，可以增強(qiáng)抗原的免疫原性或者改變免疫的反應(yīng)類(lèi)型，但其本身并無(wú)抗原性的一類(lèi)物質(zhì)[1]。佐劑種類(lèi)很多，如氫氧化鋁佐劑、細(xì)菌佐劑、脂多糖及細(xì)胞因子等[2-3]。免疫佐劑可廣泛結(jié)合多種疫苗使用，通過(guò)不同機(jī)制降低抗原的使用量，迅速激活免疫系統(tǒng)增強(qiáng)免疫應(yīng)答、延長(zhǎng)釋放時(shí)間，對(duì)提升疫苗免疫效果具有非常重要的價(jià)值[4]。近期研究顯示，免疫佐劑已廣泛在腫瘤、過(guò)敏性疾病及自身免疫性疾病等多種疾病中開(kāi)展了相關(guān)研究[5-7]。研究證實(shí)，鈣結(jié)合蛋白S100A4通過(guò)Toll樣受體4(toll-like receptors 4，TLR4)、核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)及細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases1/2,ERK1/2)等信號(hào)通路在血管生成、腫瘤細(xì)胞存活遷移、蛋白磷酸化以及促進(jìn)炎癥等方面起到重要的調(diào)控作用[8-11]。S100A4的缺乏會(huì)削弱霍亂毒素(cholera toxin,CT)的佐劑作用，并抑制樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)的增殖及活化，同時(shí)還抑制炎性因子γ-干擾素(interferon-γ,IFN-γ)、白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)以及白細(xì)胞介素17(interleukin-17,IL-17)的產(chǎn)生，提示S100A4在機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答的潛在積極作用[12]。但目前尚沒(méi)有證據(jù)表明S100A4在免疫佐劑領(lǐng)域存在的潛在作用，基于此，本研究通過(guò)雞卵清白蛋白(ovalbumin,OVA)為模式抗原，以S100A4為佐劑免疫小鼠，探究S100A4的佐劑潛在作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8～10周齡野生型(wild-type,WT)健康雌性C57BL/6小鼠10只，購(gòu)于自北京華富康生物科技有限公司。小鼠于本校臨床醫(yī)學(xué)研究中心無(wú)特定病原體(specific pathogen free，SPF)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)本校動(dòng)物保護(hù)委員會(huì)倫理指導(dǎo)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)1503057)。

1.1.2主要試劑及儀器 用于購(gòu)建重組小鼠的S100A4蛋白購(gòu)于英國(guó)Abcam公司，OVA購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司，4-硝基苯磷酸二鈉(para-nitrophenyl phosphate,pNPP)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)底物、堿性磷酸酶-山羊抗小鼠免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)及免疫球蛋白E(immunoglobulin E,IgE)抗體購(gòu)于美國(guó)Southern Biotech公司，抗小鼠白細(xì)胞分化簇3(cluster of differentiation 3，CD3)FITC抗體、抗小鼠白細(xì)胞分化簇69(cluster of differentiation 69，CD69)PE抗體、抗小鼠白細(xì)胞分化簇11c(cluster of differentiation 11c，CD11c)APC抗體及抗小鼠主要組織相容性抗原Ⅱ類(lèi)分子(major histocompatibility antigen Ⅱ, MHC-Ⅱ)V500抗體購(gòu)自于美國(guó)BD公司，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；NAVIOS流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman公司，SYNERGY多功能酶標(biāo)儀購(gòu)置美國(guó)Bio Tek公司。

1.2 方法

1.2.1分組及采樣 小鼠隨機(jī)分為OVA組(OVA 20 μg)與OVA聯(lián)合S100A4蛋白組(OVA 20 μg與S00A4蛋白5 μg的混合液，聯(lián)合組)，每組5只，所有小鼠均經(jīng)踝關(guān)節(jié)免疫注射，2周后摘除眼球收集外周血，1 000 r/min離心5 min收集血清做后續(xù)實(shí)驗(yàn)；頸部折斷處死小鼠，收集距離免疫部位最近的腹股溝淋巴結(jié)(即引流淋巴結(jié))做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)引流淋巴結(jié)T細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells,DC)及其活化 取各組小鼠引流淋巴結(jié)并研磨碎，制備單細(xì)胞懸液200 μL；吸取懸液50 μL至流式上樣管中，分別加入抗小鼠CD3 FITC抗體、抗小鼠CD69 PE抗體、抗小鼠CD11c APC抗體及抗小鼠MHC-Ⅱ V500各1 μL至含有樣本的流式上樣管中，4 ℃避光孵育25 min，4 ℃、1 000 r/min離心5 min，去上清，加PBS 400 μL重懸各樣本管中細(xì)胞；流式細(xì)胞儀上機(jī)分析，CD3+細(xì)胞群為T(mén)細(xì)胞，CD11c+細(xì)胞群為DC，CD3+CD69+雙陽(yáng)性細(xì)胞群為活化T細(xì)胞，CD11c+MHC-Ⅱ+雙陽(yáng)性細(xì)胞群為活化DC。

1.2.3ELISA檢測(cè)血清OVA特異性IgG及IgE 取2塊酶標(biāo)板，先將200 μg/L OVA 加到96孔酶標(biāo)板中，4 ℃過(guò)夜，PBS洗滌4次；加1%BSA溶液4 ℃封閉過(guò)夜，PBS洗滌4次，拍干備用；取2組小鼠血清經(jīng)3倍逐級(jí)稀釋后取60 μL分別加入至已經(jīng)制備好的2塊酶標(biāo)板中第1排，3倍體積梯度稀釋至最后一排，37 ℃孵育2 h，PBS洗滌4次；向其中一塊板各樣本孔中加入堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(1 ∶3 000稀釋) 60 μL，另一塊板各樣本孔中加入堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)標(biāo)記的羊抗鼠IgE抗體(1 ∶3 000稀釋)60 μL，37 ℃孵育2 h，PBS洗滌4次；加入4-硝基苯磷酸二鈉(para-nitrophenyl phosphate,pNPP)底物避光顯色15～30 min；加入終止液，酶標(biāo)儀檢測(cè)405 nm處吸光度值(optical density,OD)，據(jù)不同梯度濃度檢測(cè)出的OD值計(jì)算OVA特異性IgG與IgE水平[13]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 引流淋巴結(jié)T細(xì)胞、DC及其活化

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，聯(lián)合組小鼠引流淋巴結(jié)中T細(xì)胞(CD3+)和DC(CD11c+)百分比高于OVA組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)合組小鼠引流淋巴結(jié)活化T細(xì)胞(CD3+CD69+)和活化DC(CD11c+MHC-Ⅱ+)百分比也高于OVA組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

注：A為引流淋巴結(jié)T細(xì)胞、DC及其活化流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果，B為引流淋巴結(jié)T細(xì)胞、DC及其活化百分比結(jié)果；(1)與OVA組比較，P<0.05。圖1 兩組小鼠引流淋巴結(jié)中T細(xì)胞、DC及其活化檢測(cè)Fig.1 Detection of T cells, DC, and their activation in draining lymph nodes between the two groups

2.2 血清OVA特異性IgG和IgE水平

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，聯(lián)合組小鼠血清中OVA特異性IgG明顯高于OVA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；聯(lián)合組小鼠血清中OVA特異性IgE與OVA組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

注：(1)與OVA組比較，P<0.01。圖2 兩組小鼠血清OVA特異性IgG及IgE檢測(cè)Fig.2 Measurement of serum OVA-specific IgG and IgE between the two groups

3 討論

S100A4在腫瘤轉(zhuǎn)移研究領(lǐng)域廣泛被研究，除在多數(shù)腫瘤細(xì)胞中表達(dá)外，還廣泛表達(dá)于機(jī)體免疫細(xì)胞，如T細(xì)胞、DC細(xì)胞及單核細(xì)胞等，并涉及參與調(diào)節(jié)這些免疫細(xì)胞的免疫功能，從而參與免疫調(diào)控[14]。本研究以O(shè)VA作為外源性抗原，雌性小鼠在相關(guān)疾病模型研究中發(fā)病率高于雄性小鼠，如過(guò)敏性哮喘[15]、自身免疫性疾病[16]等，因而本研究以C57BL/6雌性小鼠為研究對(duì)象，觀察S100A4作為免疫佐劑在機(jī)體免疫應(yīng)答的中的作用。足底免疫是用于研究體內(nèi)及體外免疫應(yīng)答現(xiàn)象的常用注射部位，是一種用于測(cè)定體內(nèi)免疫反應(yīng)的靈敏、快速而簡(jiǎn)單的測(cè)定方法[17]。當(dāng)抗原通過(guò)足部進(jìn)入機(jī)體時(shí)引起就近淋巴結(jié)引流，并引起淋巴結(jié)內(nèi)部免疫細(xì)胞活化增殖，發(fā)揮抗原提呈及加工功能，刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答[18]。已有研究表明，踝關(guān)節(jié)免疫與足底免疫效果一致，具有較高靈敏度，并不影響機(jī)體的免疫反應(yīng)[19]。因此，本實(shí)驗(yàn)沒(méi)有采用傳統(tǒng)的足底免疫法，而是通過(guò)踝關(guān)節(jié)注射進(jìn)行免疫，就是考慮到相對(duì)于足底免疫法，踝關(guān)節(jié)注射更為人性化，可以提高小鼠生活滿(mǎn)意度且不影響其行動(dòng)能力。

研究顯示，S100A4基因敲除后可有效抑制OVA誘導(dǎo)的過(guò)敏免疫應(yīng)答，并抑制了引流淋巴結(jié)中CD4+、CD8+和CD11c+細(xì)胞的增殖及血清中IgG和IgE水平，提示S100A4在免疫應(yīng)答中的調(diào)節(jié)作用及潛在的免疫佐劑作用[20]。細(xì)胞免疫是機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的重要過(guò)程，抗原提呈細(xì)胞(如DC，單核巨噬細(xì)胞)及T細(xì)胞活化增殖過(guò)程中發(fā)揮著主要作用[21]。本研究將OVA作為誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的抗原，S100A4蛋白為免疫佐劑免疫小鼠，結(jié)果表明與OVA組相比，聯(lián)合組小鼠引流淋巴結(jié)中T細(xì)胞(CD3+)與DC (CDc11+)百分比升高(P<0.05)，提示S100A4蛋白能夠促進(jìn)OVA誘導(dǎo)的小鼠局部引流淋巴結(jié)產(chǎn)生更多的T細(xì)胞及DC。CD69是T細(xì)胞激活的免疫調(diào)節(jié)分子，可通過(guò)T細(xì)胞抗原受體(T cell receptor，TCR)刺激后，在成熟T細(xì)胞上迅速誘導(dǎo)CD69的表達(dá)，10%正常胸腺細(xì)胞中均表達(dá)，是T細(xì)胞初始活化的首要調(diào)節(jié)分子[22]。本實(shí)驗(yàn)研究中，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)OVA組及聯(lián)合組中引流淋巴結(jié)T細(xì)胞的活化情況，結(jié)果顯示聯(lián)合組引流淋巴結(jié)中活化T細(xì)胞(CD3+CD69+)百分比高于OVA組(P<0.05)，表明S100A4的存在促進(jìn)了T細(xì)胞活化。MHC-Ⅱ是主要表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞上的免疫調(diào)節(jié)分子，如DC、單核巨噬細(xì)胞等，是抗原提呈細(xì)胞發(fā)揮抗原提呈功能的主要活化分子[23]。外源性抗原進(jìn)入機(jī)體后通過(guò)MCHⅡ遞呈給T細(xì)胞，從而產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答[24]。DC是機(jī)體最主要的抗原提呈細(xì)胞，其增殖活化是初始免疫應(yīng)答的關(guān)鍵[25]，在本研究中聯(lián)合組引流淋巴結(jié)中活化DC (CD11c+MHC-Ⅱ+)百分比高于OVA組(P<0.05)，提示S100A4作為佐劑可以促進(jìn)DC的活化，證實(shí)了其在誘導(dǎo)局部免疫應(yīng)答中的積極作用。

細(xì)胞免疫是T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，即T細(xì)胞受到抗原刺激后，分化、增殖活化對(duì)抗原直接進(jìn)行殺傷，并釋放相關(guān)細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素2(interleukin-2,IL-2)、白細(xì)胞介素4 (interleukin-4,IL-4)、白細(xì)胞介素5(interleukin-5,IL-5)、白細(xì)胞介素13(interleukin-13,IL-13)等，該類(lèi)細(xì)胞因子作用于B細(xì)胞促使其增殖活化，并釋放特異性抗體，如抗原特異性IgE、IgG及其亞型，從而引起體液免疫[26]。血清學(xué)分析結(jié)果表明，聯(lián)合組小鼠血清IgG水平高于OVA組(P<0.05)，證實(shí)S100A4在OVA誘導(dǎo)的體液免疫中的積極作用?？乖M(jìn)入機(jī)體后誘導(dǎo)體液免疫，促使B細(xì)胞活化產(chǎn)生IgE，并與肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞等細(xì)胞上Fc ε受體I(Fc epsilon receptor I，F(xiàn)cεRI)白細(xì)胞分化簇23(cluster of differentiation 23，CD23)受體結(jié)合誘導(dǎo)過(guò)敏反應(yīng)[27]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，OVA組與聯(lián)合組小鼠血清IgE滴度水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示S100A4作為免疫佐劑在誘發(fā)過(guò)敏安全性的潛在意義。

綜上所述，經(jīng)OVA誘導(dǎo)的小鼠免疫反應(yīng)后，S100A4蛋白可促進(jìn)引流淋巴結(jié)T細(xì)胞、DC及其活化百分比，同時(shí)促進(jìn)血清中IgG的產(chǎn)生，提示S100A4蛋白作為免疫佐劑增強(qiáng)了OVA誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，在免疫佐劑研究領(lǐng)域具有一定的潛在作用。