李華，李鴻雁，金圣宇**

(1.延邊大學附屬醫(yī)院 體檢科，吉林 延吉 133000； 2.延邊大學附屬醫(yī)院 血液內(nèi)科，吉林 延吉 133000)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是心腦血管疾病的主要原因、以動脈血管壁白細胞浸潤為特征的慢性炎性疾病[1-2]，目前AS的發(fā)病機制尚未完全清楚。超大血管性血友病因子(ultra large-von willebrand factor, UL-VWF)參與AS斑塊破裂部位的血栓形成，主要通過PSGL-1、β2-整聯(lián)蛋白介導白細胞的滾動和黏附，在AS形成過程中加速炎癥反應(yīng)。VWF是血管性血友病因子裂解酶13(adisintegr in and metall oproteinase with a thrombospond in type 1 motif，member 13，ADAMTS13)的唯一底物[3]，ADAMTS13缺乏(Adamts13-/-)的急性炎癥小鼠模型[4]可導致白細胞在正常靜脈中滾動增加，使其在炎癥靜脈中黏附增加，可促進白細胞在高剪切力作用下的捕獲和滾動。血小板可能通過GpIbα受體與受損內(nèi)皮表面的VWF依賴性相互作用、并釋放炎癥因子促成AS進程，故ADAMTS13可能通過裂解UL-VWF調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[3,5]。GpIbα主要作用是與VWF結(jié)合引起血小板黏附，進而改變細胞骨架，使血小板發(fā)生變形、移動、分泌、聚集和收縮等一系列變化。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，ADAMTS13功能異常與許多心腦血管疾病相關(guān)，如急性心肌梗死[6-8]、缺血性腦卒中[9-11]等，然而ADAMTS13水平降低、或VWF水平失衡是否參與此類疾病發(fā)生發(fā)展中的機制尚不明確。因此本研究使用載脂蛋白E缺乏(ApoE-/-)小鼠和Adamts13基因敲除的載脂蛋白E缺乏(Adamts13-/-ApoE-/-)小鼠，高脂肪飲食喂養(yǎng)12周，觀察比較2組小鼠主動脈AS病變程度、分析血漿VWF多聚體水平及血脂水平變化，探討ADAMTS13在AS發(fā)展過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1小鼠及食物 ApoE-/-小鼠(C57BL/6J品系)，從杰克遜實驗室購買。Adamts13-/-小鼠(C57BL/6/129品系)由戴維金斯伯格博士(內(nèi)科學教研室，密歇根大學)提供。高脂肪的西方飲食購買自哈倫實驗室，由21.2%的脂肪和0.2% 膽固醇組成。

1.1.2主要試劑和儀器 組織冰凍包埋劑(特德佩拉公司，美國)，Tris HCL(三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，上?？道剩袊?，1%酪蛋白、兔抗-VWF IgG抗體、IRDyeCW800標記的山羊抗兔IgG抗體(Sigma,美國)，血脂分析市售試劑(Wako Pure Chemical Industries and Trinity Biotech)，微型臺式離心機 (Sigma，德國)，DYDW-60UL -80 ℃低溫冰箱(鼎耀，中國)，SMZ1500高級體視顯微鏡、MIR-254低溫恒溫箱(松下，日本)，ECLIPSE-80i顯微鏡、DXM1200數(shù)碼相機(Nikon，日本)，1.0% Seakem基因水平轉(zhuǎn)移瓊脂糖微型凝膠、HATF00010硝酸纖維素膜(Millipore，美國)，CHI600-E電化學分析儀(CH公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1動物繁殖 ApoE-/-小鼠和Adamts13-/-小鼠合籠4周，繁殖產(chǎn)出Adamts13-/-ApoE-/-小鼠，當小鼠達到6周齡時，開始予以高脂肪的西方飲食喂養(yǎng)，共喂養(yǎng)12周。

1.2.2血液采集 于喂養(yǎng)12周結(jié)束時，采用3.9%的枸櫞酸鈉抗凝后管采集禁食4 h后的小鼠球后眶竇叢中的全血(200 μL)，在微型離心機上以10 000 r/min離心10 min，并將獲得的血漿存儲在-80 ℃冰箱，用于分析血脂水平。

1.2.3主動脈AS病變?nèi)旧?于喂養(yǎng)12周結(jié)束時，將小鼠(每組13只)處死，在解剖顯微鏡下，分離主動脈和心臟、用10%的中性福爾馬林固定液浸泡；用油紅O染色法及蘇木精-伊紅染色觀察主動脈AS病變程度[12]，用NIH ImageJ軟件進行量化分析。

1.2.4血漿VWF多聚體 向枸櫞酸鈉抗凝的血漿(0.1 μL)中加入70 mmol/L Tris HCL、2.4%十二烷基硫酸鈉、4%尿素、4 mmol/L EDTA，在pH6.5、60 ℃條件下加熱 20 min變性。變性后的樣品放在1.0% Seakem 基因水平轉(zhuǎn)移瓊脂糖微型凝膠中，以15 mA電流行2.5 h凝膠電泳后進行樣品分級。轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上后，將膜用Tris HCL與酪蛋白(20 mmol/L Tris HCL，pH 7.5，150 mmol/L NaCl和1%酪蛋白)封閉30 min。將膜與兔抗-VWF IgG抗體放入三羥甲基氨基甲烷緩沖液與酪蛋白(1 ∶1 500)中，以4 ℃孵育過夜，然后將用IRDyeCW800標記的山羊抗兔IgG抗體放入三羥甲基氨基甲烷緩沖液與酪蛋白(1 ∶12 500)中孵育1 h。應(yīng)用奧德賽成像系統(tǒng)(LI-COR)獲得熒光標記信號。

1.2.5血脂分析 檢測血漿總膽固醇、高密度脂蛋白和甘油三酯的水平。

1.3 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)使用Prism5 GraphPad 軟件進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)均為獨立重復(fù)3次后的結(jié)果。數(shù)據(jù)的兩兩比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 主動脈AS病變程度

油紅O染色及蘇木精-伊紅染色結(jié)果均顯示，與ApoE-/-小鼠比較，Adamts13-/-ApoE-/-小鼠的AS病變顯著增加。圖像分析結(jié)果顯示，與ApoE-/-小鼠比較，Adamts13-/-ApoE-/-小鼠主動脈AS病變相對表面積增加約5.5倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖1。

注：A、a、C為ApoE-/-小鼠，B、b、D為Adamts13-/- ApoE-/-小鼠，A、B箭頭為小鼠主動脈AS區(qū)域，C、D箭頭為AS區(qū)域(200×),a、b是A、B放大100倍的圖像；(1)與ApoE-/-比較，P<0.01。圖1 兩組小鼠主動脈AS病變組織學觀察和相對表面積測量圖Fig.1 Histological observation and relative surface area measurement of aortic atherosclerosis between the two groups

2.2 VWF多聚體分析

圖2A圖結(jié)果顯示，與ApoE-/-小鼠、或者野生型小鼠相比較，Adamts13-/-ApoE-/-和Adamts13-/-小鼠蛋白電泳條帶主要集中在UL-VWF多聚體一側(cè)。圖2B結(jié)果顯示，Adamts13-/-ApoE-/-小鼠UL-VWF與低分子量VWF多聚體比值與ApoE-/-小鼠、或者野生型小鼠的比值比較顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

注：A為Western blot電泳條帶，B為灰度直條帶；(1)與WT或ApoE-/-比較，P<0.01。圖2 VWF多聚體在不同老鼠之間的分布Fig.2 Distribution of VWF polypolymers among different mice

2.3 血脂分析

2組小鼠血漿中總膽固醇、甘油三酯、非高密度脂蛋白水平在ApoE-/-和Adamts13-/-ApoE-/-小鼠中的差異無統(tǒng)計學有意義(P>0.05)，而Adamts13-/-ApoE-/-小鼠血漿高密度脂蛋白水平高于ApoE-/-小鼠，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 ApoE-/- 和Adamts13 -/-ApoE-/-小鼠血脂測定結(jié)果/(g/L)Tab.1 Plasma leves of serum lipid in ApoE-/- and Adamts13-/- ApoE-/- Mice/(g/L)

3 討論

心血管疾病是全球死亡的主要原因，而AS則是心血管事件的主要因素。很多研究報道ADAMTS13與VWF異常是心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展的危險因素。Masri等[12]分別檢測了80例心肌梗死(AMI)患者入院時及入院的3～4 d后，36例3個月后隨訪患者的ADAMTS13及VWF水平，結(jié)果示VWF水平升高和ADAMTS13活性降低可能是AMI進展的關(guān)鍵因素。Schuppner等[13]做了一項前瞻性研究，納入41例大血管阻塞導致急性腦卒中患者，在治療前，癥狀發(fā)作后的第1、3、7、90天采集外周靜脈血檢測ADAMTS13水平，結(jié)果示ADAMTS13活性低是接受治療的缺血性腦卒中患者預(yù)后不良的指標。Putzer等[14]納入了重組組織纖溶酶原激活物的靜脈溶栓(IVT)治療后的43例急性缺血性中風患者，分別于治療前及癥狀發(fā)作后第1、3、7、90天檢測了血中ADAMTS13的活性并評估了早期神經(jīng)功能，結(jié)果示ADAMTS13活性與靜脈溶栓治療的急性缺血性中風患者的早期神經(jīng)功能改善相關(guān)。由此可見ADAMTS13在AS病變發(fā)生中可能起著作用，但其作用機制尚不明確。本研究結(jié)果顯示，與ApoE-/-小鼠比較，Adamts13-/-ApoE-/-小鼠的AS病變的形成顯著增加。提示Adamts13-/-ApoE-/-小鼠主動脈有更廣泛、更大面積的AS病變形成。證明ADAMTS13在遺傳易感性小鼠免于形成早期AS病變中起著至關(guān)重要的作用。

但本研究仍不能明確ADAMTS13保護ApoE-/-小鼠免于形成早期AS病變的機制，所以提出假設(shè)，血漿中ADAMTS13活性缺乏會導致內(nèi)皮細胞表面和血漿中UL-VWF多聚體的累積，同時也增加了血小板的黏附、聚集，血栓形成和全身炎癥反應(yīng)。為了判斷是否ApoE的缺乏加上高脂肪西方飲食喂養(yǎng)會進一步破壞了VWF的內(nèi)穩(wěn)態(tài)。本研究通過瓊脂糖凝膠電泳的方法描述血漿中VWF多聚體的分布。結(jié)果證明了敲除Adamts13基因會導致UL-VWF在血漿中的積累，但是ApoE基因缺失加上高脂肪西方飲食的喂養(yǎng)并沒有進一步破壞VWF的內(nèi)穩(wěn)態(tài)。VWF是至今為止被發(fā)現(xiàn)的唯一可以被ADAMTS13識別的底物，這也提示ADAMTS13可能通過降解UL-VWF，抑制AS病變形成。研究發(fā)現(xiàn)，在給予LDLR-/-VWF+/+和 LDLR-/-VWF-/-小鼠富含飽和脂肪和膽固醇的飲食，在高脂飲食8周后，在任何性別的LDLR-/-VWF-/-小鼠的主動脈竇中形成的脂肪條紋比LDLR-/-VWF+/+小鼠中的脂肪條帶少40%，招募的單核細胞也較少；而高脂飲食22周后(纖維斑塊早期階段)，在主動脈竇處病變大小的差異依然存在。VWF和白細胞之間的互相作用主要是通過內(nèi)皮細胞表面的VWF與白細胞P-選擇蛋白糖蛋白配體-1[15-16]，P-選擇蛋白，L-選擇蛋白[17-18]的相互聯(lián)系而被調(diào)節(jié)。P-選擇蛋白糖蛋白配體-1-/-小鼠在白細胞募集進入AS動脈壁時表現(xiàn)出選擇性損傷。抑制P-選擇蛋白完全消除了Adamts13-/-小鼠中的白細胞滾動，表明即使在存在內(nèi)皮VWF鏈的情況下也需要P-選擇蛋白開啟白細胞滾動。血小板黏附時連接GPIb-IX-V復(fù)合體可能導致血小板整合素GPⅡb-Ⅲa激活和血小板抗剪切力沉積。隨后由外向內(nèi)的信號傳導使細胞質(zhì)Ca2+含量增加，導致顆粒分泌和黏附在血小板周圍強效炎癥介質(zhì)釋放而促進AS的發(fā)展。在ApoE-/-小鼠中應(yīng)用血小板粘附抑制劑(Pop/B)抑制VWF與GPⅠbα的結(jié)合，防止活體小鼠的血小板黏附，導致白細胞在動脈內(nèi)膜極度減少，頸動脈分叉處、主動脈竇、冠狀動脈AS形成減少。證明VWF和血小板在促進全身及局部炎癥反應(yīng)和AS病變發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮作用[19-20]。這些數(shù)據(jù)提示在Adamts13-/-ApoE-/-小鼠中炎癥反應(yīng)的增加可能促進AS斑塊的形成。VWF、血小板、白細胞在早期AS病變發(fā)生中均起作用。

同時為了排除ADAMTS13蛋白酶解作用在膽固醇代謝中的潛在影響，用高脂肪西方飲食飼養(yǎng)12周后，測定了各組老鼠血漿中的總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇，非高密度脂蛋白膽固醇和甘油三酯數(shù)值。結(jié)果顯示，血漿中總膽固醇、非高密度脂蛋白膽固醇，和甘油三酯的水平在Adamts13-/-ApoE-/-小鼠和ApoE-/-小鼠中沒有顯著性差異，然而Adamts13-/-ApoE-/-小鼠血漿高密度脂蛋白膽固醇的水平高于ApoE-/-小鼠，這種差異具有統(tǒng)計學意義。在Adamts13-/-ApoE-/-小鼠中，HDL水平升高的作用機制尚未明確。在2組血脂的測定中只有高密度脂蛋白膽固醇的水平在Adamts13-/-ApoE-/-小鼠中是增加的，這表明了AS病變發(fā)病量的增加，不是因為膽固醇代謝異常的結(jié)果，而是ADAMTS13缺乏的直接影響結(jié)果。

綜上，ADAMTS13可能通過降解UL-VWF多聚體，抑制血小板聚集和炎癥反應(yīng)，從而減慢AS發(fā)展中的進程。