石國翠， 馬希剛

1河北滄州市人民醫(yī)院呼吸內科，滄州 0610002寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院重癥醫(yī)學科，銀川 750001

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是以中性粒細胞聚集和肺屏障通透性增加為病理特征的臨床綜合征。全球每年急性肺損傷的患病率為1.5/10萬～6.5/10萬，病死率約為32%～55%[1]。目前急性肺損傷的發(fā)病機制尚未明確，肺泡Ⅱ型上皮細胞(alveolar typeⅡepithelial cells，AEC-Ⅱ)是其重要病理部位。大量研究發(fā)現(xiàn)急性肺損傷時伴有AEC-Ⅱ的凋亡[2]，上皮細胞的凋亡破壞肺屏障的完整性，導致肺上皮屏障功能損傷。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是急性肺損傷早期的重要炎癥因子，參與其發(fā)生發(fā)展[3]。本研究主要觀察TNF-α對正常大鼠AEC-Ⅱ細胞增殖及凋亡的影響，探討TNF-α在急性肺損傷中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

大鼠AEC-Ⅱ購自上海拜力生物技術有限公司，重組大鼠TNF-α購自PEPROTECH公司，DME/F-12細胞培養(yǎng)液購自美國Hyclone公司，胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司，MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，DMSO購自美國Sigma公司，Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自上海貝博生物公司，大鼠IL-6 ELISA試劑盒購自武漢博士德生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 AEC-Ⅱ的復蘇與傳代培養(yǎng) 從液氮罐中取出凍存管(含AEC-Ⅱ)立即放入37℃水浴鍋中，迅速搖晃解凍。1000 r/min離心5 min，用含10%FBS的DME/F-12培養(yǎng)液重懸，并以1×106/mL的密度接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。光鏡下觀察AEC-Ⅱ生長狀態(tài)及形態(tài)。當細胞單層融合至90%時用含0.25%的胰蛋白酶消化傳代，取第3～6代細胞進行實驗。

1.2.2 實驗分組與處理 將細胞分為：對照組，用含10%FBS DME/F-12培養(yǎng)液與AEC-Ⅱ共培養(yǎng)；TNF-α不同濃度及不同時間干預組，分別用等體積的5、10、20、40 ng/mL TNF-α溶液與AEC-Ⅱ共培養(yǎng)24、48、72 h。均置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 透射電鏡鑒定及觀察細胞超微結構 收集生長狀況良好的AEC-Ⅱ，1000 r/min離心5 min，棄上清，用預冷的緩沖液重懸細胞，2%戊二醛4℃固定1 h，預冷緩沖液漂洗2次，乙醇逐步脫水，1%四氧鋨酸后固定，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，枸櫞酸鉛染色，透射電鏡下觀察。

1.2.4 MTT法測定細胞增殖情況 取對數(shù)生長期的AEC-Ⅱ，細胞計數(shù)調整細胞密度為0.5×105個/mL，以5000個/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄培養(yǎng)液，TNF-α各組每孔分別加入不同濃度TNF-α溶液200 μL，對照組加入等體積的完全培養(yǎng)液，每組設3個復孔，在37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)24、48、72 h。培養(yǎng)結束后，更換為無血清培養(yǎng)液，每孔加入1×MTT溶液20 μL及不含F(xiàn)BS的DME/F-12培養(yǎng)液90 μL，37℃避光溫育4 h，使MTT還原為甲瓚。棄上清，每孔加二甲基亞砜(DMSO)150 μL，平板搖床搖蕩10 min，于490 nm處測定吸光度值(A)，按公式計算細胞的增殖抑制率。細胞增殖抑制率(%)=(對照組A值-實驗組的A值)/對照組A值×100%。

1.2.5 流式細胞儀測定細胞凋亡率 將AEC-Ⅱ細胞接種于6孔板上，接種密度為2×105個/mL，貼壁24 h后按照上述分組進行處理，處理結束后用不含EDTA的胰酶消化后離心，冷PBS洗滌細胞，用1×Annexin Ⅴ結合液400 μL懸浮細胞，加入Annexin Ⅴ-FITC染色液5 μL，輕輕混勻后于2～8℃避光孵育15 min。加入10 μL PI染色液后輕輕混勻于2～8℃避光孵育5 min。1 h內送流式細胞儀檢測。

1.2.6 夾心ELISA法測定細胞上清液中IL-6的含量 收集上述各組細胞上清液，3000 r/min離心10 min，取上清。采用酶聯(lián)免疫法檢測，嚴格按照試劑盒操作說明進行，最后置于酶標儀450 nm波長處測定各孔A值，用標準品濃度及對應的A值(復孔均值)繪制標準曲線，計算IL-6的含量。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 電子顯微鏡下大鼠AEC-Ⅱ的超微結構

透射電鏡下可見細胞表面有長短不一的微絨毛，細胞核較大，胞質內含有大小不一的特征性板層小體，沿細胞核分布，數(shù)量不等，可看到不同的成熟階段(圖1)。

圖1 AEC-Ⅱ透射電鏡下的超微結構(箭頭所示為板層小體)Fig.1 Ultrastructure of AEC-Ⅱ under transmission electron microscope(lamellar bodies are indicated by arrows)

2.2 TNF-α對AEC-Ⅱ增殖的影響

不同濃度TNF-α相同作用時間下細胞增殖抑制率的比較：當作用時間為24 h時，TNF-α 40 ng/mL組細胞的增殖抑制率明顯高于其它濃度組(均P<0.05)；48 h、72 h時TNF-α各濃度組細胞的增殖抑制率與對照組比較均明顯升高(均P<0.05)，且隨著濃度的增加，對細胞增殖的抑制率也隨之上升，各濃度組之間差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。相同作用濃度不同作用時間下細胞增殖抑制率的比較：與24 h時比較，作用48、72 h時各濃度組細胞抑制率均明顯增加(均P<0.05)；TNF-α作用72 h后細胞的抑制率均較48 h明顯增加(均P<0.05)。見表1。

表1 TNF-α對AEC-Ⅱ增殖的影響Table 1 The effect of TNF-α on AEC-Ⅱ proliferation

同一作用時間不同TNF-α濃度組間比較：與對照組(TNF-α 0 ng/mL)比較，aP<0.05；與TNF-α 5 ng/mL組比較，bP<0.05；與TNF-α 10 ng/mL組比較，cP<0.05；與TNF-α 20 ng/mL組比較，dP<0.05。同一TNF-α濃度不同作用時間組間比較：與24 h組比較，*P<0.05；與48 h組比較，#P<0.05

2.3 TNF-α對AEC-Ⅱ凋亡的影響

作用時間24 h時，TNF-α 20 ng/mL組和TNF-α 40 ng/mL組的凋亡率與對照組比較明顯增加(均P<0.05)；在作用時間為48、72 h時，TNF-α的各濃度組AEC-Ⅱ細胞的凋亡率與對照組比較均明顯增加，且隨著濃度增加，細胞凋亡率逐漸增加，各濃度組之間差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。TNF-α各濃度組細胞的凋亡率隨作用時間的延長而增加，各組間差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見圖2。

與對照組比較，*P<0.05；相同作用時間下各濃度組間兩兩比較，▲P<0.05圖2 TNF-α對AEC-Ⅱ凋亡的影響Fig.2 Effect of TNF-α on AEC-Ⅱ apoptosis

2.4 TNF-α對AEC-Ⅱ細胞上清液中IL-6含量的影響

在TNF-α同一作用時間下，各濃度組間兩兩比較，TNF-α 40 ng/mL組IL-6水平較對照組及TNF-α 5 ng/mL組明顯升高(均P<0.05)，其余各濃度組間兩兩比較差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。在同一作用濃度下，各時間點組間兩兩比較，細胞上清液中IL-6的水平差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表2。

表2 TNF-α對體外培養(yǎng)的AEC-Ⅱ上清液中IL-6水平的影響Table 2 The effect of TNF-α on the level of IL-6 in the supernatant of AEC-Ⅱin vitro

3 討論

肺屏障主要由肺泡表面液體層、肺泡上皮細胞層、上皮基底膜層、肺泡上皮和毛細血管之間的間隙(基質層)、毛細血管基底膜、肺微血管內皮細胞層共同組成，維持肺內外氣體交換及液體平衡。肺泡上皮細胞是肺與外界環(huán)境進行氣體交換的物理屏障，主要由AEC-Ⅰ(占肺泡表面積的95%以上)和AEC-Ⅱ(合成和分泌表面活性物質)組成[4]。AEC-Ⅱ是肺泡上皮的祖細胞，可以自我增殖并分化為AEC-Ⅰ，促進肺泡的組織修復[5]。因此，AEC-Ⅱ對維持肺泡張力，防止肺泡萎陷及修復損傷的肺組織尤為重要。且研究發(fā)現(xiàn)，在AEC-Ⅱ受損時，即可導致肺水腫的形成，造成肺損傷[6]。故本研究選用AEC-Ⅱ作為研究對象，用透射電鏡鑒定，可見其胞漿豐富，含有不同成熟階段的板層小體，分布于細胞核的周圍。

TNF-α是肺損傷時介導炎癥反應的重要因子，主要由單核細胞、巨噬細胞等免疫細胞產(chǎn)生。在炎癥反應時，TNF-α過表達可以上調肺上皮及內皮細胞的炎癥介質及細胞凋亡相關基因表達，并促進免疫細胞的活化與凋亡[7]。本研究結果顯示：TNF-α與體外培養(yǎng)的大鼠AEC-Ⅱ共培養(yǎng)時，細胞的凋亡率明顯增加，且呈現(xiàn)時間-劑量依賴關系。說明急性肺損傷時，TNF-α誘導AEC-Ⅱ的凋亡，損傷肺泡組織。有研究顯示，AEC-Ⅱ的凋亡參與肺上皮屏障功能的破壞，導致細胞旁通透性增加，增加水分子及其他溶質分子通過細胞旁途徑進入肺泡內，引起肺水腫[8]。因此，ACE-Ⅱ細胞凋亡導致結構細胞數(shù)量減少，肺表面活性物質釋放減少，肺泡塌陷，肺組織病理變化加重，這可能與破壞了肺屏障的連續(xù)性及完整性，增加肺屏障的通透性有關。

在各種原因導致的急性肺損傷模型中，TNF-α參與調節(jié)細胞的增殖與分化、炎癥級聯(lián)反應，調節(jié)免疫功能[9-11]。研究證實，急性肺損傷時，TNF-α大量釋放，肺泡灌洗液中及血清中TNF-α的水平明顯升高[12-13]。過量的TNF-α可誘導炎性介質及細胞因子瀑布式釋放，加重肺部炎癥反應，導致肺損傷。因此，TNF-α在肺損傷的發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮關鍵性作用。本研究將TNF-α與AEC-Ⅱ共培養(yǎng)后測定細胞的增殖抑制率，結果顯示TNF-α作用24 h時，只有TNF-α 40 ng/mL組細胞的增殖抑制率高于對照組，當TNF-α作用時間延長至48 h、72 h時，TNF-α各組細胞的增殖均明顯受到抑制，說明TNF-α對細胞增殖的抑制作用與TNF-α的濃度及作用時間相關，濃度越高，作用時間越長，其對細胞的增殖抑制越明顯，這可能與TNF-α對細胞造成炎性損傷，并抑制細胞的有絲分裂有關。說明在急性肺損傷時，釋放入血的TNF-α刺激AEC-Ⅱ，誘導其凋亡，破壞肺屏障，導致肺損傷，進而使更多的炎性介質、液體、蛋白等滲透入肺泡，形成肺水腫，影響肺通氣及換氣功能，加重組織缺氧。同時過量釋放的TNF-α抑制AEC-Ⅱ的自我增殖，影響損傷肺組織的自我修復，從而進一步加重肺損傷。

此外，TNF-α是損傷時介導炎癥反應的重要因子，始動炎癥級聯(lián)反應和細胞因子瀑布效應。研究證實，在急性肺損傷時，大鼠肺泡灌洗液及血清中的IL-6的水平明顯升高[14]。研究認為這可能與TNF-α激活了NF-κB，促進炎癥因子的產(chǎn)生及釋放有關[15]。在本研究中，高濃度TNF-α組細胞上清液中IL-6的含量高于對照組及低濃度TNF-α組，說明TNF-α誘導IL-6水平的增加與TNF-α的作用濃度明顯相關，具有一定的劑量依賴效應。而在同一濃度條件下，作用時間的長短并不影響IL-6水平的改變。說明TNF-α單獨作用于AEC-Ⅱ時，IL-6升高與TNF-α的濃度相關，而與作用時間無明顯關系。

綜上，TNF-α通過誘導AEC-Ⅱ的凋亡，導致肺損傷，并通過抑制其增殖，阻礙損傷肺組織的自我修復；同時，高濃度TNF-α誘導IL-6水平的上調，加重肺部的炎癥反應，加重肺損傷。