張麗君，王 可，王藝璇，胡澤兵，李高志，石 菲，曹新生，張 舒

空軍軍醫(yī)大學 航空航天生物動力學教研室，航空航天醫(yī)學教育部重點實驗室，陜西西安 710032

人類在長期進化過程中，逐漸形成了與地球重力相適應的生理結構和功能，但在航天活動中，長期的失重狀態(tài)和航天飛行使航天員骨骼的骨鈣代謝水平發(fā)生進行性、累積性的變化[1-2]，進而導致骨密度下降和骨礦鹽含量的再分布。正常狀態(tài)下，成骨細胞介導的骨生成與破骨細胞介導的骨吸收之間維持平衡[3-4]，但在失重條件下這種平衡狀態(tài)被打破，表現(xiàn)為骨生成減少和骨吸收增多，其中成骨細胞的功能障礙成為失重性骨丟失的重要原因[5]。

miRNA 是一組長度為20 ～ 24 個核苷酸的非編碼RNA，可調節(jié)基因轉錄后的沉默，對細胞的分化、凋亡等功能至關重要。Runx2(Runt-related transcription factors 2) 是成骨譜系的關鍵調節(jié)因子，其表觀遺傳功能可調節(jié)骨相關基因的表達，研究已證實失重或模擬失重條件下Runx2 的表達明顯受抑制[6-7]，但其詳細機制仍未完全闡明。雖然已有研究報道模擬失重條件下多個miRNA 通過作用于不同的靶基因可調控成骨分化[8-11]，部分miRNA 也已通過小鼠在體成骨細胞靶向干預技術被證實可部分對抗失重性骨丟失，但以Runx2 為直接靶基因的miRNA 在模擬失重條件下的作用仍未見報道。利用生物信息學技術，在MC3T3-E1細胞中預測可能靶向調控Runx2 的miRNA 中篩選出重力敏感的miRNA，并以此miRNA 為干預靶點，有助于更直接地干預和緩解失重性骨丟失的發(fā)生。本實驗通過RAID 等數(shù)據(jù)庫預測出以Runx2 為靶向 的 4 條 miRNA， 即 miR-135a-5p、miR-137-3p、miR-205-5p 和miR-217-5p，并檢測了其在模擬失重條件下的變化。結果表明模擬失重條件下，在前成骨細胞MC3T3-E1 中miR-135a-5p 的表達明顯升高，且在失重72 h 之內與Runx2 的表達呈負相關，發(fā)現(xiàn)miR-135a-5p 可抑制Runx2 的表達，進一步證實了抑制miR-135a-5p 表達可部分緩解模擬失重對Runx2 的抑制作用，這為確定miR-135a-5p 為失重性骨丟失的小鼠在體靶向干預靶點提供了實驗依據(jù)。

材料與方法

1 材料 前成骨細胞系MC3T3-E1(ATCC 細胞庫)，α-mem 培養(yǎng)基(Gibco 公司)，胎牛血清( 四季青公司)，雙抗(Hyclone 公司)，胰蛋白酶(Millipore公司 )，miR-135a-5p mimic、inhibitor 和對照 ( 上海吉瑪制藥技術有限公司)，RNAiso 細胞裂解液，SYBR?Premix Ex TaqTM(TaKaRa 公 司 )，Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit、Prime Script?RT reagent Kit，PCR 引物( 上海生工生物工程股份有限公司)，RIPA 細胞裂解液，PSMF，預制膠( 美國Invitrogen 公司)，電泳緩沖液( 美國Invitrogen公司 )， 轉膜緩沖液 ( 美國 Invitrogen 公司 )， 一抗稀釋液 ( 碧云天 )，PVDF 膜 ( 美國 Invitrogen 公司 )，BCA 蛋白定量試劑盒 ( 美國 Sigma 公司 )，堿性磷酸酶測試盒( 南京建成生物工程研究所)，2D-RWVs 回轉器( 中國航天員科研訓練中心)，超凈工作臺( 天津泰斯特儀器有限公司)，qRT-PCR儀 ( 美國 Bio-Rad 公司 )。

2 細胞培養(yǎng) 將前成骨細胞系MC3T3-E1 在含有10% 血清和1% 雙抗的α-mem 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并置于37℃，5% CO2的孵箱中，2 d 換1 次液，待細胞匯合度到達90% 時，使用胰蛋白酶進行傳代培養(yǎng)。選取3 ～ 6 代呈對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

3 模擬失重 在超凈臺中將細胞匯合度達90% 的細胞傳代至回轉瓶中，并置于37℃孵箱中培養(yǎng)。待6 ～ 8 h 細胞貼壁后，用含有10% 血清和1% 雙抗的α-mem 培養(yǎng)基灌滿回轉瓶，直立放入37℃孵箱過夜。然后將回轉瓶中的氣泡完全排盡，放回轉器上進行回轉，回轉半徑為1.5 cm，轉速為24 r/min，獲得的細胞為失重組(MG)。對照組(CON)置入37℃孵箱中普通培養(yǎng)。

4 細胞轉染 采用Lipofectamine 2000 脂質體進行轉染。在超凈臺中將miR-135a-5p 的mimic 或inhibitor 的凍干粉加雙蒸水進行稀釋，并分裝備用。在超凈臺中將細胞匯合度達90% 的細胞傳代至六孔板中，并使用含10% 血清，無雙抗的α-mem培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細胞匯合度達60% ～ 70% 時進行轉染。吸取250 μl Opti-MEM 培養(yǎng)基，在其中加入4 μl Lipofectamine 2000 脂質體，再次吸取250 μl Opti-MEM 培養(yǎng)基，分別加入各4 μl mimic、mimic-NC 稀釋存儲液及 10 μl inhibitor、inhibitor-NC 稀釋存儲液，靜置5 min，將兩者混合均勻并靜置20 min。然后將混合后的溶液隨機加入六孔板中，并在每個孔中加入2 ml 無血清無雙抗的α-mem培養(yǎng)基，于37℃孵箱中培養(yǎng)。6 h 后，換含10%血清，無雙抗的α-mem 普通培養(yǎng)基，待細胞匯合度達90% 時換誘導培養(yǎng)基，48 h 后提取所需材料。

5 實時熒光定量PCR 使用RNAiso 裂解細胞提取細胞總RNA，采用SYBR Green 熒光染料法進行PCR 擴增。miRNA 檢測：采用Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit 逆轉錄合成cDNA，以U6 為內參擴增 miRNA。mRNA 檢測 ：采用 PrimeScript?RT Master Mix reagent Kit 逆轉錄合成 cDNA， 以GAPDH 為內參擴增mRNA。數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法進行相對定量分析。PCR 引物序列見表1。

表 1 引物序列Tab. 1 Primer sequences

6 Western blot檢測 提取MC3T3-E1細胞總蛋白，加入RIPA 細胞裂解液和蛋白酶抑制劑，超聲粉碎細胞，通過BCA 法測定蛋白質濃度，并加入上樣緩沖液95℃加熱10 min。電泳時使用預制膠，每孔上樣量為30 μl，先恒壓90 V 電泳30 min，后恒壓120 V 電泳90 min，常規(guī)轉膜，5% 的脫脂牛奶封閉 4 h，分別加入 Runx2 和 GAPDH 抗體 (1 ：1 000)4℃孵育過夜。第2 天用TBST 在搖床上洗膜3 次，每次10 min。然后將膜放入羊抗兔二抗(1 ：5 000)中孵育60 min，使用TBST 在搖床上洗膜3 次，每次10 min。通過使用ECL 發(fā)光液進行發(fā)光并拍攝照片，用Image J 軟件分析所拍攝條帶灰度值并計算蛋白相對含量。

7 生物信息學方法 通過RNAinter 網站預測出與Runx2 相關的miRNA，并根據(jù)分數(shù)的大小從高到低排序，選取分數(shù)大于0.95 且文獻中未被報道過的miRNA 進行下一步研究。

8 統(tǒng)計學方法 全部數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 軟件進行分析，兩樣本間的比較采用獨立樣本t檢驗，多樣本比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 生物信息學預測與Runx2 具有結合位點的4 條miRNA 為篩選可直接調控Runx2 的miRNA，以便以此miRNA 作為失重性骨丟失的小鼠在體靶向干預靶點，我們使用RNAinter 網站預測出與Runx2 相關分數(shù)大于 0.95 的 miRNA， 通過閱讀文獻和PCR 檢測，篩選出目前無明確報道且在MC3T3-E1 細胞中表達量較高的4 條miRNA，即miR-135a-5p、miR-137-3p、miR-205-5p 和 miR-217-5p( 表 2)。

2 模擬失重條件下MC3T3-E1 細胞miRNA 的表達變化 為了檢測這4 條miRNA 是否對重力變化敏感，我們將前成骨細胞MC3T3-E1 放入2D 回轉器中模擬失重培養(yǎng)48 h，采用PCR 方法檢測miR-135a-5p、miR-137-3p、miR-205-5p 和 miR-217-5p 的表達情況。結果顯示，與對照組相比，模擬失重組miR-135a-5p 表達顯著上調(P＜0.05)，而miR-137-3p、miR-205-5p 和 miR-217-5p 的表達無顯著變化( 圖1)。

3 模擬失重72 h 內MC3T3-E1 細胞miR-135a-5p 表達變化 為了進一步了解對重力變化敏感的miR-135a-5p 在模擬失重條件下的變化特點，我們分別檢測了模擬失重24 h、48 h 和72 h 后miR-135a-5p 的表達變化。結果顯示，與對照組相比，miR-135a-5p 在模擬失重24 h 即出現(xiàn)上調，且顯著上調可持續(xù)到72 h(P＜0.05 或P＜0.01)( 圖2)。

表 2 miRNA 序列Tab. 2 miRNA sequences

圖 1 模擬失重48 h后MC3T3-E1細胞miRNA的表達Fig.1 Expression levels of miRNAs in MC3T3-E1 cells cultured in simulated microgravity for 48 h (aP ＜0.05, vs CON group)

圖 2 模擬失重72 h MC3T3-E1細胞miR-135a-5p的表達變化Fig.2 Expression levels of miR-135a-5p in MC3T3-E1 cells cultured in simulated microgravity for 72 h (aP ＜ 0.05, bP ＜ 0.01, vs CON group)

圖 3 模擬失重72 h MC3T3-E1細胞中Runx2的表達變化A：qRT-PCR檢測模擬失重后 Runx2 mRNA水平的表達；B：Western blot檢測模擬失重后Runx2蛋白水平的表達Fig.3 Expression levels of Runx2 in MC3T3-E1 cells cultured under microgravity for 72 h A: mRNA expression of Runx2 by qRT-PCR under microgravity; B: Protein levels of Runx2 by Western blotting under microgravity (bP ＜0.01, vs CON group)

4 模擬失重 72 h 內 miR-135a-5p 與 Runx2 的表達呈負相關 為了進一步探討模擬失重條件下重力敏感的miR-135a-5p 是否與Runx2 的表達呈相關性。我們檢測了模擬失重72 h 內Runx2 的mRNA表達及蛋白水平。結果顯示，與對照組相比，Runx2 在模擬失重24 h 即出現(xiàn)mRNA 和蛋白水平的明顯下調，且顯著下調可持續(xù)到72 h(P＜0.05或P＜0.01)。提示模擬失重72 h 內miR-135a-5p與Runx2 的表達呈負向關聯(lián)關系( 圖3)。

圖 4 轉染miR-135a-5p mimic或inhibitor后Runx2的表達變化A：qRT-PCR檢測轉染miR-135a-5p對Runx2 mRNA表達的影響； B：Western blot檢測轉染miR-135-5p對Runx2蛋白表達的影響Fig.4 Expression levels of Runx2 in MC3T3-E1 cells transfected with miR-135a-5p mimic, inhibitor and negative control A: mRNA expression of Runx2 by qRT-PCR after transfection; B: Protein levels of Runx2 by Western blotting after transfection (bP ＜0.01, vs CON group)

5 miR-135a-5p 可 調 控 Runx2 的 蛋 白 表 達MC3T3-E1 細胞轉染 mimic 或 inhibitor 后 Runx2 的mRNA 水平未發(fā)生明顯變化，Western blot 結果顯示Runx2 蛋白表達分別顯著降低或升高(P＜0.01)。驗證了miR-135a-5p 可通過抑制Runx2 的蛋白翻譯過程調控Runx2 的表達( 圖4)。

6 miR-135a-5p 可部分緩解模擬失重條件Runx2 的 表 達 降 低 miR-135a-5p inhibitor 轉 染MC3T3-E1 細胞，并在模擬失重條件下培養(yǎng)48 h，通過PCR結果顯示，轉染miR-135a-5p inhibitor后，qRT-PCR 技術結果顯示Runx2 的mRNA 表達水平未發(fā)生明顯變化，Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)Runx2 的蛋白表達分別顯著降低或升高(P ＜0.01)。提示抑制內源性miR-135a-5p 的表達部分緩解了模擬失重對Runx2 蛋白表達的抑制作用( 圖5)。

圖 5 轉染miR-135a-5p mimic 或inhibitor 后模擬失重48 h MC3T3-E1細胞中Runx2的表達變化A：qRT-PCR檢測模擬失重后 Runx2 mRNA水平的表達；B：Western blot檢測模擬失重后Runx2蛋白水平的表達Fig.5 Expression levels of Runx2 in MC3T3-E1 cells transfected with miR-135a-5p mimic, inhibitor and negative control under microgravity for 48 h A: mRNA expression of Runx2 by qRT-PCR under microgravity; B: Protein levels of Runx2 by Western blotting under microgravity (bP ＜0.01, vs CON group)

討 論

為了篩選靶向Runx2 的具有重力敏感性的miRNA，為失重性骨丟失的在體靶向干預提供研究靶點，本實驗通過RNAinter 預測出4 條與重要的成骨調節(jié)因子Runx2 具有結合位點的miRNA，并通過2D 回轉器模擬失重處理MC3T3-E1 細胞。結果發(fā)現(xiàn)4 條miRNA 中miR-135a-5p 表達上調，并且進一步證實了miR-135a-5p 在模擬失重72 h內穩(wěn)定上調，且與Runx2 的表達呈負向關聯(lián)關系。已有文獻報道，miR-135a-5p 可直接作用于Runx2的3’UTR 區(qū)，調節(jié)Runx2 的表達[12]。我們的實驗對 MC3T3-E1 細 胞中 miR-135a-5p 與 Runx2 的調控關系進行了驗證，即向MC3T3-E1 中轉染了miR-135a-5p mimic 或 inhibitor， 結果發(fā)現(xiàn) Runx2的mRNA 水平無明顯變化，而蛋白表達分別下調和上調，驗證了miR-135a-5p 可通過抑制Runx2的蛋白翻譯調控Runx2 的表達，并進一步證實抑制miR-135a-5p 的表達可部分緩解模擬失重條件下Runx2 蛋白水平的下調，提示模擬失重條件下miR-135a-5p 可部分調控Runx2 的表達，但Runx2可能還受到其他機制的調控。

骨對力學刺激十分敏感，其結構和功能都與力學變化密切相關[13-14]。骨骼除承受包括肌肉收縮在內的機械應力直接作用外，骨骼細胞還受到通過場力方式直接作用的重力調控，正常的力學狀態(tài)對維持骨形成和骨吸收的動態(tài)平衡至關重要。在航天失重環(huán)境中，應力和場力作用的顯著減少，使得這種動態(tài)平衡被打破，表現(xiàn)為骨形成減少，骨吸收增加，骨小梁變薄，且隨著航天飛行的時程增加，承重骨的骨鈣代謝水平發(fā)生進行性累積性的變化，骨密度以平均每個月1% ～ 2% 的速率降低[15]，航天失重環(huán)境引起的鈣磷代謝負平衡在返回地面后也較難恢復且沒有自限性，這導致失重性骨丟失成為困擾人類長期太空飛行的主要醫(yī)學問題之一。目前對失重性骨丟失的具體機制仍未完全闡明，研究表明成骨細胞介導的骨形成能力下降在失重性骨丟失中發(fā)揮重要的作用。

miRNA 是一類廣泛存在的，長度約為22 nt 的單鏈內源性非編碼RNA，其可以與靶基因的mRNA的3’UTR 區(qū)或編碼區(qū)序列結合，抑制其翻譯或促進mRNA 的降解，進而調控靶基因的表達[16]。已有多個研究證實，miRNA 可調控成骨細胞的功能。miR-214 通過靶向ATF4 抑制成骨細胞活性[17]；miR141 和miR-200 在MC3T3-E1 細胞中通過抑制成骨轉錄因子Dlx5 的表達，抑制成骨細胞的分化[18]；miR-218 可抑制Wnt 信號通路負調控因子硬化蛋白的表達，而Wnt 信號通路配體Wnt3a 可誘導miR-218 的形成，miR-218 與Wnt 信號通路形成一個循環(huán)，刺激Wnt 信號通路的激活，調控成骨細胞的分化[19]。Runx2 是成骨細胞分化過程中的重要的轉錄因子[20]，其可受到多個miRNA 的調控[21]，如在間充質祖細胞中miR-204 和miR-211 可結合于 Runx2 的 3’UTR 區(qū)進而抑制 Runx2 的表達，使得間充質干細胞由向成骨細胞分化轉化為向脂肪細胞的分化[22]。失重對成骨細胞中Runx2 的抑制作用已成為公認事實，我們課題組的前期研究已證實模擬失重條件下miR-132-3p、miR-33-5p、miR-103 及miR-139-3p[8-11]可分別通過不同的靶基因調控成骨細胞的功能，并通過在體成骨細胞靶向干預技術證實miR-132-3p、miR-33-5p 及miR-139-3p 可部分對抗小鼠的失重性骨丟失。為了進一步提高在體靶向干預效果，選擇直接靶向Runx2 的miRNA 為干預靶點值得進一步研究。但目前模擬失重條件下與直接調控Runx2 有關的miRNA 的研究報道較少。

本研究中，我們所篩選出的重力敏感性miR-135a-5p 與成骨作用密切相關。有文獻提出，在成纖維細胞中成纖維細胞生長因子18 可通過下調miR-135a-5p 的表達促進其礦化[23]，miR-135a-5p 也與脂肪源干細胞的成骨分化有關[24]，miR-135a-5p 還可直接作用于 Runx2 的 3’UTR 區(qū)調節(jié)成骨分化[12]。我們的實驗驗證了miR-135a-5p和Runx2 在MC3T3-E1 細胞的調控關系，并發(fā)現(xiàn)miR-135a-5p 在模擬失重條件下表達升高并且與Runx2 的蛋白表達呈負相關，轉染miR-135a-5p inhibitor 可部分緩解模擬失重下Runx2 的蛋白表達降低。這些均表明miR-135a-5p 有望作為一個潛在的細胞內干預靶點，通過在體靶向研究技術，直接調控成骨細胞Runx2 的表達對抗失重性骨丟失。

綜上，本實驗通過RNAinter 預測靶向Runx2的4 條miRNA，并檢測了其在模擬失重條件下的變化，結果發(fā)現(xiàn)miR-135a-5p 在模擬失重72 h 內顯著上調且與Runx2 的蛋白表達呈負相關，驗證了在MC3T3-E1 細胞中miR-135a-5p 可調控模擬失重條件下Runx2 的表達。本實驗為確定miR-135a-5p 作為細胞內干預靶點，開展失重性骨丟失的小鼠在體靶向干預研究提供了實驗依據(jù)。