梁甲武，胡 巍，屈 爽，袁一方，郭 斌

解放軍醫(yī)學(xué)院/ 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 口腔科，北京 100853

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有多向分化和自我更新能力，其促進(jìn)組織動(dòng)態(tài)平衡和損傷修復(fù)方面的作用越來越受到重視[1]。然而，近年來研究發(fā)現(xiàn)，隨著年齡增長(zhǎng)，MSCs 的再生能力下降，細(xì)胞功能出現(xiàn)障礙[2]。增齡對(duì)于MSCs 細(xì)胞命運(yùn)的具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚。通過探索增齡調(diào)控MSCs 細(xì)胞命運(yùn)的具體機(jī)制，從而實(shí)現(xiàn)延緩甚至逆轉(zhuǎn)MSCs 衰老，成為未來的發(fā)展方向。環(huán)狀RNA(circular RNAs，circRNAs) 是一類反向剪接形成的閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼小RNA，與微小RNA(microRNAs，miRNAs) 內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合是circRNAs 的主要生物學(xué)功能之一。CircRNAs通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNAs，解除miRNAs 對(duì)靶基因的抑制作用，進(jìn)而促進(jìn)靶基因表達(dá)。目前研究發(fā)現(xiàn)，circRNAs 在組織器官發(fā)育和疾病發(fā)展等多個(gè)領(lǐng)域均發(fā)揮調(diào)控作用[3-4]。但circRNAs 在干細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的研究相對(duì)較少，對(duì)MSCs 的細(xì)胞命運(yùn)影響仍待深入探索。本研究通過運(yùn)用多種生物信息學(xué)方法，對(duì)成人與胎兒來源MSCs 的circRNAs差異表達(dá)譜進(jìn)行分析， 并通過基因本體(Gene Ontology) 注釋和 KEGG 通路 (KEGG pathway) 分析對(duì)circRNAs 可能發(fā)揮作用的信號(hào)通路進(jìn)行預(yù)測(cè)，探究circRNAs 在增齡調(diào)控MSCs 細(xì)胞命運(yùn)中的作用，為延緩甚至逆轉(zhuǎn)MSCs 衰老提供新的理論依據(jù)。

材料與方法

1 circRNA 微陣列數(shù)據(jù)及數(shù)據(jù)分析 本研究中使用的circRNA 微陣列數(shù)據(jù)GSE122178 從Gene Expression Omnibus(GEO) 數(shù) 據(jù) 庫(kù) (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) 下載，獲得了來源于成人與新生兒MSCs 的 circRNAs 表達(dá)譜。GSE122178 數(shù)據(jù)集包括3 例成人骨髓來源的MSCs 樣本(GSM3457280、GSM3457281、GSM3457282)、3 例 圍 生 期 新生兒臍帶血來源的MSCs 樣本(GSM3457283、GSM3457284、GSM3457285)。采用 GEO2R 在線分析工具對(duì)上述兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并對(duì)差異表達(dá)circRNAs 進(jìn)行篩選。

2 miRNAs 結(jié)合位點(diǎn)及下游靶基因預(yù)測(cè) 利用CircInteractome 在線工具預(yù)測(cè)circRNAs 的miRNAs結(jié)合位點(diǎn)， 并根據(jù) Context+score percentile 評(píng)分對(duì)預(yù)測(cè)位點(diǎn)進(jìn)行篩選。之后聯(lián)合應(yīng)用miRDB 和Targetscan 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)下游靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，并通過韋恩分析檢測(cè)出共表達(dá)的靶基因。

3 GO 注釋和KEGG 分析 GO 注釋將基因功能分為生物過程(BP)、細(xì)胞成分(CC) 和分子功能(MF)三個(gè)部分。應(yīng)用DAVID 在線工具對(duì)共表達(dá)的靶基因進(jìn)行GO 注釋和KEGG 分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)量數(shù)據(jù)以-x±s表示。以P＜0.05 作為 mRNAs 差異表達(dá)、GO 注釋和 KEGG 分析的標(biāo)準(zhǔn)。以 |Fold change| ＞ 2 且P＜ 0.05 作為circRNAs 顯著差異表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)。

結(jié) 果

1 成人與新生兒來源的MSCs 差異表達(dá)的circRNAs 基因芯片微陣列分析顯示，圍生期新生兒臍帶血來源的MSCs 與成人骨髓來源的MSCs 相比，存在4 140 個(gè)不同程度差異表達(dá)的circRNAs，其中66 個(gè)circRNA 表達(dá)顯著上調(diào)，107個(gè)circRNAs 表達(dá)顯著下調(diào)( 圖1)。在表達(dá)上調(diào)和下調(diào)變化中，最為顯著的分別是hsa_circ_0080170和hsa_circ_0060055。

2 hsa_circ_0080170 和 hsa_circ_0060055 下 游miRNAs 及靶基因預(yù)測(cè) 利用CircInteractome 對(duì)差異表達(dá)最顯著的hsa_circ_0080170 和hsa_circ_0060055 的miRNAs 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示，hsa_circ_0080170 具有 6 個(gè) miRNAs 結(jié)合位點(diǎn)，hsa_circ_0060055 具有 28 個(gè) miRNAs 結(jié)合位點(diǎn)。通過進(jìn)一步參考Context+score percentile評(píng)分，最終各篩選出2 個(gè)miRNAs 進(jìn)行下一步功能分析預(yù)測(cè)( 表1)。聯(lián)合運(yùn)用miRDB 和Targetscan數(shù)據(jù)庫(kù)分別預(yù)測(cè)hsa-miR370、hsa-miR203a、hsamiR1225-5p 和hsa-miR197 可能調(diào)控的下游靶基因，并將2 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行韋恩分析。結(jié)果顯示，hsa-miR370 有 551 個(gè)靶基因，hsamiR230a 有 163 個(gè)靶基因，hsa-miR1225-5p 有 180個(gè)靶基因，hsa-miR197 有411 個(gè)靶基因( 圖2)。

表 1 hsa_circ_0080170 和 hsa_circ_0060055 的 miRNAs結(jié)合位點(diǎn)Tab. 1 miRNAs binding sites of hsa_circ_0080170 and hsa_circ_0060055

3 GO 注釋 和 KEGG 分 析 利 用 DAVID 對(duì) hsamiR370 的 551 個(gè)靶基因和 hsa-miR230a 的 163 個(gè)靶基因進(jìn)行GO 功能注釋，結(jié)果顯示靶基因在94個(gè)GO 項(xiàng)中富集(P＜0.05)，多涉及基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和干細(xì)胞的分化及干性維持。hsa-miR1225-5p的180 個(gè)靶基因和hsa-miR197 的411 個(gè)靶基因的GO 注釋結(jié)果顯示，靶基因在58 個(gè)GO 項(xiàng)中富集(P＜0.05)，多與基因表達(dá)調(diào)控和組織再生相關(guān)。兩組GO 注釋結(jié)果中的前10 個(gè)重要富集項(xiàng)以生物過程、細(xì)胞組分和分子功能為分類在圖3 和圖4中顯示。基于GO 注釋的結(jié)果，對(duì)hsa-miR370 和hsa-miR203a 的714 個(gè)預(yù)測(cè)靶基因進(jìn)行KEGG 通路分析，結(jié)果顯示所選靶基因與包括多能干細(xì)胞調(diào)控通路和Ras 信號(hào)通路在內(nèi)的31 條信號(hào)通路相關(guān)(P＜0.05)( 圖5)。此外，KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn)與hsamiR1225-5p 和 hsa-miR197 的 591 個(gè)預(yù)測(cè)靶基因相關(guān)的17 條信號(hào)通路，包括肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控通路和泛素介導(dǎo)的蛋白水解等與干細(xì)胞命運(yùn)調(diào)控相關(guān)的信號(hào)通路( 圖6)。

圖 1 3 例成人骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞樣本(GSM3457280、GSM3457281、GSM3457282) 和3 例圍生期新生兒臍帶血來源的間充質(zhì)干細(xì)胞樣本(GSM3457283、GSM3457284、GSM3457285)的circRNAs表達(dá)譜A：熱圖； B：火山圖Fig. 1 circRNAs expression profiles of 3 adult bone marrow-derived mesenchymal stem cells (GSM3457280, GSM3457281,GSM3457282) and 3 perinatal neonatal umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells (GSM3457283,GSM3457284, GSM3457285) were analyzed A: heat map; B: vocano plot

圖 2 hsa-miR230a、hsa-miR370、hsa-miR197和hsa-miR1225-5p各自的miRDB和Targetscan數(shù)據(jù)庫(kù)的下游靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果及韋恩分析Fig. 2 Prediction results and Venn analysis of downstream target genes in the respective miRDB and Targetscan databases of hsa-miR230a,hsa-miR370, hsa-miR197 and hsa-miR1225-5p

討 論

圖 3 hsa-miR370和hsa-miR203a的預(yù)測(cè)靶基因的前10項(xiàng)重要富集項(xiàng)以生物過程(BP)、細(xì)胞組分(CC)和分子功能(MF)為分類展示Fig. 3 The top 10 enriched gene ontology (GO) terms of the predicted target genes of hsa-miR370 and hsa-miR203a under the three main GO categories (BP: biological process; CC: cellular component; MF: molecular function)

圖 4 hsa-miR1225-5p和hsa-miR197的預(yù)測(cè)靶基因的前10項(xiàng)重要富集項(xiàng)以生物過程(BP)、細(xì)胞組分(CC)和分子功能(MF)為分類展示Fig. 4 The top 10 enriched gene ontology (GO) terms of the predicted target genes of hsa-miR1225-5p and hsa-miR197 under the three main GO categories (BP: biological process; CC: cellular component; MF: molecular function)

圖 5 hsa-miR370和hsa-miR203a的預(yù)測(cè)靶基因的前10條重要KEGG通路Fig. 5 The top 10 significant KEGG pathways of the predicted target genes of hsamiR370 and hsa-miR203a

圖 6 hsa-miR1225-5p和hsa-miR197的預(yù)測(cè)靶基因的前10條重要KEGG通路Fig. 6 The top 10 significant KEGG pathways of the predicted target genes of hsamiR1225-5p and hsa-miR197

circRNAs 不具有5' 末端帽子和3' 末端poly(A)尾結(jié)構(gòu)，以外顯子環(huán)化或內(nèi)含子環(huán)化的方式成環(huán)。最初circRNAs 發(fā)現(xiàn)于植物類病毒中，并被認(rèn)為是低豐度和技術(shù)限制造成的剪接錯(cuò)誤的副產(chǎn)品[5]。直到近幾年，伴隨著高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)的快速發(fā)展，circRNAs 的結(jié)構(gòu)和功能才逐步被發(fā)現(xiàn)。目前研究發(fā)現(xiàn)，circRNAs 由于特殊的環(huán)形結(jié)構(gòu)，具有高度保守性、不易被核酸外切酶降解等特點(diǎn)[6-7]。同時(shí)，隨著對(duì)circRNAs 功能的深入研究，circRNAs 的海綿機(jī)制( 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNAs)、與RNA 結(jié)合蛋白相互作用、參與蛋白質(zhì)翻譯、調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄等功能已陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。此外，研究人員已發(fā)現(xiàn)circRNAs 在口腔癌[8]、心血管疾病[9]、骨關(guān)節(jié)炎[10]等疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用，而且還會(huì)參與調(diào)控骨形成能力[11]、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和衰老[3]等生理過程。近期，關(guān)于circRNAs 對(duì)間充質(zhì)細(xì)胞影響的研究也逐漸增多。Wang 等[12]發(fā)現(xiàn)，CDR1as 可通過海綿吸附miR-7，激活ERK 信號(hào)通路，促進(jìn)LPS 誘導(dǎo)炎癥條件下的牙周膜干細(xì)胞增殖。hsa_circ_0074834 可通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA-942-5p 調(diào)控ZEB1 和VEGF 的表達(dá)，以及促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，進(jìn)而促進(jìn)骨缺損修復(fù)，有望成為骨不連的關(guān)鍵治療靶點(diǎn)[13]。

近年來，已有多項(xiàng)研究表明，增齡至少會(huì)影響MSCs 的部分功能。Du 等[14]發(fā)現(xiàn)，源自18 ～ 20歲、30 ～ 35 歲、45 ～ 50 歲三個(gè)不同年齡段捐贈(zèng)者的牙周膜干細(xì)胞之間，細(xì)胞集落形成率、細(xì)胞周期和凋亡情況以及堿性磷酸酶活性存在顯著差異。隨著年齡的增長(zhǎng)，牙周膜干細(xì)胞的集落形成能力下降，G2/S 期細(xì)胞減少，細(xì)胞凋亡增加，成骨分化能力下降。此外，陳裕浩等[15]發(fā)現(xiàn)，與源于幼年雄性獼猴的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比，源于老年雄性獼猴的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)呈寬大、扁平形，細(xì)胞增殖緩慢，成骨、成軟骨及成脂分化能力下降， 伴隨著 IL-1β、IL-4、IL-6 和 TNF-α等細(xì)胞因子表達(dá)降低。然而，目前關(guān)于circRNAs在增齡對(duì)于MSCs 細(xì)胞命運(yùn)的調(diào)控機(jī)制中發(fā)揮的作用少有研究。

本研究在GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索出建立于2019 年的關(guān)于circRNAs 在成人與新生兒來源MSCs 的circRNAs 差異表達(dá)數(shù)據(jù)集GSE122178，并對(duì)其中的3 例成人骨髓來源的MSCs 樣本和3 例圍生期新生兒臍帶血來源的MSCs 樣本進(jìn)行GEO2R 在線分析，獲得顯著上調(diào)的hsa_circ_0080170 和顯著下調(diào)的 hsa_circ_0060055。 同時(shí)， 對(duì) hsa_circ_0080170和hsa_circ_0060055 的下游miRNAs 及靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，初步形成circRNA-miRNA-mRNA 關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。并且KEGG 分析發(fā)現(xiàn)，hsa-miR370 和hsa-miR203a作為hsa_circ_0080170 的下游miRNAs 結(jié)合位點(diǎn)，顯著富集到31 條信號(hào)通路；hsa-miR1225-5p 和hsa-miR197 作為hsa_circ_0060055 的下游miRNAs結(jié)合位點(diǎn)，顯著富集到17 條信號(hào)通路。其中多條信號(hào)通路與干細(xì)胞分化及干性維持相關(guān)。因此，根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果，預(yù)測(cè)hsa_circ_0080170和hsa_circ_0060055 可能在增齡調(diào)控MSCs 細(xì)胞命運(yùn)中發(fā)揮作用，具體作用機(jī)制待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本研究通過探究circRNAs 在增齡調(diào)控MSCs 細(xì)胞命運(yùn)中的作用，為進(jìn)一步探索延緩間充質(zhì)細(xì)胞衰老的調(diào)控機(jī)制提供了新的理論依據(jù)。