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(麻城市人民醫(yī)院泌尿外科，湖北　麻城　438300)

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增齡對(duì)大鼠陰莖海綿體內(nèi)硫化氫信號(hào)通路的影響

曾鋒杜從林1海波2羅振國1遲寶進(jìn)1桂士良1

(麻城市人民醫(yī)院泌尿外科，湖北麻城438300)

〔摘要〕目的研究增齡對(duì)大鼠陰莖海綿體組織中硫化氫(H2S)信號(hào)通路的影響從而進(jìn)一步明確老年性勃起功能障礙(ED)的發(fā)病機(jī)制。方法隨機(jī)分別挑選3、9、18月齡雄性健康Wistar大鼠(相同月齡組體重相近)各10只并按3、9、18月齡依次分為A、B、C組。三組適應(yīng)性喂養(yǎng)2 w后行陰莖海綿體內(nèi)壓/平均頸動(dòng)脈壓(ICPmax/MAP)值的檢測，而后采血以測定血漿H2S濃度，處死大鼠取陰莖組織以檢測陰莖組織H2S含量及生成率，各組陰莖海綿體組織內(nèi)胱硫醚-β-合成酶(CBS)與胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)的含量用Western印跡法測出。結(jié)果隨著月齡增長，ICPmax/MAP(5、7 V)值均依次顯著減小(P<0.05)，血漿H2S濃度、陰莖海綿體組織H2S含量及生成率均依次顯著性降低(P<0.05)，陰莖組織內(nèi)CSE和CBS的含量也分別明顯減低(P<0.05)。結(jié)論增齡中，大鼠陰莖組織內(nèi)CSE和CBS表達(dá)減弱，內(nèi)源性H2S減少，這可能是大鼠老年性ED致病機(jī)制之一。

〔關(guān)鍵詞〕硫化氫；胱硫醚-β-合成酶；增齡；胱硫醚-γ-裂解酶；勃起功能障礙

勃起功能障礙(ED)的發(fā)病與諸多因素如老齡、糖尿病、前列腺疾病、高血壓等密切相關(guān)〔1〕。關(guān)于老年性ED的發(fā)病機(jī)制除了與陰莖組織內(nèi)一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)含量下降有關(guān)外，老年性ED大鼠陰莖海綿體中內(nèi)源性硫化氫(H2S)含量下降也是其發(fā)病原因之一〔2〕。內(nèi)源性H2S是在關(guān)鍵酶-胱硫醚-β-合成酶(CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)催化下將半胱氨酸作為底物產(chǎn)生的。本實(shí)驗(yàn)通過檢測H2S 信號(hào)通路中關(guān)鍵酶(CSE 和CBS)在不同月齡大鼠陰莖海綿體組織內(nèi)含量的改變來深入探討老年性ED的發(fā)病原因。

1材料與方法

1.1動(dòng)物于佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心分別隨機(jī)挑選3、9、18月齡健康雄性Wistar大鼠各10只，同月齡組體重相差均在30 g內(nèi)，根據(jù)月齡分為3、9、18月齡組，分別記為A、B、C組。同條件下給予3組普通飼料及飲水持續(xù)喂養(yǎng)2 w，溫度為(21±3)℃，濕度為(66±4)%。

1.2主要儀器及試劑RM6240型多導(dǎo)生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠)，數(shù)顯式穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀與轉(zhuǎn)移電泳槽(上海天能)，兔抗大鼠CSE多克隆抗體(Proteintech Group，美國)，鼠抗β-actin抗體(中杉金橋，北京)，兔抗大鼠CBS多克隆抗體(ABclonal，美國)，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG與山羊抗鼠IgG(博士德，武漢)。

1.3陰莖海綿體內(nèi)壓(ICP)/平均頸動(dòng)脈壓(MAP)測定第2周末參照文獻(xiàn)〔2〕方法行ICPmax/MAP測定，對(duì)每只大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(1%，50 mg/kg)麻醉后行右側(cè)頸總動(dòng)脈插管，記錄MAP值。自龜頭至恥骨聯(lián)合剪開陰莖背側(cè)皮膚并用玻璃針逐步仔細(xì)游離出右側(cè)陰莖海綿體，將22G針頭充滿肝素鹽水并插入陰莖海綿體后排空管內(nèi)空氣，連接壓力換能器，檢測ICP變化。于腹部正中打開腹腔，解剖顯微鏡下找出盆神經(jīng)節(jié)(緊鄰前列腺的后外側(cè)緣)并給予相應(yīng)電刺激(電刺激參數(shù)：5、7 V，25 Hz，2 ms，持續(xù)刺激1 min暫停5 min后可重復(fù))，用RM6240型多導(dǎo)生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)記錄第1、7分鐘穩(wěn)定的ICP和MAP值。

1.4血漿H2S濃度檢測海綿體測壓后采血2 ml并離心取上清，取1.5 ml Eppendorf(EP)管，依次加入0.4 ml三蒸水、醋酸鋅(1%，250 μl)、對(duì)苯二銨鹽酸鹽(20 mmol/L，133 μl)及三氯化鐵(30 mmol/L，133 μl)后室溫孵育10 min，向上述EP管中加入三氯醋酸(10%，0.25 ml)后離心10 min(4℃，17 500 r/min)，將上清液加樣于孔板后測670 nm的吸光度，由NaHS標(biāo)準(zhǔn)曲線算得血漿H2S濃度〔3～5〕。

1.5測定陰莖海綿體中H2S含量和生成率測壓及采血后處死大鼠，分離出陰莖海綿體組織并凈化脫血，將磷酸鹽緩沖液(PBS)(0.10 mol/L，pH7.4)與海綿體組織按10∶1比例制成勻漿，取1.5 ml EP管，依次加入組織勻漿500 μl、20 μl L-半胱氨酸(10 mmol/L)、生理鹽水30 μl和20 μl 5-磷酸吡哆醛(2 mmol/L)，置于溫水(37℃)中反應(yīng)30 min后依次各加入0.25 ml的1%(W/V)乙酸鋅和0.25 ml的10%(W/V)三氯乙酸，水浴(37℃)60 min后加入對(duì)苯二銨鹽酸鹽(20 mmol/L)和三氯化鐵(30 mmol/L)均133 μl，20 min后加樣于孔板中，測670 nm處吸光度并算出陰莖海綿體中H2S含量及生成率〔3～5〕。

1.6Western印跡檢測陰莖海綿體中CSE與CBS的含量取陰莖海綿體組織稱重并液氮下充分研磨，將裂解液和海綿體組織以10∶1比例進(jìn)行勻漿，離心后取上清并按聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法測樣品蛋白濃度，以30 μg總蛋白進(jìn)行加樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉(37℃，1 h)，加入一抗(1∶1 000兔抗大鼠CBS/CSE多克隆抗體)后孵育過夜(4℃)，吐溫-20的Tris-HCl緩沖液(TBS-T)洗膜3次(15 min/次)后37℃下孵育二抗(1∶3 000被HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG)1 h，TBS-T洗膜4次(15 min/次)后滴加現(xiàn)配的發(fā)光液，保鮮薄膜單層包裹后固定于暗盒內(nèi)，暗室曝光10～20 s后顯影及定影。1∶500鼠抗β-actin抗體為內(nèi)參，CSE/CBS/β-actin值代表相對(duì)蛋白含量。底片光密度指數(shù)用IBAS2.0圖像分析系統(tǒng)分析。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行LSD-t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1ICPmax/MAP的比較隨著月齡增大，ICPmax/MAP(5、7 V)值依次顯著性減小，A組(0.64±0.06，0.72±0.07)>B組(0.47±0.05，0.51±0.08)>C組(0.32±0.05，0.35±0.06)，B組與A組、C組與B組差異均有顯著性(P<0.05)。

2.2血漿和陰莖海綿體內(nèi)H2S含量與生成率比較血漿H2S濃度、海綿體組織H2S的含量和生成率都隨月齡增加而顯著性下降(P<0.05)。見表1。

表1　各組血漿H2S濃度、陰莖海綿體內(nèi)H2S含量及生成率比較

與A組比較：1)P<0.05；與B組比較：2)P<0.05

2.3陰莖組織中CSE和CBS含量比較隨著大鼠月齡增大，陰莖組織內(nèi)CSE(0.64±0.11、0.48±0.09、0.37±0.13)和CBS(0.49±0.08、0.29±0.06、0.18±0.05)的含量均依次顯著性降低(P<0.05)。見圖1。

圖1　各組陰莖海綿體組織內(nèi)CSE和CBS表達(dá)的Western印跡結(jié)果

3討論

流行病學(xué)調(diào)查顯示，全球ED患者約1.5億〔6〕。老齡、心理因素、手術(shù)、血管性疾病和內(nèi)分泌疾病等均可導(dǎo)致ED，已證實(shí)衰老是ED發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素〔7〕，隨著年齡的增長，ED的患病率也逐漸增高。關(guān)于ED美國研究發(fā)現(xiàn)60歲以上男性的患病率為50歲以下的2倍〔8〕，國內(nèi)研究顯示，約4.3%的30～60歲男性患有ED，40～49歲患病率為4.3%，而50～59歲患病率為9.8%〔9〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)ED發(fā)病與增齡關(guān)系密切。

增齡中ED發(fā)生的具體機(jī)制較復(fù)雜，存在多種可能。李付彪等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)隨大鼠月齡增大，陰莖組織內(nèi)合酶(NOS)活性與含量下降，致使海綿體中NO含量減少及鳥苷酸環(huán)化酶途徑受阻而出現(xiàn)ED。秦文波等〔11〕研究認(rèn)為增齡使陰莖組織中血紅素氧合酶(HO)和CO的含量明顯減少，最終導(dǎo)致ED發(fā)生。而Ferrini等〔12〕發(fā)現(xiàn)隨著月齡增大，陰莖海綿體內(nèi)活性氧和膠原纖維沉積增多、平滑肌細(xì)胞減少等，最終發(fā)生ED。據(jù)研究顯示老齡大鼠陰莖海綿體內(nèi)超氧陰離子(一種活性氧產(chǎn)物)是青年組的3倍，認(rèn)為陰莖組織內(nèi)活性氧隨增齡而增多，損傷陰莖海綿體的平滑肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞并致NO介導(dǎo)的平滑肌舒張功能障礙〔13〕。RhoA/Rho 激酶具有收縮陰莖血管的作用，而降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)是一種具有強(qiáng)效舒血管活性的多肽物質(zhì)，老齡大鼠ED的發(fā)生與陰莖海綿體組織中RhoA/Rho 激酶增多和CGRP減少密切相關(guān)〔14〕。另外，增齡所致的中樞調(diào)節(jié)勃起功能機(jī)制減退、性激素水平降低及伴發(fā)多種其他疾病(糖尿病、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化等)均是老年性ED的可能病因。此外，陰莖組織內(nèi)源性H2S與老年性ED的發(fā)生也密切相關(guān)，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究明確。內(nèi)源性H2S主要由依賴5-磷酸吡多醛的酶(CSE和CBS)將體內(nèi)的半胱氨酸轉(zhuǎn)化而來的，其中CSE主要分布于各種神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，而CBS存在于平滑肌及各種臟器如心、肝、腎臟等組織內(nèi)。H2S與NO及CO相似，在舒張平滑肌和改善陰莖勃起功能方面起著重要作用。H2S不僅可以促使恢復(fù)腦卒中后神經(jīng)功能，一方面通過有效增加谷胱甘肽(GSH)生成并清除氧自由基，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減少血管聚積的過氧化反應(yīng)產(chǎn)物，抗動(dòng)脈粥樣硬化，保護(hù)血管內(nèi)皮功能并避免內(nèi)皮功能損傷，另一方面通過抑制平滑肌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡來抑制血管重構(gòu)〔15〕。H2S對(duì)平滑肌的舒張作用僅部分能被腺苷酸環(huán)化酶阻滯劑所阻斷，故H2S調(diào)節(jié)舒張功能除依賴cAMP 的調(diào)節(jié)機(jī)制外，還可通過其他機(jī)制來調(diào)節(jié)平滑肌的舒張〔16〕。據(jù)文獻(xiàn)顯示，H2S還能通過依賴ATP敏感的鉀離子通道(K+-ATP)介導(dǎo)途徑、直接作用于Cl-/HCO3-通道及與睪酮和CO協(xié)同作用的方式來調(diào)節(jié)平滑肌的舒張〔17〕。此外H2S還可以增加陰莖海綿體內(nèi)NOS和NO的含量來促進(jìn)陰莖勃起〔18〕，但也有學(xué)者認(rèn)為NO使CSE 活性降低而抑制H2S的舒張效應(yīng)〔19〕，目前H2S與NO的關(guān)系尚不明確。

綜上，由于增齡中各種因素如動(dòng)脈粥樣硬化、氧自由基增多、平滑肌內(nèi)皮損傷等致使陰莖海綿體組織內(nèi)CSE和CBS活性與含量降低，內(nèi)源性H2S含量減少，陰莖組織產(chǎn)生H2S能力減弱，這可能是增齡所致ED的機(jī)制之一。

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〔2015-03-19修回〕

(編輯苑云杰)

基金項(xiàng)目：黑龍江省自然科學(xué)基金(H2015073)；黑龍江省衛(wèi)生廳科研課題(2013-229)；佳木斯大學(xué)校級(jí)自然科學(xué)類青年項(xiàng)目(Sq2013-025)

通訊作者：遲寶進(jìn)(1981-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事勃起功能障礙及前列腺癌研究。

〔中圖分類號(hào)〕R698+.1

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)12-2852-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.12.011

1佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科

2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院泌尿外科

第一作者：曾鋒(1981-)，男，主治醫(yī)師，主要從事泌尿外科及勃起功能障礙研究。