王苗，王裕岱，黃玉冰，陳芬，王圣，李斌，董小莉

急性心肌梗死是臨床常見的一種疾病類型，隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快，急性心肌梗死的發(fā)病率逐年升高，且呈年輕化趨勢，已嚴(yán)重影響人類生活質(zhì)量，目前臨床主要采用經(jīng)皮冠狀動脈介入治療等手段治療急性心肌梗死，但隨之產(chǎn)生的再灌注損傷問題已引起高度重視，研究表明心肌細(xì)胞凋亡增多與心肌缺血再灌注損傷的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[1-4]。目前關(guān)于心肌缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，因而深入探究心肌缺血再灌注損傷發(fā)生及發(fā)展的分子機(jī)制對提高治療效果及改善患者預(yù)后均具有重要意義。長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA，LncRNA）廣泛參與信號傳導(dǎo)，影響細(xì)胞代謝、生長、分化、凋亡和死亡等過程，在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中有重要意義。在研究外泌體lncRNA HCG15在急性心肌梗死中的作用機(jī)制時發(fā)現(xiàn)，與對照組對比，NPHP3-AS1在急性心肌梗死患者中顯著上調(diào)[5]。但NPHP3-AS1在心肌缺血再灌注損傷過程中的作用機(jī)制尚未可知。通過生物信息學(xué)分析顯示微小RNA（miRNA）的靶基因包括NPHP3[6]。又有研究表明miR-30a-5p在心力衰竭患者中表達(dá)下調(diào)，并可能作為早期診斷心力衰竭的重要指標(biāo)[7]。因此，本研究主要探討NPHP3-AS1對缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖及凋亡的影響，并探究其對miR-30a-5p的靶向調(diào)控作用，為心肌缺血再灌注損傷的治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑大鼠心肌細(xì)胞H9C2購自美國ATCC公司；杜氏改良培養(yǎng)基（DMEM）購自美國Gibco公司；胎牛血清購自上海玉博生物科技有限公司；Lipofectamine2000與Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄與實時熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；NPHP3-AS1小分子干擾RNA（si-NPHP3-AS1）、亂序無意義陰性序列（si-NC）、miR-30a-5p寡核苷酸模擬物（miR-30a-5p mimics）及陰性對照mimic NC序列（miR-NC）、miR-30a-5p特異性寡核苷酸抑制劑（anti-miR-30a-5p）購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（PI）細(xì)胞凋亡試劑盒購自北京博爾邁生物技術(shù)有限公司；兔抗鼠半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶3（cysteinyl aspartatespecific protease 3，Caspase3）、增殖標(biāo)記蛋白細(xì)胞增殖核抗原 67（Antigen identified by monoclonal antibody，Ki67）抗體購自美國CST公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自美國Abcam公司。

1.2 研究方法

1.2.1 實驗分組取對數(shù)生長期心肌細(xì)胞接種于不含血清的培養(yǎng)基內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)移至厭氧培養(yǎng)箱（95%N2、5%CO2）內(nèi)培養(yǎng)3 h，建立心肌細(xì)胞損傷模型，隨后將其轉(zhuǎn)移至37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)1 h[8]。將缺氧處理的心肌細(xì)胞作為模型組。同時將正常培養(yǎng)的心肌細(xì)胞作為對照組。分別將si-NC、si-NPHP3-AS1、antimiR-30a-5p、si-NPHP3-AS1與anti-miR-30a-5p轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞，隨后進(jìn)行缺氧處理，分別記作模型組+si-NC組、模型組+si-NPHP3-AS1組、模型組+anti-miR-30a-5p組、模型組+si-NPHP3-AS1+anti-miR-30a-5p組。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）檢測細(xì)胞中NPHP3-AS1、miR-30a-5p的表達(dá)水平收集各組心肌細(xì)胞，采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA。應(yīng)用紫外分光光度計測定RNA濃度。反轉(zhuǎn)錄體系：5×gDNA Buffer 2 μl，10×King RT Buffer 2 μl，F(xiàn)astKing RT Enzyme Mix 1 μl，F(xiàn)Q-RT Primer Mix 2 μl，RNA（2 μg），RNase-Free dd H2O補(bǔ)足體系至20 μl；反應(yīng)條件：42 ℃ 15 min，95 ℃3 min。反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。NPHP3-AS1正向引物5’-AGGCAATG TGTCATCCTGGA-3’，反向引物5’-AAAATCCATTGCCCAGCCAG-3’；miR-30a-5p正向引物5’-GGCAAGGAGGAC AAATACGC-3’，反向引物5’-TCCTGGAC TCAAGCAAACCT-3’；GAPDH正向引物5’-AACGGATTTGGTCGTATTG-3’，反向引物5’-GGAAGATGGTG ATGGGATT-3’；U6正向引物5’-ATTGGAACGATACAGAG AAGATT-3’，反向引物5’-GGAAC GCT TCACGAATTTG-3’，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。以cDNA為模板進(jìn)行qRTPCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2.5 μl，MgSO4 2.5 μl，dNTPs 2.5 μl，正反向引物各0.5 μl，cDNA 2 μl，RNase-Free dd H2O補(bǔ)足體系至25 μl；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性60 s，95 ℃變性60 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共36次循環(huán)，NPHP3-AS1以GAPDH為內(nèi)參，miR-30a-5p以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算NPHP3-AS1、miR-30a-5p的相對表達(dá)量。

1.2.3 檢測細(xì)胞周期收集各組對數(shù)生長期心肌細(xì)胞，使用0.25%胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/ml，4 ℃條件下經(jīng)3000 r/min離心5 min，加入預(yù)冷PBS洗滌，加入500 μl預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞，分別加入70%乙醇（3.5 ml），充分混勻，4 ℃條件下孵育24 h，4 ℃條件下經(jīng)3000 r/min離心5 min，棄上清，加入PBS洗滌，相同條件下離心后其上清，收集細(xì)胞沉淀，加入50 μl RNaseA，37 ℃條件下水浴30 min，加入PI染液孵育30 min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，并計算G0-G1期、S期、G2-M期細(xì)胞比例。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率收集各組對數(shù)生長期心肌細(xì)胞，加入預(yù)冷PBS洗滌，4 ℃條件下經(jīng)3000 r/min離心6 min，其上清，相同條件下再次洗滌，棄上清，收集細(xì)胞沉淀，向細(xì)胞沉淀中加入500 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，依次分別加入5 μl Annexin V-FITC與5 μl PI，室溫振蕩孵育10 min，應(yīng)用FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因檢測NPHP3-AS1的靶基因starBase預(yù)測顯示NPHP3-AS1與miR-30a-5p存在結(jié)合位點，采用基因突變技術(shù)將結(jié)合位點進(jìn)行突變，分別將含有結(jié)合位點與突變位點的基因序列插入熒光素酶報告基因載體分別構(gòu)建野生型載體WT-NPHP3-AS1與突變型載體MUTNPHP3-AS1，參照熒光素酶活性檢測試劑盒說明書檢測各組熒光素酶活性。分別將si-NC、si-NPHP3-AS1轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞，采用qRT-PCR檢測各組細(xì)胞中miR-30a-5p的表達(dá)水平。

1.2.6 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測Caspase3、Ki67蛋白表達(dá)收集各組心肌細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法檢測蛋白濃度，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，取蛋白樣品，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉，分別加入Caspase3（1:1000）、Ki67（1:1000）與內(nèi)參蛋白GAPDH（1:1000）一抗稀釋液，4 ℃條件下孵育24 h，TBST洗滌，分別加入二抗稀釋液（1:2000），室溫孵育1 h，暗室內(nèi)曝光顯影，應(yīng)用Quantityone軟件檢測條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，本研究計量資料均符合正態(tài)分布，以（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NPHP3-AS1在缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中的表達(dá)與對照組比較，模型組心肌細(xì)胞中NPHP3-AS1的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）（表1）。

2.2 干擾NPHP3-AS1對缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖、凋亡的影響與對照組比較，模型組G0-G1期細(xì)胞比例顯著升高（P＜0.05），S期細(xì)胞比例顯著降低（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與模型組、模型組+si-NC組比較，模型組+si-NPHP3-AS1組G0-G1期細(xì)胞比例顯著降低（P＜0.05），S期細(xì)胞比例顯著升高（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），各組間G2-M期細(xì)胞比例比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖1、表2）。

2.3 干擾NPHP3-AS1對缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中Caspase3及Ki67表達(dá)的影響與對照組比較，模型組Caspase3蛋白水平顯著升高（P＜0.05），Ki67蛋白水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組、模型組+si-NC組比較，模型組+si-NPHP3-AS1組Caspase3蛋白水平顯著降低（P＜0.05），Ki67蛋白水平顯著升高（P＜0.05）（圖2、表3）。

2.4 NPHP3-AS1靶向調(diào)控miR-30a-5pstarBase預(yù)測顯示NPHP3-AS1與miR-30a-5p存在結(jié)合位點見圖3。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染突變型載體WT-NPHP3-AS1的細(xì)胞實驗中，與miR-NC組比較，miR-30a-5p組熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；共轉(zhuǎn)染野生型載體MUT-NPHP3-AS1的細(xì)胞實驗中，miR-30a-5p組熒光素酶活性與miR-NC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表4）。與si-NC組比較，si-NPHP3-AS1組miR-30a-5p的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）（表5）。

表1 NPHP3-AS1在缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中的表達(dá)

圖1 干擾NPHP3-AS1對缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡率的影響

表2 干擾NPHP3-AS1對缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖凋亡的影響

圖2 Caspase3和Ki67蛋白的表達(dá)

表3 Caspase3和Ki67蛋白的表達(dá)

圖3 NPHP3-AS1靶向miR-30a-5p

表4 雙熒光素酶報告實驗

表5 miR-30a-5p的表達(dá)

2.5 干擾miR-30a-5p能逆轉(zhuǎn)干擾NPHP3-AS1對缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖凋亡的作用與模型組比較，模型組+anti-miR-30a-5p組G0-G1期細(xì)胞比例顯著升高（P＜0.05），S期細(xì)胞比例顯著降低（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與模型組+si-NPHP3-AS1組比較，模型組+si-NPHP3-AS1+anti-miR-30a-5p組G0-G1期細(xì)胞比例顯著升高（P＜0.05），S期細(xì)胞比例顯著降低（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與模型組+anti-miR-30a-5p組比較，模型組+si-NPHP3-AS1+anti-miR-30a-5p組G0-G1期細(xì)胞比例顯著降低（P＜0.05），S期細(xì)胞比例顯著升高（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05）（圖4、表6）。

圖4 干擾miR-30a-5p能逆轉(zhuǎn)干擾NPHP3-AS1對缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡率的影響

表6 干擾miR-30a-5p能逆轉(zhuǎn)干擾NPHP3-AS1對缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖凋亡的影響

2.6 干擾miR-30a-5p能逆轉(zhuǎn)干擾NPHP3-AS1對缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中Caspase3及Ki67表達(dá)的作用與模型組比較，模型組+si-NPHP3-AS1組miR-30a-5p的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），Caspase3蛋白水平顯著降低（P＜0.05），Ki67蛋白水平顯著升高（P＜0.05），而模型組+antimiR-30a-5p組miR-30a-5p的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），Caspase3蛋白水平顯著升高（P＜0.05），Ki67蛋白水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組+si-NPHP3-AS1組比較，模型組+si-NPHP3-AS1+anti-miR-30a-5p組miR-30a-5p的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），Caspase3蛋白水平顯著升高，Ki67蛋白水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組+anti-miR-30a-5p組比較，模型組+si-NPHP3-AS1+anti-miR-30a-5p組miR-30a-5p的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），Caspase3蛋白水平顯著降低（P＜0.05），Ki67蛋白水平顯著升高（P＜0.05）（圖5、表7）。

圖5 Caspase3和Ki67蛋白的表達(dá)

表7 Caspase3和Ki67蛋白的表達(dá)

3 討論

LncRNA屬于內(nèi)源性非編碼RNA分子，其本身不具有編碼蛋白的功能，但其可通過充當(dāng)miRNA的海綿分子而調(diào)控其靶基因表達(dá)從而參與急性心肌梗死等多種心血管疾病的發(fā)生及發(fā)展過程，還可能通過調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞增殖及凋亡過程從而參與心肌細(xì)胞損傷過程[9-13]。但仍有部分LncRNA在心肌缺血再灌注損傷過程中的作用機(jī)制尚未完全闡明。

本研究結(jié)果顯示缺氧處理后心肌細(xì)胞中NPHP3-AS1的表達(dá)水平顯著升高，提示NPHP3-AS1在心肌缺血再灌注損傷過程中可能發(fā)揮重要調(diào)控作用。為探究NPHP3-AS1在心肌缺血再灌注損傷中的作用機(jī)制，本研究將si-NPHP3-AS1轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞，結(jié)果顯示缺氧處理后G0-G1期細(xì)胞比例顯著升高，S期細(xì)胞比例顯著降低，而細(xì)胞凋亡率顯著升高，說明缺氧處理可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞周期阻滯從而抑制細(xì)胞增殖并可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步分析顯示干擾NPHP3-AS1表達(dá)后G0-G1期細(xì)胞比例顯著降低，S期細(xì)胞比例顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低，提示干擾NPHP3-AS1表達(dá)可通過調(diào)控細(xì)胞周期而促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡。研究表明細(xì)胞接收到凋亡信號時，線粒體釋放細(xì)胞色素C進(jìn)而激活Caspase3級聯(lián)反應(yīng)從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而Ki67表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)細(xì)胞增殖[14,15]。本研究結(jié)果顯示缺氧處理后心肌細(xì)胞中Caspase3蛋白水平顯著升高，Ki67蛋白水平顯著降低，而干擾NPHP3-AS1表達(dá)后心肌細(xì)胞中Caspase3蛋白水平顯著降低，Ki67蛋白水平顯著升高，進(jìn)一步證實干擾NPHP3-AS1表達(dá)可通過調(diào)控細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)而影響缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡。

為進(jìn)一步探究NPHP3-AS1在缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制，本研究通過雙熒光素酶與qRT-PCR實驗證實NPHP3-AS1可靶向結(jié)合miR-30a-5p，還可負(fù)向調(diào)控miR-30a-5p的表達(dá)，研究表明ADAR1通過ADAR1-miR-30a-SOCS3軸而減輕小鼠敗血癥模型中的炎癥反應(yīng)[16]。抑制LINC00707可通過調(diào)控miR-30a-5p/ Neurod 1而減輕脂多糖誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞炎癥及細(xì)胞凋亡[17]。miR-30b-5p表達(dá)異常還可在兒童急性肺損傷、非小細(xì)胞肺癌等疾病中發(fā)揮重要調(diào)控作用[18,19]。由此猜測NPHP3-AS1可能通過調(diào)控miR-30a-5p的表達(dá)從而影響缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖及凋亡。為驗證上述猜測，本研究將si-NPHP3-AS1與antimiR-30a-5p共轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞，結(jié)果顯示干擾miR-30a-5p能逆轉(zhuǎn)干擾NPHP3-AS1對缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖凋亡的作用，提示干擾NPHP3-AS1表達(dá)可通過上調(diào)miR-30a-5p的表達(dá)從而抑制缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡及促進(jìn)細(xì)胞增殖。

綜上所述，干擾NPHP3-AS1表達(dá)可促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與靶向調(diào)控miR-30a-5p的表達(dá)有關(guān)，可為急性心肌梗死等心血管疾病的治療提供新方向。