朱丹，鄭延坤

【關(guān)鍵字】動脈粥樣硬化；高遷移率族蛋白1；輔助性T細(xì)胞17；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；流式細(xì)胞術(shù)；細(xì)胞凋亡

動脈粥樣硬化常見于心腦血管疾病患者，是此類患者的主要病理基礎(chǔ)[1]。在全球范圍內(nèi)，動脈粥樣硬化的發(fā)生率和死亡率較高，并且近年來呈逐漸增長趨勢，對人們的生命健康造成嚴(yán)重影響[2]。高遷移率族蛋白1（HMGB1）屬于非組蛋白家族成員，主要分布于細(xì)胞核內(nèi)，參與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及損傷修復(fù)過程[3]。已有的研究報道顯示動脈粥樣硬化患者中血清HMGB1水平明顯上調(diào)，并且是非鈣化性斑塊形成的獨立危險因素[4]。T淋巴細(xì)胞參與動脈粥樣硬化形成的各個階段，與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]。白細(xì)胞分化抗原4+（CD4+）T細(xì)胞在白介素-2（IL-2）和腫瘤生長因子-β（TGF-β）等細(xì)胞因子的作用下誘導(dǎo)分化成調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg），其具有免疫抑制作用[6]。而CD4+T細(xì)胞在在白介素-6（IL-6）和白介素-1β（IL-1β）等細(xì)胞因子的作用下誘導(dǎo)分化成輔助性T細(xì)胞17（Th17）細(xì)胞，其具有炎癥促進作用[7]。目前的研究報道顯示HMGB1在免疫細(xì)胞的成熟過程中也起到重要作用[8]，但是對于HMGB1對Th17和Treg細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用以及HMGB1是否通過調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞失衡來促進動脈粥樣硬化的發(fā)生依然缺乏相應(yīng)研究。本研究通過檢測血清HMGB1水平、Th17和Treg細(xì)胞凋亡率以及重組高遷移率族蛋白1（rHMGB1）蛋白對Th17和Treg細(xì)胞比例的影響，旨在探討動脈粥樣硬化患者血清HMGB1對Th17/Treg平衡的調(diào)節(jié)作用，現(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 研究對象選擇2017年2月至2019年8月于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院診治的120例冠狀動脈粥樣硬化患者作為觀察組，納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)冠狀動脈（冠脈）造影顯示至少一支狹窄程度≥50%；②前3個月內(nèi)未接受過抗炎抗菌藥物治療；③前6個月內(nèi)未接受過免疫治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并腫瘤患者；②肝腎功能障礙患者；③前3個月內(nèi)有手術(shù)治療史；④存在全身性感染性疾病患者；⑤合并糖尿病等代謝異常疾病患者。其中男性67例，女性53例。年齡51～68（60.84±8.91）歲。既往高血壓史25例，冠心病史14例，吸煙史35例。同時選擇120例冠脈造影顯示無冠脈狹窄的作為對照組，其中男性64例，女性56例。年齡49～70（61.05±9.74）歲。既往高血壓史27例，冠心病史11例，吸煙史38例。兩組的性別比例、年齡和高血壓史等一般資料比較，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。均與研究對象簽署知情同意書，臨床研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意。

1.2 方法

1.2.1 外周血單個核細(xì)胞分離患者入院后清晨采集空腹靜脈血5 ml至抗凝管中，采集后3 h內(nèi)對血液樣本進行處理。采用密度梯度離心法對觀察組和對照組血液樣本中的外周血單個核細(xì)胞進行分離，將10 ml血液加入到離心管中，加入10 ml預(yù)熱的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）及10 ml預(yù)熱的淋巴細(xì)胞分離液，混合均勻后，2000 r/min離心20 min。離心結(jié)束后分成四層，將第二層白色霧狀層吸取到另一潔凈離心管中，加入3 ml PBS緩沖液混合均勻。1000 r/min離心15 min后棄去上清液，加入500 μl PBS緩沖液重懸細(xì)胞沉淀，并采用血球計數(shù)板對細(xì)胞進行計數(shù)，將單個核細(xì)胞濃度調(diào)整至2×106/ml。

1.2.2 Annexin-V染色法檢測對照組及觀察組Treg和Th17細(xì)胞凋亡Treg細(xì)胞凋亡檢測：取兩支離心管，分別標(biāo)記檢測管和對照管，各加入100 μl單個核細(xì)胞溶液、10 μl的CD4-藻紅蛋白（PE）-熒光素7（Cy7）抗體（美國Abcam科技有限公司，貨號：ab210351）、10 μl的白細(xì)胞分化抗原25（CD25）-PE抗體（美國Abcam科技有限公司，貨號：ab210335）和10 μl的白細(xì)胞分化抗原127（CD127）-藻藍(lán)蛋白（APC）抗體（美國A b c a m 科技有限公司，貨號：ab240225），冰上孵育30 min。加入500 μl的PBS溶液混合均勻后2000 r/min離心10 min。棄去上清液后，加入100 μl結(jié)合增強緩沖液重懸細(xì)胞，檢測管中加入10 μl的膜聯(lián)蛋白-V（Annexin-V）-異硫氰酸熒光素（FITC，美國Abcam科技有限公司，貨號：ab14082），對照管中則加入10 μl的PBS，室溫下孵育20 min后加入500 μl的PBS溶液混合均勻后2000 r/min離心10 min。棄上清液，加入500 μl的PBS溶液重懸后上流式細(xì)胞儀（美國貝克曼庫爾特科技有限公司，型號：CytoFLEX）。

Th17細(xì)胞凋亡檢測：取200 μl單個核細(xì)胞溶液于24孔板中，加入400 μl的RPMI1640培養(yǎng)基及10 μl的聚丙烯酸甲酯（PMA）溶液和10 μl的蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑A（BFA）溶液，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。取兩支離心管，分別標(biāo)記檢測管和對照管，各加入100 μl處理后的單個核細(xì)胞溶液、10 μl的白細(xì)胞分化抗原3（CD3）-PE-Cy7抗體（美國Abcam科技有限公司，貨號：ab 81992）和10 μl的白細(xì)胞分化抗原8（CD8）-APC抗體（美國Abcam科技有限公司，貨號：ab252196）冰上孵育30 min。加入500 μl的PBS溶液混合均勻后2000 r/min離心10 min。棄去上清液后，加入200 μl的細(xì)胞固定劑，冰上孵育30 min。加入500 μl的PBS溶液混合均勻后2000 r/min離心10 min。棄去上清液后，加入200 μl的破膜劑和10 μl的白介素-17（IL-17）-PE抗體（美國Abcam科技有限公司，貨號：ab 79056），冰上孵育30 min。加入500 μl的PBS溶液混合均勻后2000 r/min離心10 min。棄上清液，加入500 μl的PBS溶液重懸后上流式細(xì)胞儀。

1.2.3 血清HMGB1水平檢測患者入院后清晨采集空腹靜脈血3 ml，室溫下靜置1 h后，5000 r/min離心30 min，將上清液收集至另一潔凈離心管中，-80℃凍存。血清HMGB1水平檢測采用酶聯(lián)免疫吸附法，采用HMGB1檢測試劑盒（上海晶抗生物工程有限公司，貨號：JK5185）進行檢測，實驗操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。

1.2.4 rHMGB1蛋白的細(xì)胞刺激實驗rHMGB1蛋白濃度梯度處理：取100 μl單個核細(xì)胞溶液至5 ml的RPMI1640培養(yǎng)基（含20%的胎牛血清）中，混合均勻后置于T25瓶中進行培養(yǎng)。48 h后將細(xì)胞接種于96孔板中，1×104/孔，分別加入0 ng/ml（低劑量組）、10 ng/ml（中等劑量組）和100 ng/ml（高劑量組）的rHMGB1蛋白（上?？泼羯锟萍加邢薰荆浱枺篐00003146-P01，100 mg），37℃、5%CO2培養(yǎng)條件下處理24 h。

rHMGB1蛋白時間梯度處理：取100 μl單個核細(xì)胞溶液至5 ml的RPMI 1640培養(yǎng)基（含20%的胎牛血清）中，混合均勻后置于T25瓶中進行培養(yǎng)。48 h后將細(xì)胞接種于96孔板中，1×104/孔，均加入100 ng/ml的rHMGB1蛋白，于0 h、12 h和24 h收集細(xì)胞進行檢測。

Treg細(xì)胞比例檢測：取處理后的細(xì)胞100 μl，加入10 μl的CD4-FITC、10 μl的CD25-PE和5 μl的CD127-PE-Cy7抗體，冰上孵育30 min。加入500 μl的PBS溶液混合均勻后2000 r/min離心10 min。棄上清液，加入500 μl的PBS溶液重懸后上流式細(xì)胞儀。

Th17細(xì)胞比例檢測：在處理后的細(xì)胞中加入10 μl的PMA溶液和10 μl的BFA溶液，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。培養(yǎng)結(jié)束后取出100 μl細(xì)胞懸液，各加入10 μl的CD3-FITC和CD8-APC抗體，冰上孵育30 min。加入500 μL的PBS溶液混合均勻后2000 r/min離心10 min。棄上清液，加入200 μl的固定劑，冰上孵育30 min。PBS清洗細(xì)胞后，加入100 μl破膜劑和10 μl的IL-17-PE抗體，冰上孵育30 min。加入500 μl的PBS溶液混合均勻后2000 r/min離心10 min。棄上清液，加入500 μl的PBS溶液重懸細(xì)胞后上流式細(xì)胞儀。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件對臨床數(shù)據(jù)進行分析。平均年齡、Treg和Th17細(xì)胞凋亡率等計量資料采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示，兩組間采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。采用Pearson相關(guān)性分析對血清HMGB1水平與Treg細(xì)胞凋亡率及Th17細(xì)胞凋亡率的相關(guān)性進行檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組Treg細(xì)胞凋亡率、Th17細(xì)胞凋亡率和血清HMGB1水平比較觀察組Treg凋亡率和血清HMGB1水平明顯高于對照組，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。兩組Th17凋亡率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

2.2 血清HMGB1水平與Treg細(xì)胞凋亡率及Th17細(xì)胞凋亡率的相關(guān)性分析血清HMGB1水平與Treg細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān)（r=0.792，P＜0.05），而與Th17細(xì)胞凋亡率無相關(guān)性（r=0.112，P＞0.05）（圖1）。

2.3 不同濃度rHMGB1對對照組外周血單個核細(xì)胞中Treg和Th17細(xì)胞比例及Treg/Th17比值的影響中等劑量組和高劑量組Treg細(xì)胞比例和Treg/Th17比值明顯低于低劑量組，而Th17細(xì)胞比例明顯高于低劑量組，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。高劑量組Treg細(xì)胞比例及Treg/Th17比值明顯低于中等劑量組，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而兩組Th17細(xì)胞比例比較，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。

2.4 不同時間rHMGB1作用對對照組外周血單個核細(xì)胞中Treg和Th17細(xì)胞比例及Treg/Th17比值的影響12 h組和24 h組Treg細(xì)胞比例和Treg/Th17比值明顯低于0 h組，而Th17細(xì)胞比例明顯高于0 h組，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。24 h組Treg細(xì)胞比例及Treg/Th17比值明顯低于12 h組，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而兩組Th17細(xì)胞比例比較，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表3）。

3 討論

動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展涉及多種因素相互作用，是一種發(fā)病機制極為復(fù)雜的慢性疾病[9]。目前學(xué)界認(rèn)為感染假說、脂質(zhì)假說以及炎癥假說是動脈粥樣硬化形成的主要機制，并且學(xué)界普遍認(rèn)為動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，同時伴隨嚴(yán)重的脂質(zhì)代謝障礙[10,11]。在動脈粥樣硬化斑塊發(fā)展進程中，巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和天然殺傷性細(xì)胞等免疫細(xì)胞大量浸潤至病灶組織當(dāng)中，促進局部組織的炎癥反應(yīng)，加劇病情的發(fā)展[12]。深入探究動脈粥樣硬化的發(fā)病機制并從中尋找到動脈粥樣硬化的有效治療靶點對于動脈粥樣硬化預(yù)防、診斷和治療具有重要意義。

表1 兩組Treg細(xì)胞凋亡率、Th17細(xì)胞凋亡率和血清HMGB1水平比較

圖1 血清HMGB1水平與Treg細(xì)胞凋亡率及Th17細(xì)胞凋亡率的相關(guān)性分析

表2 不同濃度rHMGB1對對照組外周血單個核細(xì)胞中Treg和Th17細(xì)胞比例及Treg/Th17比值的影響

表3 不同時間rHMGB1作用對對照組外周血單個核細(xì)胞中Treg和Th17細(xì)胞比例及Treg/Th17比值的影響

HMGB1是一種重要的免疫調(diào)節(jié)分子，已有的研究報道顯示HMGB1能夠通過激活核因子κB（NF-κB）炎癥信號通路以及抑制T淋巴細(xì)胞功能起到免疫抑制的作用[13,14]。本研究發(fā)現(xiàn)觀察組血清HMGB1水平和Treg細(xì)胞凋亡率明顯升高，并且血清HMGB1水平和Treg細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān)性，實驗結(jié)果表明血清HMGB1水平升高可能與動脈粥樣硬化的發(fā)生密切相關(guān)，并且在動脈粥樣硬化發(fā)生過程中Treg細(xì)胞凋亡水平明顯提高。分析其原因可能是由于HMGB1水平上調(diào)會促進Treg細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的發(fā)生，已有研究報道顯示HMGB1能夠促進氧化應(yīng)激的產(chǎn)生[15]，并且氧化應(yīng)激的發(fā)生會促進Treg細(xì)胞的凋亡[16]，因此在動脈粥樣硬化患者當(dāng)中血清HMGB1水平升高會誘導(dǎo)Treg細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，進而促進Treg細(xì)胞發(fā)生凋亡，導(dǎo)致動脈粥樣硬化患者體內(nèi)Treg細(xì)胞凋亡率明顯提高。同時，Bandala等[17]研究發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞能明顯抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生，而Proto等[18]則發(fā)現(xiàn)在HMGB1與炎癥性疾病的發(fā)生密切相關(guān)，Treg細(xì)胞和HMGB1之間存在一定拮抗作用，因此在動脈粥樣硬化患者體內(nèi)由于炎癥反應(yīng)的存在引起患者體內(nèi)炎癥因子分泌紊亂，炎癥因子活化NFκB炎癥信號通路，引起患者血清HMGB1水平明顯提高，由于HMGB1與Treg細(xì)胞之間的拮抗作用，HMGB1水平上調(diào)在抑制Treg細(xì)胞生長的同時促進Treg細(xì)胞凋亡，進而導(dǎo)致患者Treg細(xì)胞比例明顯下降。進一步研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在rHMGB1蛋白的作用下，Treg細(xì)胞比例及Treg/Th17比值明顯下降，分析其原因可能是由于Treg細(xì)胞的分化過程與細(xì)胞內(nèi)代謝密切相關(guān)，細(xì)胞內(nèi)代謝紊亂會導(dǎo)致Treg/Th17細(xì)胞平衡發(fā)生改變，Xu等[19]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞內(nèi)谷氨酸轉(zhuǎn)化成α-酮戊二酸的過程受到抑制，F(xiàn)OXO3基因的甲基化水平升高而導(dǎo)致FOXO3基因表達(dá)的下調(diào)，使得T淋巴細(xì)胞更傾向于分化成Treg細(xì)胞。而已有的研究報道顯示HMGB1能夠促進谷氨酸的代謝過程[20]，因此在動脈粥樣硬化患者中HMGB1可能通過促進谷氨酸轉(zhuǎn)化成α-酮戊二酸，使得Treg細(xì)胞的分化過程受到抑制，導(dǎo)致Treg細(xì)胞比例明顯下降。同時，Essig等[21]研究發(fā)現(xiàn)PI3K信號通路的活化會促進T淋巴細(xì)胞分化成Treg細(xì)胞，而Meng等[22]研究發(fā)現(xiàn)HMGB1能夠抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）信號通路的活化，因此在動脈粥樣硬化患者當(dāng)中血清HMGB1水平升高會抑制PI3K信號通路的活化，進而抑制T淋巴細(xì)胞分化成Treg細(xì)胞，導(dǎo)致Treg細(xì)胞細(xì)胞比例下降。在動脈粥樣硬化患者中HMGB1會對患者體內(nèi)的Th17/Treg平衡造成嚴(yán)重影響，使得T淋巴細(xì)胞分化成Treg細(xì)胞的過程受到抑制，使得機體處于免疫抑制狀態(tài)，導(dǎo)致動脈粥樣硬化患者的病情進一步惡化[23]。

綜上所述，動脈粥樣硬化患者體內(nèi)HMGB1水平明顯升高，并且Treg細(xì)胞凋亡水平明顯上調(diào)，HMGB1可能通過抑制患者體內(nèi)Treg細(xì)胞比例以促進動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。因此HMGB1是動脈粥樣硬化疾病的潛在靶點，在動脈粥樣硬化的診斷和治療中具有一定臨床意義。