方?jīng)b昕 顧紅琴 施美芳 林 勇

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200025；2.上海市寶山區(qū)友誼街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心質(zhì)控科，上海 201999；3.上海市寶山區(qū)友誼街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心檢驗(yàn)科，上海 201999；4.上海市靜安區(qū)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科（復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院靜安分院），上海 200040

急性呼吸道感染是由多種因素（生物、物理、化學(xué)等刺激）引起的呼吸道急性炎癥的總稱，具有發(fā)病率高、傳播快速、容易大流行等特點(diǎn)，常見于肺炎支原體與呼吸道病毒，后者是成年人住院的常見原因。不同地區(qū)的感染率、病毒感染種類均不相同[1]。在臨床診斷治療呼吸道病毒感染引發(fā)的疾病中，臨床標(biāo)本微生物檢驗(yàn)是極為重要的科學(xué)性依據(jù)之一。影響微生物檢驗(yàn)陽(yáng)性率的因素較多，通常包括標(biāo)本的采集、細(xì)菌培養(yǎng)、分離檢測(cè)和結(jié)果鑒定四個(gè)環(huán)節(jié)的因素。標(biāo)本的采集和運(yùn)送作為病毒檢測(cè)的第一步，其正確性是保證檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確的最基本條件[2]。病毒診斷的成功很大程度上取決于標(biāo)本的質(zhì)量以及在實(shí)驗(yàn)室處理標(biāo)本之前運(yùn)輸和存儲(chǔ)標(biāo)本的條件。基于此，本文主要對(duì)呼吸道病毒檢測(cè)的部分環(huán)節(jié)進(jìn)行分析探討，有助于檢驗(yàn)前的標(biāo)本質(zhì)量控制和檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

檢測(cè)呼吸道病毒的適當(dāng)標(biāo)本前，首先需要了解呼吸道病毒的傳播途徑，其主要有吸入感噴嚏產(chǎn)生煙霧和通過呼吸道粘膜自身接種的毒氣都可能傳播病毒。動(dòng)物和氣候模型系統(tǒng)表明，在特定的環(huán)境條件下，例如低溫和低濕度，呼吸道病毒的傳播可能會(huì)增強(qiáng)。對(duì)于實(shí)驗(yàn)室人員和臨床醫(yī)生而言，根據(jù)呼吸道病毒的可能傳播途徑和傳播特點(diǎn)，可實(shí)施適當(dāng)?shù)母腥究刂拼胧?、選擇適當(dāng)?shù)臉?biāo)本類型并安全地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室操作[3]。

1 基于檢測(cè)方法和病毒類型選擇合理的標(biāo)本類型

急性呼吸道感染病毒病原診斷通常采用呼吸道標(biāo)本，包括拭子，刷子，抽吸物和洗液，并且標(biāo)本可以從許多部位采集，包括前后鼻咽，口咽和鼻孔。上呼吸道標(biāo)本主要包括口咽拭子、鼻咽拭子、鼻咽吸取物；下呼吸道標(biāo)本包括痰液、氣管吸取物、支氣管肺泡灌洗液等。上呼吸道標(biāo)本檢出的病毒能否真正反映下呼吸道感染病原，目前尚有爭(zhēng)論，但是存在一些呼吸道標(biāo)本難以獲得的情況，因此常用鼻咽吸取物和鼻咽拭子代替下呼吸道標(biāo)本[4]。

研究發(fā)現(xiàn)樣本不同類型對(duì)不同病毒的檢測(cè)性能有差異。有研究對(duì)比了鼻咽拭子和口咽拭子，鼻咽拭子對(duì)B 型流感病毒，副流感病毒2 和副流感病毒3 檢測(cè)敏感度更佳，口咽拭子對(duì)甲型流感病毒，2009 甲型H1N1 病毒、腺病毒檢測(cè)敏感度更佳。其中原因之一是由于病毒感染呼吸道的位置，舉例來(lái)說(shuō)，所有流感病毒均會(huì)感染從鼻咽到細(xì)支氣管的呼吸道上皮細(xì)胞，但是2009 甲型H1N1 病毒可以感染呼吸道的下部，包括肺泡。與鼻咽拭子相比，口咽拭子更深入呼吸道。因此口咽拭子對(duì)2009 甲型H1N1 病毒的敏感性更高[5]。綜上所述，檢測(cè)呼吸道病毒時(shí)，要根據(jù)待檢測(cè)病毒的感染特點(diǎn)來(lái)選擇合適的樣本類型。

1.1 鼻咽拭子和鼻咽吸取物

1.1.1 鼻咽拭子 有研究[6]表明，在使用多重實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄（RT-PCR）檢測(cè)呼吸道標(biāo)本時(shí)，鼻咽拭子是最佳的檢測(cè)標(biāo)本類型。通常認(rèn)為，檢測(cè)呼吸道病毒的最佳標(biāo)本類型是鼻咽抽吸物標(biāo)本。鑒于用于獲取鼻咽抽吸物標(biāo)本的方法的復(fù)雜性和侵入性，鼻咽拭子已成為一種替代標(biāo)本類型。并且，在該研究[6]中，鼻咽拭子在RTPCR 中顯示出優(yōu)于或等同于鼻咽吸取物標(biāo)本。因而鼻咽拭子被廣泛用作呼吸道病毒檢測(cè)的RT-PCR 的標(biāo)本，是醫(yī)院常用呼吸道標(biāo)本類型。

鼻咽拭子標(biāo)本與敏感的分子檢測(cè)相結(jié)合，是一種侵入性較小的診斷性呼吸道標(biāo)本，具有足夠的敏感性，可適用于臨床和醫(yī)院門診。例如對(duì)于兒童的主要呼吸道病毒（甲型流感和呼吸道合胞病毒），Lambert等[7]收集了303 對(duì)鼻咽吸取物/鼻咽拭子配套標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)對(duì)于大多數(shù)病毒，NPA 的敏感性等于或高于NTS標(biāo)本。例如對(duì)于腺病毒，鼻咽拭子標(biāo)本的敏感性（65.9%）低于鼻咽吸取物（93.2%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）?？紤]到這一點(diǎn)，對(duì)于到醫(yī)院就診住院的兒童來(lái)說(shuō)，診斷是否感染禽流感或大流行性流感病毒時(shí)，鼻咽吸取物或類似的收集技術(shù)（例如洗鼻液）仍為首選。

Li 等[8]通過檢測(cè)咽炎患者中的15 種常見病毒（包括流感病毒、副流感病毒、腺病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒、腸道病毒、人冠狀病毒和人間質(zhì)肺病毒）發(fā)現(xiàn)，鼻咽拭子的檢測(cè)敏感度方面（74%）均優(yōu)于鼻洗液（49%）和口咽拭子（49%）。其中鼻咽拭子對(duì)鼻病毒和腺病毒的檢測(cè)敏感度高于鼻洗液和口咽拭子，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另一方面，目前尚不清楚鼻咽拭子標(biāo)本是否能被檢測(cè)到多重RT-PCR 靶向的所有病毒，并且其采集需要有經(jīng)驗(yàn)的人員。在操作上，正確收集鼻咽拭子需要插入的深度等于從鼻孔到耳朵外部開口的距離。正確執(zhí)行這種采樣技術(shù)時(shí)，通常會(huì)造成某些患者不適。但是，如果拭子插入深度不夠，會(huì)造成病毒采樣不足從而使得檢測(cè)靈敏度下降。獲取鼻咽拭子標(biāo)本時(shí)，取樣會(huì)使大多數(shù)患者咳嗽，這也可能會(huì)增加醫(yī)院內(nèi)傳播病毒的風(fēng)險(xiǎn)[9]。

1.1.2 鼻咽拭子與口咽拭子組合 針對(duì)流感病毒為例，有文獻(xiàn)綜述基于檢測(cè)方法RT-PCR，比較了單個(gè)標(biāo)本采集方法與通過同一項(xiàng)研究中的任何方法進(jìn)行檢測(cè)的敏感性，得出分析結(jié)論為將兩種侵入性較小的拭子方法（例如鼻拭子和口咽拭子）組合使用，可能與鼻咽拭子通過RT-PCR 檢測(cè)流感病毒的檢測(cè)敏感性大致相同。同時(shí)，數(shù)據(jù)分析得出在兒童和成年人里，兩種收集方法的組合檢測(cè)到的感染數(shù)量比單一樣本類型所檢測(cè)到的數(shù)量均有所增加。檢測(cè)成年人樣本中呼吸道病毒時(shí)，收集兩種不同的呼吸道標(biāo)本對(duì)檢測(cè)結(jié)果可能會(huì)更加有利，在觀察兒童檢測(cè)的研究里表現(xiàn)出，各種收集方法的敏感性差異較小，多種收集方法的組合對(duì)結(jié)果的檢測(cè)性能提高而言收益不大。關(guān)于新型冠狀病毒（COVID-19）的檢測(cè)中也提到了同時(shí)采集1 份鼻咽拭子和1 份口咽拭子于同一標(biāo)本采集管中可以提高陽(yáng)性率[10]。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)參與者認(rèn)為與鼻吸、洗鼻液和鼻拭子取樣比較，鼻刷取樣引起的不適感最大。因此，通過結(jié)合兩種侵入性較小的收集方法很可能在不影響流感病毒檢測(cè)靈敏度的情況下減少患者采樣的不適并可因此更容易重復(fù)采樣而提高患病個(gè)體的流感病毒檢測(cè)效率[11]。臨床檢測(cè)和科研實(shí)驗(yàn)中可以考慮兩種侵入性較小的收集方法。

1.2 口咽拭子

口咽拭子標(biāo)本比鼻咽拭子標(biāo)本較容易獲得，但比唾液標(biāo)本較難獲得。另外，此前一些研究表明，通過RT-PCR 檢測(cè)呼吸道病毒時(shí)，口咽拭子和鼻咽拭子中，綜合而言，鼻咽拭子是更好的選擇[6]。

1.3 痰標(biāo)本

先前研究中，通過多重RT-PCR 比較鼻咽拭子和痰標(biāo)本用于呼吸道病毒的檢測(cè)的效果時(shí)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于大多數(shù)類型的病毒，痰標(biāo)本的檢出率明顯更高。在檢測(cè)到A 型流感病毒INF 和A 型呼吸道合胞病毒RSV時(shí)，痰標(biāo)本相對(duì)于鼻咽拭子的優(yōu)勢(shì)更為明顯，這與為下呼吸道感染有關(guān)。但是，此前研究指出，使用痰液樣本也有一定的局限性。首先，由于其具有高粘度的性質(zhì)，痰需要額外的核酸提取預(yù)處理程序，這一程序尚未標(biāo)準(zhǔn)化，因此如果預(yù)處理標(biāo)本不當(dāng)，可能會(huì)導(dǎo)致無(wú)效的RT-PCR 結(jié)果。其次，一些患者，例如年幼的兒童和老年患者，不能產(chǎn)生痰[6]。

Hun 等[12]發(fā)現(xiàn)，在25%的呼吸道病毒陽(yáng)性痰的成年患者中，其對(duì)應(yīng)鼻咽拭子標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果為陰性，使用實(shí)時(shí)多重RT-PCR 技術(shù)，成人痰液樣本的總體檢出率顯著高于鼻咽拭子。在對(duì)多種標(biāo)本類型進(jìn)行測(cè)試的研究中，可能發(fā)現(xiàn)某些患者鼻咽拭子標(biāo)本呈陰性呼吸道病毒感染，而痰或其他下呼吸道標(biāo)本可能包含較高的病毒載量，痰標(biāo)本的使用將改善病毒的檢測(cè)[13]。曾江等[14]研究也闡述了因?yàn)殪F化誘導(dǎo)痰所收集的痰標(biāo)本主要來(lái)源于下呼吸道，而咽拭子采集的標(biāo)本主要來(lái)自上呼吸道，如果患者的病毒數(shù)量不夠多，因此蔓延到上呼吸道的病毒量較少，導(dǎo)致采集樣本中的病毒載量少于檢測(cè)限，在檢測(cè)過程中可能會(huì)造成假陰性的結(jié)果，因此誘導(dǎo)痰檢測(cè)效果優(yōu)于咽拭子標(biāo)本。而對(duì)于上呼吸道取材標(biāo)本來(lái)說(shuō)，鼻咽部位于鼻腔的后方，口咽的上方，分泌物易滯留在此處，在此處取樣更容易獲得陽(yáng)性結(jié)果，一般而言，標(biāo)本檢測(cè)陽(yáng)性率應(yīng)是鼻咽拭子優(yōu)于鼻拭子和口咽拭子。

同樣的，在Falsey 等[15]的研究中，提出了相同的理論，即使用RT-PCR 方法檢測(cè)時(shí)，痰標(biāo)本顯示的成人診斷率是高于鼻咽拭子的。同時(shí)，其研究的數(shù)據(jù)表明，鼻咽拭子和痰液檢測(cè)可產(chǎn)生互補(bǔ)的結(jié)果。最具成本效益的病毒檢測(cè)方法可能是組合樣品檢測(cè)方法，而不是用單一類型樣本進(jìn)行RT-PCR 分析。這位學(xué)者提出了一個(gè)設(shè)想，可以使用鼻咽拭子中的病毒運(yùn)輸介質(zhì)稀釋痰液樣本，或者可將拭子浸入痰液樣本中，并與鼻咽拭子一同混合在病毒運(yùn)輸介質(zhì)中。這些方法簡(jiǎn)答易行，并提高了檢測(cè)病毒載量，可能可以利用在急診環(huán)境中。目前這一設(shè)想還需要對(duì)組合的樣品測(cè)試和樣品處理進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

痰液適合于病毒核酸和病毒抗原檢測(cè)。應(yīng)當(dāng)注意于清晨進(jìn)行采集，先讓患者刷牙并用無(wú)菌鹽水漱口3次，再用力向無(wú)菌收集器咳嗽咳出深部痰液。應(yīng)注意氣管內(nèi)吸痰時(shí)20 個(gè)油鏡視野下未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌與低倍鏡視野下大于10 個(gè)鱗狀細(xì)胞或者痰液標(biāo)本觀察時(shí)低倍鏡視野下大于10 個(gè)鱗狀細(xì)胞為不合格標(biāo)本[16]。

1.4 唾液標(biāo)本

較鼻咽拭子和鼻咽吸取物，唾液標(biāo)本采集較為便利，減少了與標(biāo)本采集相關(guān)的時(shí)間和成本，同時(shí)，唾液標(biāo)本取樣痛苦較小，可以減輕患者的不適。該研究中，鼻咽拭子和唾液樣本的總檢出率是86.4%（204/236），高于鼻咽拭子標(biāo)本的77.5%（183/236）和唾液標(biāo)本76.3%（180/236），唾液樣品的總檢出率與鼻咽拭子標(biāo)本相當(dāng)?？梢钥闯鐾僖菏菣z測(cè)呼吸道病毒的可行選擇，十分具有潛力。在現(xiàn)實(shí)生活中，可以添加唾液樣本來(lái)提高患者呼吸道病毒檢出率。因?yàn)橥瑫r(shí)測(cè)試多個(gè)標(biāo)本類型增加了實(shí)驗(yàn)成本，相關(guān)文獻(xiàn)[6]提出了更具成本效益的方法，即用額外較小工作量和低成本獲得唾液樣本，將鼻咽拭子與唾液標(biāo)本混合之后，在進(jìn)行呼吸道病毒檢測(cè)，可以有效地提高檢出率。

1.5 氣溶膠

研究展示了一種新的呼吸道病毒標(biāo)本——患者產(chǎn)生的氣霧劑——有可能在不久的將來(lái)成為診斷肺部感染的臨床有用標(biāo)本的潛力。鼻咽拭子和口咽拭子，吸出物和洗液會(huì)從上呼吸道提供粘液，這些粘液并不總是具有與下呼吸道相同的病毒載量或相同種類的病毒。收集、檢測(cè)患者在咳嗽和潮氣呼吸期間產(chǎn)生的氣溶膠顆?？勺鳛槭占粑啦《镜脑\斷標(biāo)本的一種非侵入性的方法。研究使用流感患者作為樣本，在患者氣溶膠標(biāo)本中檢測(cè)到了流感病毒RNA，同時(shí)發(fā)現(xiàn)鼻咽拭子中的流感病毒拷貝數(shù)與氣溶膠顆粒中的病毒拷貝數(shù)之間的相關(guān)性最弱，表明病毒氣溶膠源自肺部感染而不是頭部氣道感染。因此，與鼻咽拭子相比，呼吸道氣霧劑可能為下呼吸道感染提供更具代表性的診斷標(biāo)本來(lái)源。由于這是一種非侵入性的方法，更容易重復(fù)檢測(cè)，因而可適用于監(jiān)測(cè)病程。

目前此種標(biāo)本采集和檢測(cè)還存在待解決的問題，例如設(shè)計(jì)適用于生物氣溶膠的收集方法，因?yàn)槭占瘯r(shí)易夾帶室內(nèi)空氣而使氣溶膠稀釋、氣溶膠本身所含的病毒物質(zhì)量少并且隨后難以檢測(cè)病毒等[17]。

1.6 中鼻甲植絨標(biāo)本

近年Howard[3]的研究中通過直接熒光抗體技術(shù)檢測(cè)了153 例呼吸系統(tǒng)癥狀患兒的配對(duì)鼻咽吸取物和中鼻甲植絨標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)在兒童中，中鼻甲植絨標(biāo)本檢測(cè)常見呼吸道病毒（如呼吸道合胞病毒和人類偏肺病毒）方面與鼻咽吸取物相當(dāng)。不同于鼻咽拭子，它具有采樣深度指示計(jì)，并且比較小的鼻咽拭子具有更大的吸收能力。

2 標(biāo)本采集過程中采樣方式與選用拭子類型影響檢測(cè)結(jié)果

2.1 拭子類型

選擇拭子類型對(duì)檢測(cè)結(jié)果亦會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響，不同材質(zhì)的拭子適用于不同呼吸道病毒檢測(cè)方法，例如尼龍纖維制成的植絨材料能收集到更多的呼吸道上皮細(xì)胞，適于直接免疫熒光法；聚氨酯纖維材料的拭子更適合用于采集過程中較易出血的患兒。普通木柄的棉拭子可能含有對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有害的物質(zhì)，且常不能采集到足夠量的脫落細(xì)胞，不適用于鼻咽或口咽部分泌物的采集[4]。研究發(fā)現(xiàn)即使在室溫下保存15 d，也可以從常規(guī)的棉簽或植絨拭子中成功提取病毒RNA。但植絨拭子比常規(guī)棉簽具有更優(yōu)秀的性能，這種拭子不僅可以長(zhǎng)時(shí)間保持RNA 穩(wěn)定，而且從拭子中釋放出的核酸量與呈陽(yáng)性曲線的時(shí)間高度一致。盡管仍可根據(jù)研究和常規(guī)診斷工作結(jié)果推薦棉簽拭子，但將植絨拭子與分子檢測(cè)結(jié)合使用可進(jìn)一步提高呼吸道病毒的檢出率。如果樣品要遠(yuǎn)距離運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室或樣品處理有延遲，則植絨拭子的優(yōu)勢(shì)更大[18]。例如最近急性嚴(yán)重呼吸綜合征冠狀病毒2（SARSCoV-2）檢測(cè)研究中，推薦選用合成纖維或人造纖維，不推薦海綿或棉花拭子，因?yàn)槊藁ǖ睦w維對(duì)蛋白質(zhì)吸附較強(qiáng)，導(dǎo)致病毒不易洗脫到保存液中，另一種尼龍類的纖維的吸水性不佳，從而導(dǎo)致采樣量不足，影響檢出效率，也不被推薦[19]。

2.2 采集方式

由于多數(shù)病毒性急性呼吸道感染，病毒的排泌發(fā)生在癥狀出現(xiàn)前，病毒量在癥狀出現(xiàn)后迅速增加，之后逐漸下降，標(biāo)本應(yīng)盡快采集。對(duì)于免疫功能低下的感染者，較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)都可能檢測(cè)到病毒。盡可能采集多種類型的標(biāo)本和（或）連續(xù)多個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集不同部位的標(biāo)本，以滿足多種檢測(cè)方法的聯(lián)合檢測(cè)，同時(shí)要注意標(biāo)本采集量[4]。Liesbeth 等[20]在研究中觀察到，左右鼻孔之間甲流病毒載量的差異可能與定量RTPCR 的變異性、鼻孔之間的生物學(xué)差異、取樣偏倚或這些的任何組合有關(guān)。定量RT-PCR 技術(shù)的特點(diǎn)是內(nèi)部和內(nèi)部變異性低。由此進(jìn)一步提出了，右撇子或左撇子可能會(huì)獲得與右鼻孔或左鼻孔不同的拭子，或者拭子的服用順序也會(huì)引起變異，目前這個(gè)問題有待進(jìn)一步的研究。生物學(xué)差異可能包括解剖上的鼻子、鼻中隔異常、病毒脫落或鼻孔堵塞導(dǎo)致的變異性。研究中顯示出的差異表明，左右鼻孔之間的甲流病毒載量的差異突顯了正確采樣的重要性，對(duì)建立標(biāo)準(zhǔn)化采樣程序的需求有極大幫助。解決辦法：①每名患者一拭子（大多數(shù)研究現(xiàn)在是這種情況）；②每名患者兩拭子（每個(gè)鼻孔一個(gè)），兩拭子（每個(gè)鼻孔一個(gè)）收集在同一小瓶中；③使用一根拭子取樣兩個(gè)鼻孔。進(jìn)一步探索中鼻甲拭子的使用，患者鼻孔之間的變異性，并提出一種標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)本采集方法。這將改善對(duì)流感/呼吸道病毒的充分檢測(cè)，最終將有助于在臨床試驗(yàn)中充分監(jiān)測(cè)治療效果。

關(guān)于新型冠狀病毒檢測(cè)的文獻(xiàn)中闡述了輕癥、高度疑似患者或有密切接觸史者，核酸標(biāo)本采集優(yōu)選順序?yàn)楸茄适米?、口咽拭子、痰液[10]。最近也有研究表明通過回顧353 名同時(shí)接受兩種標(biāo)本檢查（鼻咽拭子和口拭子）患者的病歷，在COVID-19 爆發(fā)的后期，口咽拭子的假陰性率升高，鼻咽拭子可能比口咽拭子更適合[21]?；颊卟煌潭鹊母腥竞桶Y狀狀況，應(yīng)被納入標(biāo)本類型選擇的考慮因素中。

3 不同病毒、實(shí)驗(yàn)?zāi)康南逻x擇最合適的運(yùn)輸和保存方法

研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于甲型流感病毒，在＜27℃的溫度下存儲(chǔ)長(zhǎng)達(dá)72 h，而對(duì)于乙型流感病毒，則在48 h 后，CT 值穩(wěn)定。在室溫或更低溫度下，甲型流感病毒的運(yùn)輸期最多可穩(wěn)定3 d，乙型流感病毒的運(yùn)輸期最多可穩(wěn)定2 d（因此無(wú)需冷鏈管理）[22]。有研究通過收集和檢測(cè)患者的鼻咽和口咽標(biāo)本，將其保存在2～8°C 的病毒運(yùn)輸培養(yǎng)基中，并使用RT-PCR 檢測(cè)甲型和乙型流感，發(fā)現(xiàn)病毒樣品可以保存至少5 d，期間進(jìn)行檢測(cè)工作不會(huì)影響樣品的陽(yáng)性比例[23]。以急性嚴(yán)重呼吸綜合征冠狀病毒2 的臨床檢測(cè)為例，原則上樣本應(yīng)立即送檢。當(dāng)需要存儲(chǔ)帶檢測(cè)樣本時(shí)，采集后，應(yīng)貼上相應(yīng)的標(biāo)簽，樣本可在4℃以下保存72 h，如果預(yù)計(jì)提取檢驗(yàn)會(huì)延遲，則將樣本儲(chǔ)存在-70℃或更低的溫度，提取的核酸應(yīng)儲(chǔ)存于-70℃或者更低的溫度[19]。

相似地，理想情況下，應(yīng)在臨床癥狀發(fā)作后3 d內(nèi)收集用于病毒分離的標(biāo)本。用于病毒分離的臨床標(biāo)本應(yīng)放置在4～8℃的溫度下，并立即運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。如果要在48～72 h 內(nèi)將臨床標(biāo)本運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室，則可以將標(biāo)本保存在4～8℃的溫度下。否則，應(yīng)將其冷凍在-70℃或更低的溫度下，直到運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室。

需要長(zhǎng)期保存時(shí)，保存在在液氮中是最佳的。流感病毒原液應(yīng)在-70～-80℃下保存并在使用前融化。為了長(zhǎng)期存儲(chǔ)，病毒庫(kù)應(yīng)保持在-135℃或液氮（-150℃）中。解凍后，應(yīng)將病毒原種保存在4～8℃的冰上，并在當(dāng)天使用。為防止傳染性喪失，必須避免反復(fù)冷凍和解凍。當(dāng)需要將病毒長(zhǎng)期保存時(shí)，可以考慮凍干方法，其可在4℃穩(wěn)定地長(zhǎng)期保存。凍干過程可能導(dǎo)致病毒原種的傳染性喪失。因此，僅在較低的病毒滴度不會(huì)對(duì)測(cè)定產(chǎn)生不利影響或沒有其他長(zhǎng)期儲(chǔ)存選擇的情況下，才應(yīng)使用凍干法[24]。

研究法醫(yī)微生物標(biāo)本時(shí)，進(jìn)行了類似的樣本檢測(cè)，為了評(píng)估保存活病毒和病毒基因組的能力，進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，將流感病毒添加到通用病毒運(yùn)輸系統(tǒng)的運(yùn)輸介質(zhì)中，并在不同溫度下保存3 個(gè)月以上，然后進(jìn)行病毒滴定和流感血凝素基因的定量分析[25]。結(jié)果表明，盡管在室溫下保存29 d 后仍無(wú)法檢測(cè)到活病毒，但即使在99 d 后，仍可以在4℃下保存。定量PCR分析表明血凝素基因在4℃和室溫下均維持99 d。因此，當(dāng)無(wú)法在采樣后將病毒標(biāo)本冷凍保存時(shí)，在通用病毒運(yùn)輸系統(tǒng)的運(yùn)輸介質(zhì)中以4℃的溫度保存是有效的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在4℃下長(zhǎng)期保存對(duì)活病毒和病毒基因組幾乎沒有影響。

不同種類的病毒對(duì)儲(chǔ)存的溫度和時(shí)間可能具有差別，綜合分析，一般臨床檢測(cè)可以根據(jù)實(shí)際設(shè)備和要求情況，盡量選擇儲(chǔ)存和運(yùn)輸樣本最優(yōu)的方法。

在臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)呼吸道病毒樣本時(shí)，不同標(biāo)本類型及檢測(cè)方法具有貯存與運(yùn)輸?shù)臉?biāo)準(zhǔn)。根據(jù)2018年美國(guó)傳染病學(xué)會(huì)和美國(guó)微生物學(xué)會(huì)最新發(fā)布的《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室用于傳染病診斷的指南》[26]中說(shuō)明，使用組織、胸水、肺泡灌洗液等進(jìn)行病毒培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)使用病毒轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基并冷藏保存，立刻送檢；使用鼻咽拭子、口咽拭子、血液等體液標(biāo)本進(jìn)行病毒直接抗原檢測(cè)時(shí)，應(yīng)使用密閉容器并在2 h 內(nèi)送檢。

4 結(jié)論與展望

最近，使用現(xiàn)代分子診斷測(cè)試的大量研究表明，在40%～50%的患有急性呼吸道疾病的住院成年人中可檢測(cè)到呼吸道病毒。及時(shí)檢測(cè)出病毒感染，對(duì)臨床診斷治療非常重要，具有重要的臨床意義。使用不同的研究人群、多種采樣技術(shù)、不同的診斷檢測(cè)方法（例如免疫熒光，培養(yǎng)和核酸擴(kuò)增測(cè)試）、選擇不同種類的呼吸道病毒進(jìn)行測(cè)試等對(duì)選擇樣本類型、存儲(chǔ)方式時(shí)間等等都具有影響。準(zhǔn)確地檢測(cè)呼吸道病毒，選擇適當(dāng)?shù)臉?biāo)本、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)夭杉瘶?biāo)本以及恰當(dāng)運(yùn)輸、保存標(biāo)本是得到準(zhǔn)確、有效、及時(shí)的檢測(cè)結(jié)果的基礎(chǔ)，從而為臨床工作的順利進(jìn)行提供輔助。