張東晨， 萬學(xué)峰

(1.河北省保定市第一中心醫(yī)院皮膚科， 河北 保 定 071000 2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科， 新疆 烏魯木齊 830054)

近些年臨床采用5-氨基酮戊酸光動力療法(ALA-PDT)治療日光性角化病、淺表型基底細(xì)胞癌和Bowen病等，是一種有效治療淺表皮膚惡性腫瘤的方法。研究表明PDT治療淺表型基底細(xì)胞癌、Bowen病和日光性角化病1年清除率約為65%～100%[1,2]，影響PDT療效的重要因素之一是病變組織內(nèi)卟啉物質(zhì)的蓄積，通過增加卟啉物質(zhì)在病變組織中的蓄積可提高PDT的療效，運(yùn)用該方法治療不同類型的腫瘤是目前研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。靶向性原卟啉IX(PpIX)的蓄積可通過藥物前體ALAS旁路傳遞及抑制血紅素生物合成終端酶亞鐵螯合酶(FECH)而獲取。同時通過螯合鐵降低FECH的活性，增加該途徑中前體藥物誘導(dǎo)PpIX的蓄積。PpIX是一種底物以ATP依賴性藥物外排泵ABCG2(BCRP/ABCG2)[3]，ABCG2蛋白主要位于細(xì)胞膜，也有報道位于線粒體內(nèi)膜和細(xì)胞系的其它細(xì)胞內(nèi)。ABCG2過度表達(dá)來源于人細(xì)胞系時可致細(xì)胞內(nèi)PpIX的熒光降低，這與PDT療效的降低相關(guān)聯(lián)，當(dāng)細(xì)胞孵育于含ABCG2抑制劑如煙曲霉毒素C[4,5]、Ko-134[6]或甲磺酸伊馬替尼[7]時，可逆轉(zhuǎn)ABCG2蛋白的過度表達(dá)。因此本研究采用人類細(xì)胞系(HaCaT表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，HSC-2基底細(xì)胞癌)，采用ALA處理上述細(xì)胞系，在有/無ABCG2抑制劑甲磺酸伊馬替尼時，對卟啉物質(zhì)的蓄積、ABCG2蛋白的表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)卟啉物質(zhì)的定位進(jìn)行評價。

1 材料與方法

1.1一般材料

1.1.1細(xì)胞系:人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT和人皮膚基底細(xì)胞癌細(xì)胞HSC-2購于武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.1.2主要試劑:細(xì)胞培養(yǎng)用DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購于Gibco公司，抗體ABCG2(BS-0662R)購自于博奧森，抗體GAPDH(AB-P-R 001)購自于杭州賢至生物有限公司，HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(BA1054)購自于武漢博士德生物工程有限公司，磷酸酶抑制劑(S1873)、RIPA裂解液(P0013B)、PMSF(ST506)和BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0010)購自于碧云天，ECL底物液(NCI5079)購自于Thermo，人原卟啉(EPP)ELISA試劑盒(ml711200)購自于上海酶聯(lián)，ALA購自于復(fù)旦張江生物制藥股份有限公司，ABCG2抑制劑甲磺酸伊馬替尼(Imatinib)購自于諾華制藥有限公司，熒光線粒體探針(MitoTracker-Green)購自于碧云天(C1048)。

1.2方 法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組干預(yù)方法:人HaCaT角質(zhì)形成細(xì)胞保存于達(dá)爾貝科改良Eagles’s培養(yǎng)基，內(nèi)含5%胎牛血清和1%非必需氨基酸，人基底細(xì)胞癌細(xì)胞HSC-2接種于RPMI培養(yǎng)基中，其含有10%FCS。細(xì)胞在具有5%CO2和飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)。分組為：HaCaT細(xì)胞/HSC-2細(xì)胞作為空白對照組，HaCaT細(xì)胞/HSC-2細(xì)胞+ALA組和HaCaT細(xì)胞/HSC-2細(xì)胞+ALA+甲磺酸伊馬替尼作為實(shí)驗(yàn)組。細(xì)胞干預(yù)方法為：細(xì)胞密度達(dá)24×104cells/cm2時鋪板，鋪板后24h分別給予濃度為1mM ALA和1uM甲磺酸伊馬替尼0.5ml，避光環(huán)境下孵育4h，處理上述細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞蛋白提取、ELISA和細(xì)胞熒光染色試驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞蛋白的提取:六孔板培養(yǎng)細(xì)胞，在細(xì)胞長滿的情況下每孔加入100μL含PMSF(100mM)的裂解液，于冰上裂解30min，然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中，于4℃下12000rpm離心5min，將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒0.5ml的離心管中放于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3蛋白濃度的測定:將蛋白樣品進(jìn)行10倍稀釋，將BSA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋，制成蛋白濃度為1，0.8，0.6，0.4，0.2標(biāo)準(zhǔn)蛋白。將PBS稀釋過的蛋白樣品、稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)蛋白分別加入96孔板內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)品各設(shè)2個平行孔，待測樣品設(shè)3個平行孔，每孔加入體積20μl。加入PBS的2個平行孔為空白對照。按50:1比例將BCA試劑盒中A液和B液進(jìn)行混合，將混合液加入96孔板內(nèi)，每孔加入200μL。37℃避光孵育30min后，用DG-3022A酶標(biāo)儀測定OD568，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度和相應(yīng)的OD值計算直線回歸方程，根據(jù)蛋白樣品OD值，利用回歸方程計算出樣品蛋白濃度。

1.2.4Western blotting 半定量檢測目的基因表達(dá):SDS-PAGE凝膠電泳梯度分離目的蛋白后將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫?fù)u床封閉2h，分別加入ABCG2(1:1000)和GAPDH(1:1000)抗體4℃孵育過夜，TBST沖洗6次，5min/次，加入HRP偶聯(lián)二抗(1:50000)室溫孵育2h，TBST沖洗6次，5min/次，ECL顯影液顯影后，X光膠片壓片后依次放入顯影液顯影、定影液定影，沖洗膠片。晾干膠片，掃描膠片，用BandScan分析膠片灰度值。

1.2.5ELISA檢測:①樣品處理：細(xì)胞收集在EP管中，加入低滲溶液放入液氮3～5s后提出轉(zhuǎn)入-20℃冰箱(20～30s)，再取出室溫解凍，重復(fù)三次。3000rpm離心10min，取上清檢測。②ELISA實(shí)驗(yàn)步驟：加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕?biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液50μL，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品50μL。酶標(biāo)板覆膜后37℃孵育30分鐘。棄去液體，洗板5次，每次浸泡30S，甩干并在吸水紙上輕拍將孔內(nèi)液體拍干。每孔加酶標(biāo)試劑50μL，加上覆膜，37℃溫育30min。棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次。每孔先加顯色液A 50μL，再加顯色液B 50μL，震蕩混勻，酶標(biāo)板加上覆膜37℃避光孵育15min左右。立即用酶標(biāo)儀在450nm波長測量各孔的光密度(OD值)。

1.2.6細(xì)胞PpIX的共聚焦顯微鏡檢查:細(xì)胞接種到含ALA的35mm培養(yǎng)皿18h(24×104cells/cm2)，細(xì)胞用PBS洗滌兩次。含或不含ALA(1mM)或甲磺酸伊馬替尼(1μM)的DMSO加入完整培養(yǎng)基，細(xì)胞在37℃，5%CO295%空氣的黑暗環(huán)境中孵育4h。3.5h后，細(xì)胞用500nM的熒光線粒體探針MitoTracker-Green(分子探針)在37℃條件下染色30min。405和488nm半導(dǎo)體激光光源并發(fā)射610～650nm和515～555nm的帶通濾波器分別用于PpIX和MitoTracker-Green熒光成像強(qiáng)度。對于每張圖像，采用100×油鏡Leica SP5顯微鏡(No11506210，徠卡顯微鏡系統(tǒng)，德國)觀察，1024×1024像素成像格式，每幅圖像掃描分辨率為200Hz。

2 結(jié) 果

2.1ALA和甲磺酸伊馬替尼對ABCG2蛋白表達(dá)的影響:Western blot 結(jié)果顯示，和對照組相比，在HaCaT細(xì)胞和HSC-2細(xì)胞中，加入ALA(1mM)處理后，細(xì)胞中ABCG2的蛋白表達(dá)明顯降低；在加入ALA(ALA)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步加入甲磺酸伊馬替尼處理后，細(xì)胞中ABCG2的蛋白表達(dá)更加顯著的降低(圖1)(P<0.01)。用BandScan分析不同處理組中ABCG2蛋白表達(dá)的灰度值并進(jìn)行統(tǒng)計，得出的ABCG2的蛋白相對表達(dá)量的統(tǒng)計結(jié)果得出相同結(jié)論(圖2)。

圖1 Western bolt結(jié)果

2.2ALA和甲磺酸伊馬替尼對細(xì)胞內(nèi)原卟啉含量的影響:通過人卟啉ELASA檢測試劑盒的檢測結(jié)果顯示，在人類HaCaT角質(zhì)形成細(xì)胞中，加入ALA(1mM)處理后，細(xì)胞中總卟啉量明顯升高；在加入ALA(ALA)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步加入ABCG2抑制劑甲磺酸伊馬替尼處理后，細(xì)胞中總卟啉量更加顯著的升高；與HaCaT角質(zhì)形成細(xì)胞相比，在HSC-2細(xì)胞中，加入ALA(1mM)處理后，細(xì)胞中總卟啉量明顯升高；在加入ALA(ALA)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步加入ABCG2抑制劑甲磺酸伊馬替尼處理后，細(xì)胞中總卟啉量更加顯著的升高(圖3)(P<0.01)。

圖2 Western bolt 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

圖3 ELASA結(jié)果

圖4 熒光圖

2.3ALA和甲磺酸伊馬替尼對卟啉細(xì)胞內(nèi)定位的影響:為進(jìn)一步探討ALA和甲磺酸伊馬替尼對卟啉物質(zhì)細(xì)胞內(nèi)定位的影響，采用激光掃描共聚焦顯微鏡研究ALA誘導(dǎo)的卟啉在細(xì)胞內(nèi)定位。用ALA分別處理HaCaT細(xì)胞和HSC-2細(xì)胞后，卟啉物質(zhì)的熒光彌漫分布在所有細(xì)胞的胞漿中，尤其表現(xiàn)在HaCaT細(xì)胞；而HSC-2細(xì)胞內(nèi)，卟啉物質(zhì)的熒光集中分布在細(xì)胞漿及細(xì)胞核(圖4)。表明對不同的細(xì)胞類型，卟啉物質(zhì)的分布部位有顯著差異。如前所述甲磺酸伊馬替尼與ALA共同孵育情況下，同時熒光染色試驗(yàn)結(jié)果還顯示，HaCaT細(xì)胞和HSC-2細(xì)胞卟啉物質(zhì)熒光強(qiáng)度均有不同程度的增加(圖4)。

3 討 論

基底細(xì)胞癌是一種最常見的皮膚惡性腫瘤，發(fā)病率不斷升高[8]。臨床多采用液氮冷凍、激光、微波、放療及手術(shù)等治療方法。近些年隨著新型光敏劑的不斷問世，為PDT的臨床應(yīng)用提供了更佳的光敏劑，尤其適用于不宜進(jìn)行傳統(tǒng)手術(shù)及非手術(shù)治療的患者，具有非手術(shù)創(chuàng)傷及良好的美容效果等特點(diǎn)。

本研究通過探討ALA及甲磺酸伊馬替尼對HaCaT細(xì)胞和HSC-2細(xì)胞內(nèi)卟啉物質(zhì)含量的影響以及對ABCG2蛋白表達(dá)的影響。在單一ALA作用的情況下，與空白對照組相比，HaCaT細(xì)胞和HSC-2細(xì)胞中卟啉含量增加；而ALA聯(lián)合甲磺酸伊馬替尼的情況下，較單一使用ALA處理相比，HSC-2細(xì)胞中卟啉含量增加更明顯。提示ABCG2抑制劑可增強(qiáng)HSC-2對卟啉物質(zhì)的攝取，而細(xì)胞內(nèi)卟啉物質(zhì)的含量增加有助于提高PDT的療效。同時采用免疫印跡法檢測細(xì)胞ABCG2蛋白的表達(dá)，與空白對照組相比，ALA可降低HSC-2細(xì)胞中ABCG2蛋白的表達(dá)，而ALA聯(lián)合甲磺酸伊馬替尼可顯著降低HSC-2細(xì)胞中ABCG2蛋白的表達(dá)，有關(guān)ABCG2蛋白表達(dá)的研究結(jié)果與Bebes等研究一致[6]。有研究表明PpIX的細(xì)胞內(nèi)定位模式對PDT的療效有重要影響，尤其對腫瘤細(xì)胞死亡的模式[9,10]。研究表明某些靶點(diǎn)對PDT的敏感性強(qiáng)，如在線粒體或溶酶體內(nèi)蓄積的卟啉物質(zhì)可加速細(xì)胞的凋亡，同時卟啉物質(zhì)與質(zhì)膜的結(jié)合可加速細(xì)胞的壞死，從而導(dǎo)致腫瘤組織的壞死[11,12]。本研究采用激光共聚焦顯微鏡檢查的結(jié)果表明，與單一ALA作用于HSC-2細(xì)胞相比，ALA聯(lián)合甲磺酸伊馬替尼可顯著增強(qiáng)HSC-2細(xì)胞內(nèi)熒光物質(zhì)的分布及強(qiáng)度，同時ABCG2抑制劑甲磺酸伊馬替尼可顯著影響不同細(xì)胞類型的卟啉物質(zhì)蓄積、分布或聚集狀態(tài)[5,13]。

總之，本研究表明在HaCaT和HSC-2細(xì)胞中，ALA和/或ABCG2抑制劑甲磺酸伊馬替尼可提高HSC-2細(xì)胞內(nèi)卟啉物質(zhì)的含量，同時降低細(xì)胞內(nèi)ABCG2蛋白的表達(dá)，從而為ABCG2抑制劑甲磺酸伊馬替尼聯(lián)合ALA可提高PDT的療效提供了理論依據(jù)，但對正常的角質(zhì)形成細(xì)胞無此作用，為進(jìn)一步采用ABCG2抑制劑在PDT治療基底細(xì)胞癌中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。