李清華， 馬志紅 ， 李 立， 唐艷麗， 陳寶剛， 唐桂華

(河北省承德市中心醫(yī)院耳鼻喉科， 河北 承德 067000)

喉癌是常見的頭頸部惡性腫瘤，其中以鱗狀細(xì)胞癌最為常見，約占96%～98%。近年來喉癌發(fā)病率呈明顯上升趨勢[1]。與其他頭頸部鱗狀細(xì)胞癌一樣，喉部黏膜癌變的無限增殖也是以單克隆的方式進(jìn)行[2]。目前喉癌的治療主要有手術(shù)切除、放射治療、化學(xué)治療、生物治療等，喉癌早期患者手術(shù)治療效果好，但發(fā)展到中晚期，則需要行部分喉、3/4喉或全喉切除術(shù)，患者還要短期或終身佩戴氣管套管，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，且預(yù)后較差、死亡率較高。因此，我們需要根據(jù)喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病的分子機(jī)制發(fā)現(xiàn)、探索與其發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有重要意義的生物學(xué)標(biāo)志物，以更全面的預(yù)測患者的預(yù)后。SLC7A11既是哺乳動物重要的抗氧化蛋白，也是N-和C-末端均位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的12通道跨膜蛋白，并且不依賴鈉的胱氨酸和谷氨酸的電中性轉(zhuǎn)運(yùn)體系統(tǒng)Xc由其與單跨膜蛋白SLC3A2共同組成的[3,4]。在維持細(xì)胞內(nèi)外的谷胱甘肽氧化還原平衡中，SLC7A11一方面編碼胱氨酸/谷氨酸xCT的轉(zhuǎn)運(yùn)載體，另一方面又特異性轉(zhuǎn)運(yùn)胱氨酸和谷氨酸，因此，起到了重要作用[5]。在腫瘤中已發(fā)現(xiàn)影響谷胱甘肽氧化還原循環(huán)平衡的轉(zhuǎn)運(yùn)體，而細(xì)胞毒性抗腫瘤治療的主要靶向即為這些轉(zhuǎn)運(yùn)體，其中重要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白即為SLC7A11。多篇國內(nèi)外報道中SLC7A11已經(jīng)證明參與多種腫瘤的發(fā)生,包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、胃癌及食道癌等。雖然這些研究表明SLC7A11在腫瘤的診斷、預(yù)后和治療中有著重要的意義，但是SLC7A11在人類喉鱗狀細(xì)胞癌中的作用及機(jī)制尚不明確。Ki-67是增殖性細(xì)胞核的標(biāo)記物，代表細(xì)胞增殖水平，是惡性腫瘤增殖效率的反應(yīng)指標(biāo)，Ki-67的高表達(dá)又是細(xì)胞增殖活躍的重要標(biāo)志。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為它與多種惡性腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移、預(yù)后均具有相關(guān)性。國內(nèi)有關(guān)于SLC7A11、Ki-67在喉癌組織的表達(dá)，但兩者共同的報道鮮有。本研究主要是采用免疫組化SP法檢測喉癌組織中SLC7A11、Ki-67的表達(dá)，探討兩者與喉癌患者預(yù)后、復(fù)發(fā)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1臨床資料:收集首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科2008年8月至2014年11月期間收治的喉癌患者117例(喉癌組)，均經(jīng)纖維電子喉鏡、CT、增強(qiáng)CT及術(shù)前活檢、術(shù)后病理結(jié)果明確為原發(fā)性喉鱗狀細(xì)胞癌，并且入院前未行放化療及生物治療，其中聲門上型59例，聲門型55例，聲門下型3例。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤，合并全身感染及嚴(yán)重肝腎功能不全。其中，男110例，女7例，年齡在35～76歲(≤65歲63例，>65歲54例，平均年齡57.8±9.4歲)；TNM分期(UICC2002)：其中T1、T2期86例，T3、T4期31例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移13例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移104例；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移4例，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移113例；組織分化程度：高分化58例，中分化49例，低分化10例。同期選擇同院收治的聲帶息肉患者65例(對照組)，男56例，女9例，年齡在37～68歲(≤65歲45例，>65歲20例，平均年齡53.5±8.9歲)。喉癌組與對照組中性別構(gòu)成χ2=3.222，P>0.05無統(tǒng)計學(xué)意義。年齡、病史經(jīng)過χ2兩組相差不顯著，P>0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。兩組性別、年齡具有可比性。本研究符合《赫爾辛宣言》，并經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均告知及簽署知情同意書后納入本次研究。

1.2SLC7A11、Ki-67表達(dá)及檢測:均采用免疫組化SP法。取喉癌組和對照組手術(shù)病理標(biāo)本，常規(guī)石蠟包埋，利用石蠟切片機(jī)予4μm厚連續(xù)切片。經(jīng)恒溫烤箱烤片干燥處理后，二甲苯及梯度濃度(100%、95%、75%)乙醇脫蠟脫水;3% H2O2溶液滅活內(nèi)源性過氧化物酶;后在枸櫞酸緩沖液高溫下通過壓力鍋進(jìn)行抗原修復(fù)5 min，直至室溫冷卻。10%山羊血清封閉非特異性抗原，分別滴加多克隆抗體SLC7A11(1∶500)、滴加單克隆抗體Ki-67(1∶100)，用 PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照，4℃孵育過夜。第二日，滴加二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、干燥、封片。光學(xué)顯微鏡下觀察并讀取切片結(jié)果。其判定標(biāo)準(zhǔn)為：SLC7A11與Ki-67的陽性染色分別定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞核，都呈現(xiàn)棕褐色、棕黃色(圖1)。在光學(xué)顯微鏡400倍視野下隨機(jī)選取至少5個不同的代表性區(qū)域，計算陽性細(xì)胞所占比例。陽性細(xì)胞所占比例：<10%為0分，10%～25%為1分，>25%～75%為2分，>75%為3分。細(xì)胞染色強(qiáng)度:未見染色、弱(淺黃色)、中(棕黃色)、強(qiáng)(棕褐色)分別計0、1、2、3、4分，即顏色越深，計分越多。陽性表達(dá)=陽性細(xì)胞比例評分×染色強(qiáng)度得分乘積≥1。

圖1 SLC7A11、Ki-67在喉癌組織中的表達(dá)(SP褐色×400)

1.3觀察隨訪:117例患者均建立隨訪記錄檔案，每3個月至半年通過門診或電話隨訪，追蹤隨訪3～5年，了解并記錄復(fù)發(fā)、預(yù)后及死亡情況，并統(tǒng)計3年復(fù)發(fā)率和5年死亡率。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法:采用SPSS23.0統(tǒng)計軟件對實(shí)驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。主要采用四格表χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1喉癌組合對照組SLC7A11、Ki-67陽性表達(dá)比較:喉癌組SLC7A11陽性表達(dá)64例(54.7%)，Ki-67陽性表達(dá)41例(35.0%)，對照組SLC7A11陽性表達(dá)20例(30.9%)，Ki-67陽性表達(dá)10例(15.34%)，兩組SLC7A11、Ki-67陽性表達(dá)率比較有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2分別為9.630、8.006，P<0.05)。

2.2喉癌組織中SLC7A11、Ki-67的陽性表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系:喉癌組中SLC7A11陽性表達(dá)與臨床分期有關(guān)(P<0.05)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、組織分化程度無關(guān)(P均>0.05)。喉癌組織中Ki-67陽性表達(dá)在不同的臨床分期中有明顯差異，臨床分期愈晚，Ki-67陽性表達(dá)愈高(P<0.05)。而喉癌組織中Ki-67陽性表達(dá)與年齡、性別、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P均>0.05)，見表1。

表1 喉癌組織SLC7A11 Ki-67陽性表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

表2 3年復(fù)發(fā)者SLC7A11和Ki-67表達(dá)情況

2.3SLC7A11、Ki-67在喉鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)與預(yù)后:本次研究117例喉癌患者中，術(shù)后3年復(fù)發(fā)42例，復(fù)發(fā)率是35.8% (42/117)。而復(fù)發(fā)者中SLC7A11的陽性表達(dá)和Ki-67陽性表達(dá)見表2。在117例喉癌患者中，術(shù)后5年內(nèi)患者死亡為12例，生存為105例，其生存率為89.8%(105/117)，其中死亡者和生存者的SLC7A11和Ki-67陽性表達(dá)見表3，說明生存者與死亡者者的表達(dá)陽性率差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表3 5年死亡者及生存者SLC7A11和Ki-67表達(dá)情況

3 討 論

喉癌是來源于喉腔黏膜上皮組織的惡性腫瘤，其惡性程度及預(yù)后主要從細(xì)胞組織學(xué)分級、臨床病理分型以及是否有淋巴轉(zhuǎn)移等病理參數(shù)幾方面評定[6]。胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(System Xc--)是由一條重鏈4F2hc(SLC3A2)和一條輕鏈xCT(SLC7A11)構(gòu)成。重鏈SLC3A2負(fù)責(zé)幾種氨基酸運(yùn)輸系統(tǒng), 而輕鏈SLC7A11是只負(fù)責(zé)胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)，使胱氨酸轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)并按照1∶1的比率將谷氨酸轉(zhuǎn)出。細(xì)胞內(nèi)胱氨酸(cystine)的攝取為谷胱甘肽(glutathione,GSH)的合成提供原料，GSH作為體內(nèi)主要的抗氧化劑，在對抗氧化應(yīng)激對機(jī)體的毒性反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用。而SLC7A11蛋白通過促進(jìn)胱氨酸汲取以及谷胱甘肽生物合成，使機(jī)體免受氧化應(yīng)激和鐵細(xì)胞死亡反應(yīng)[7]。如前所述，SLC7A11(xCT)是一種N-和C-末端位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的12通道跨膜蛋白，其同單跨膜蛋白SLC3A2組成不依賴鈉的胱氨酸和谷氨酸的電中性轉(zhuǎn)運(yùn)體系統(tǒng)Xc，據(jù)研究在多種惡性腫瘤中廣泛存在[8，9]。對腫瘤細(xì)胞微環(huán)境進(jìn)行特異性調(diào)控是這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的一個重要生物學(xué)特性，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤及癌細(xì)胞較正常細(xì)胞的優(yōu)勢生長。有研究表明SLC7A11許多惡性腫瘤中呈過度表達(dá)，且與不良預(yù)后相關(guān),作為診斷的生物標(biāo)志物。Robert SM等[10]報道SLC7A11過度表達(dá)促進(jìn)腫瘤增長,影響腫瘤患者的總體生存率。Guo等[11]證明SLC7A11在肝細(xì)胞癌(HCC)中明顯增高,與肝癌患者的不良預(yù)后直接有關(guān)。而本研究結(jié)果顯示，SLC7A11在喉癌組織中高表達(dá)，聲帶息肉中的表達(dá)水平相比，具有顯著性差異(P<0.05)，并其陽性表達(dá)與臨床分期有關(guān)，T3、T4分期組織中的高表達(dá)與在T1、T2分期的表達(dá)有顯著性的差異(P<0.05)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、組織分化程度無關(guān)。SLC7A11陽性表達(dá)在復(fù)發(fā)患者中明顯高于未復(fù)發(fā)者，而在死亡者與生存者中的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，因此可表明SLC7A11能促進(jìn)喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展，但可能在患者生存時間上影響不大。

Ki-67是一種與細(xì)胞周期相關(guān)的增殖細(xì)胞核蛋白，是增殖性細(xì)胞核的標(biāo)記物，代表著細(xì)胞增殖水平，能較好地反映惡性腫瘤的增殖狀態(tài)，能廣泛用于常規(guī)病理研究。既往研究中，Ki-67蛋白的準(zhǔn)確表達(dá)、調(diào)控及分布，是細(xì)胞增殖、完成細(xì)胞周期生長不可缺少的，是檢測腫瘤細(xì)胞增殖強(qiáng)弱的標(biāo)志物，與多種癌癥的發(fā)展、轉(zhuǎn)移、預(yù)后等方面均有關(guān)聯(lián)，是腫瘤預(yù)后評估的經(jīng)典指標(biāo)。Wang SJ[12]建議Ki-67不但可以預(yù)測胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(PNENs)的預(yù)后,它針對該類患者還可以作為衡量患者接受手術(shù)或非手術(shù)治療的一個重要的參數(shù)。Bieging KT[13]證明在食管鱗狀細(xì)胞癌SLC7A11陽性表達(dá)與Ki-67指數(shù)呈明顯正相關(guān)。本研究表明Ki-67的陽性表達(dá)與喉癌的臨床分期和T分期有密切相關(guān)，本研究中臨床分期愈晚，Ki-67陽性表達(dá)愈高，與年齡、性別、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。Ki-67陽性表達(dá)方面復(fù)發(fā)者明顯高于未復(fù)發(fā)者，并差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但在死亡患者與生存者中的表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異。因此，表明Ki-67對喉癌的復(fù)發(fā)有影響，但對患者的生存率影響不大。

綜上所述，在喉癌組織中SLC7A11高表達(dá)、Ki-67高表達(dá)，對喉癌術(shù)后復(fù)發(fā)有高危預(yù)警的作用。在喉癌組織中SLC7A11表達(dá)與Ki-67表達(dá)密切相關(guān),且SLC7A11陽性表達(dá)結(jié)合Ki-67陽性表達(dá)預(yù)示喉癌患者術(shù)后預(yù)后不良。二者表達(dá)變化與患者術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)，與術(shù)后生存時間關(guān)系不大，對評估患者預(yù)后有重要意義。