朱玉婷，陳同強(qiáng), 李 燦

(1.三二○一醫(yī)院藥學(xué)部，陜西 漢中 723000； 2.食品安全監(jiān)測(cè)與預(yù)警湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 長(zhǎng)沙 410111； 3.湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院, 湖南 長(zhǎng)沙 410000)

甜酒，也稱(chēng)醪糟，是一種以糯米為主要原料，經(jīng)酒曲發(fā)酵制得的傳統(tǒng)發(fā)酵食品[1]。據(jù)報(bào)道，甜酒中含有豐富的碳水化合物、氨基酸、維生素、有機(jī)酸和微量元素等人體不可缺少的營(yíng)養(yǎng)成分[2-3],其味甘性溫，入脾腎肺經(jīng)，具有溫胃健脾、益氣止瀉、生津止汗的作用[4],因此，深受大眾的喜愛(ài)。由于一般甜酒制作的工藝較為簡(jiǎn)單，許多甜酒愛(ài)好者更傾向于自釀甜酒。

氨基甲酸乙酯(EC)作為一種有機(jī)污染物，在食品發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生，因此這類(lèi)化合物在發(fā)酵食品和酒精飲料中廣泛存在。研究表明，EC是一種多位點(diǎn)致癌物，可導(dǎo)致肺癌、淋巴癌、肝癌和皮膚癌等疾病，并且乙醇對(duì)EC的致癌性有促進(jìn)作用[5-6]。

科學(xué)家們已經(jīng)深入探索了EC在釀造酒中的形成機(jī)制，確定了 EC 及其前體物質(zhì)的來(lái)源與轉(zhuǎn)化關(guān)系，為制定EC的控制措施奠定了理論基礎(chǔ)。目前，物理化學(xué)、酶學(xué)及代謝工程等手段已經(jīng)應(yīng)用于釀造酒生產(chǎn)的各個(gè)階段以控制EC 的含量，但家庭自釀甜酒設(shè)備工藝過(guò)程一般較為簡(jiǎn)單，很難做到像成熟生產(chǎn)企業(yè)一樣對(duì)其中污染物進(jìn)行必要的檢測(cè)與控制，因此，自釀甜酒中出現(xiàn)EC含量偏高較為常見(jiàn)，從而導(dǎo)致其危害人體健康的風(fēng)險(xiǎn)升高，而國(guó)內(nèi)外關(guān)于自釀甜酒中EC含量控制的報(bào)道鮮見(jiàn)。本研究圍繞料水比、酒曲量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間等因素來(lái)控制自釀甜酒中EC的產(chǎn)生，結(jié)合氣相-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)檢測(cè)，在保持甜酒口感品質(zhì)前提下,通過(guò)優(yōu)化工藝條件以達(dá)到降低EC含量的目的，為自釀族們提供科學(xué)合理的技術(shù)指導(dǎo)，為自釀甜酒質(zhì)量安全提供保障。

1. 材料和方法

1.1 材料

糯米(水分在15%以下,淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)在70%以上)；酒曲(釀酒酵母；米根霉)，湖南省永鑫酒曲有限公司；氨基甲酸乙酯( C3H7O2N,CAS號(hào):51-79-6)，純度≥99.0%；D5-氨基甲酸乙酯(C3H2D5NO2,CAS號(hào):73962-07-9)，純度≥98.0%。

1.2 儀器與設(shè)備

TRACE 1310 ISQ氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀，RTX-WAX毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。

1.3 方法

1.3.1釀制工藝[8-9]

將經(jīng)多次浸洗過(guò)的糯米蒸煮后，加入一定比例的酒曲，保溫發(fā)酵一段時(shí)間，冷卻，即可得成品甜酒釀。

1.3.2單因素試驗(yàn)

以氨基甲酸乙酯(EC)含量為指標(biāo)，分別考察料水比、酒曲量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間等因素對(duì)自釀甜酒中EC產(chǎn)生的影響。

1.3.3響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)所得結(jié)果，選擇酒曲量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間3個(gè)因素為考察因素，以氨基甲酸乙酯含量為響應(yīng)值，因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 自釀甜酒工藝響應(yīng)面因素和水平表

1.3.4氨基甲酸乙酯含量測(cè)定

參考標(biāo)準(zhǔn)方法GB 5009.223—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基甲酸乙酯的測(cè)定》[10]進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1料水比對(duì)氨基甲酸乙酯(EC)含量影響

由圖1可知，在相同的酒曲量(0.28%)，發(fā)酵溫度(37℃)，發(fā)酵時(shí)間(2.5 d)下，隨著加水量的增大，自釀甜酒產(chǎn)生的EC含量有所升高，但總體來(lái)說(shuō)變化不大。當(dāng)料液比達(dá)到1∶0.6時(shí)，酒精度為2.8%,口感較甜，爽口；之后隨著水量增加，甜酒的口感逐漸變差，開(kāi)始出現(xiàn)酸澀苦味道，其原因可能是隨著加水量增大，自釀甜酒中乙醇(料液比1∶0.8時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)為1.6%；料液比1∶1.0時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)為1.2%)、糖類(lèi)及香味物質(zhì)相對(duì)減少造成的。因此，綜合考慮，最佳料水比適合控制在1∶0.6左右。由于在整個(gè)工藝優(yōu)化過(guò)程中，料水比對(duì)自釀甜酒中EC含量的影響相比其他因素而言并不明顯，故料水比在響應(yīng)面試驗(yàn)中不作為考察對(duì)象。

圖1 不同料水比下EC含量比較

2.1.2酒曲量對(duì)氨基甲酸乙酯(EC)含量的影響

由圖2可知，在相同發(fā)酵溫度(37℃)、發(fā)酵時(shí)間(2.5 d)以及料水比(1∶0.6)下，隨著酒曲量的增加，自釀甜酒中EC含量逐漸有所增加。在酒曲量低于0.2%時(shí)，EC含量不高，但測(cè)得的酒精度(1.3%左右)較低以及口感也較差，其原因是因?yàn)樗泳魄赡懿蛔愣鴮?dǎo)致不能將糯米充分發(fā)酵，使得發(fā)酵所得乙醇、糖類(lèi)及香味物質(zhì)不足造成的。當(dāng)酒曲量為 0.3%～0.4%時(shí)，糯米甜酒的產(chǎn)酒量、口感、酒精度(酒曲量為 0.3%、0.4%分別為2.3%，3.1%)較好。但兩者相比，酒曲量為 0.3%時(shí)，EC含量要更低一些。而當(dāng)酒曲量超過(guò) 0.4% 時(shí)，不僅EC含量增加明顯，口感也明顯變差，開(kāi)始出現(xiàn)酸苦味并逐漸加重，可能是因?yàn)榫魄窟^(guò)高，雜菌含量過(guò)高從而使得甜酒中的酸含量有所增加，從而造成甜酒口感變得酸苦。

圖2 不同酒曲量下的EC含量

2.1.3發(fā)酵溫度對(duì)氨基甲酸乙酯(EC)含量影響

由圖3可知，在同一發(fā)酵時(shí)間(2.5 d)、酒曲量(0.28%)以及料水比(1∶0.6)條件下，EC含量隨著發(fā)酵溫度的上升，呈先下降后上升的趨勢(shì)，在發(fā)酵溫度為 40℃時(shí)，甜酒中EC含量不但最低，而且口感較好，酒精度(2.9%)較高，這可能是因?yàn)?40℃左右更有利于酵母的發(fā)酵，也有利于酒曲中其他霉菌的糖化和產(chǎn)香細(xì)菌的生長(zhǎng)。因此，發(fā)酵溫度選擇在40℃左右時(shí)較合適。

圖3 不同發(fā)酵溫度下的EC含量

2.1.4發(fā)酵時(shí)間對(duì)氨基甲酸乙酯(EC)含量影響

在同一發(fā)酵溫度(37℃)、酒曲量(0.28%)以及料水比(1∶0.6)條件下，不同發(fā)酵時(shí)間(1、2、3、4、5 d)對(duì)自釀甜酒中EC含量的影響見(jiàn)圖4。由圖4 可看出， 1～3 d時(shí)，隨著時(shí)間增加， EC含量逐漸降低，到第3 d達(dá)到最低，3 d 后EC含量上升明顯。

同時(shí)，發(fā)酵時(shí)間也會(huì)影響到甜酒的感官性狀，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，在各種微生物的作用下生成的醇類(lèi)、醛類(lèi)及芳香族化合物使得甜酒風(fēng)味獨(dú)特；但如果發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致酸敗，使得甜酒中出現(xiàn)酸、苦、澀等雜味而使釀造甜酒口感變差。因此，發(fā)酵時(shí)間選擇在 3 d 左右較適宜。

圖4 不同發(fā)酵時(shí)間下的EC含量

2.2 響應(yīng)曲面法優(yōu)化甜酒工藝參數(shù)試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.2.1數(shù)學(xué)模型的建立及分析

結(jié)合單因素的試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步優(yōu)化自釀甜酒工藝參數(shù)。選取酒曲量(A)，發(fā)酵溫度(B)，發(fā)酵時(shí)間(C)3個(gè)因素為影響因子，以甜酒中氨基甲酸乙酯(EC)含量(Y)作為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表2和表3。采用 Design Expert 8.0.6.1 軟件,對(duì)表2中的試驗(yàn)結(jié)果多元回歸擬合后，獲得各因素水平對(duì)自釀甜酒中EC含量(Y)影響的二次多項(xiàng)回歸模型為：

Y=0.80+0.39A-0.14B-0.12C+

0.24AB+0.14AC+0.088BC+

1.54A2+0.59B2+0.59C2

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 回歸模型方差分析結(jié)果

2.2.2影響因子間交互作用分析

通過(guò)應(yīng)用Design-Expert.V 8.0.6 軟件獲得自釀甜酒制作工藝參數(shù)的響應(yīng)面圖和等高線圖，能夠較直觀地反映出各因素及其相互作用對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，見(jiàn)圖6。響應(yīng)面圖的曲面程度越大，表明兩因素間的交互作用就越顯著。

圖6 酒曲量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間交互作用對(duì)EC含量影響的響應(yīng)面及等高線

由圖 6 可知，酒曲量與發(fā)酵溫度的交互作用對(duì)自釀甜酒中EC含量的影響極顯著(P<0.01)，其余因素間交互作用影響不顯著(P>0.05)，這與方差分析結(jié)果是一致的。

2.3 自釀甜酒制作工藝參數(shù)驗(yàn)證

通過(guò)軟件對(duì)所建立的發(fā)酵工藝模型進(jìn)行分析計(jì)算，獲得自釀甜酒最佳工藝參數(shù)為酒曲量0.31%，發(fā)酵溫度38.24℃，發(fā)酵時(shí)間2.91 d。考慮實(shí)際操作的可行性，將最佳工藝參數(shù)修正為酒曲量0.3%，發(fā)酵溫度38℃，發(fā)酵時(shí)間為3 d。在此工藝條件下進(jìn)行3 組平行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖7、圖8。綜合計(jì)算得到EC含量為0.7 μg/100 g，這與預(yù)測(cè)值0.8 μg/100 g相近，說(shuō)明本試驗(yàn)的回歸模型方程具有較強(qiáng)的實(shí)際指導(dǎo)意義。

1.D5-氨基甲酸乙酯；2.氨基甲酸乙酯

1.D5-氨基甲酸乙酯；2.氨基甲酸乙酯

2.4 產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)

應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化后的最佳工藝參數(shù)進(jìn)行甜酒釀造，對(duì)所得自釀甜酒進(jìn)行檢測(cè)，得到其各項(xiàng)指標(biāo)為：酒精度(溫度20℃時(shí))為 3.5%；總糖(以葡萄糖計(jì))為 22.7 g/100 g；總酸(以乳酸計(jì))為0.22 g/100 g；固形物為 61.9 g/100 g。

3 結(jié)論

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取對(duì)自釀甜酒中氨基甲酸乙酯(EC)含量影響較大的3個(gè)因素，采用響應(yīng)曲面法對(duì)釀造工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，最終確定自釀甜酒工藝的最優(yōu)參數(shù)為：料水比1∶0.6，酒曲添加量0.3%，發(fā)酵溫度38℃，發(fā)酵時(shí)間3 d。在此工藝條件下釀得的甜酒，酒米組織致密，酒釀充沛，無(wú)明顯懸浮物，具有甜酒固有的滋味與氣味，味濃甜，略帶酸味，爽口，酒香味較濃郁，無(wú)異味。因此，研究獲得的最優(yōu)控制氨基甲酸乙酯含量的甜酒釀造工藝參數(shù)在實(shí)際生活中具有較好的應(yīng)用價(jià)值與指導(dǎo)作用，對(duì)提高自釀甜酒質(zhì)量安全有重要的實(shí)際意義。