徐艷芳，張金文

1 多發(fā)性硬化簡(jiǎn)介

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種由 T細(xì)胞介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性疾病，主要累及脊髓和大腦白質(zhì)，伴有神經(jīng)脫髓鞘、軸突喪失并導(dǎo)致不可逆殘疾，以年輕群體多發(fā)。作為最為常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，MS是年輕患者非創(chuàng)傷性神經(jīng)性殘疾的首要病因。

1.1 MS發(fā)病機(jī)制 MS涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的慢性炎癥性脫髓鞘、少突膠質(zhì)細(xì)胞的喪失、髓鞘再生。MS的主要病理過(guò)程包括炎癥階段和退行性病變階段。

神經(jīng)病理學(xué)證據(jù)表明，MS病變中最早的病理變化是在沒(méi)有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況下的少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡和小膠質(zhì)細(xì)胞激活，伴有繼發(fā)性脫髓鞘［1］。MS患者的殘疾是由抗原特異性免疫應(yīng)答介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)引起的。而脫髓鞘病變中存在炎癥細(xì)胞及其分泌的分子，髓鞘抗原反應(yīng)的致病性T細(xì)胞在MS中起關(guān)鍵作用，導(dǎo)致神經(jīng)元退化?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）［2］介導(dǎo)自身反應(yīng)性T細(xì)胞向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的遷移導(dǎo)致中樞神經(jīng)元及其髓鞘的破壞。氧化應(yīng)激、缺氧和腦的低灌注可導(dǎo)致MS中脫髓鞘病變?cè)黾樱?，4］。 MS 具有遺傳易感性。 遺傳學(xué)研究證實(shí)，MHC classⅡHLA-DRB1基因 HLA-DRB1＊15：01是MS發(fā)展的最重要危險(xiǎn)因素，使疾病風(fēng)險(xiǎn)增加3 倍［5］。

1.2 MS動(dòng)物模型 MS動(dòng)物模型包括實(shí)驗(yàn)性自身免疫/過(guò)敏性腦脊髓炎（EAE）模型、病毒誘導(dǎo)的慢性脫髓鞘疾病模型［主要為T(mén)heiler小鼠腦脊髓炎病毒（TMEV）感染模型］、毒素誘導(dǎo)脫髓鞘模型三種。單一的動(dòng)物模型不能完全復(fù)制人類MS的整個(gè)異質(zhì)性及其在臨床和放射學(xué)表現(xiàn)中的多樣性，也不可能充分表現(xiàn)MS的所有臨床、放射學(xué)、病理學(xué)和遺傳學(xué)特征。目前開(kāi)發(fā)出的MS動(dòng)物模型僅代表MS的某個(gè)或某些方面，需要根據(jù)具體的研究問(wèn)題，合理選擇動(dòng)物模型。

2 MS與自體造血干細(xì)胞（I/AHSCT）

I/AHSCT治療MS是利用免疫清除劑 （預(yù)處理方案）耗盡自身反應(yīng)性效應(yīng)細(xì)胞，然后輸注自體造血干細(xì)胞重建正常免疫功能系統(tǒng)。I/AHSCT治療后，循環(huán)自身反應(yīng)性效應(yīng)T細(xì)胞Th17減少，新的胸腺T細(xì)胞出現(xiàn)，調(diào)節(jié)環(huán)境恢復(fù)［6］。重建的T細(xì)胞譜系變異程度與預(yù)處理方案的強(qiáng)度有關(guān)。

2.1 患者選擇 I/AHSCT治療受益對(duì)象，早期認(rèn)為是患有長(zhǎng)期嚴(yán)重進(jìn)行性MS的患者，其炎癥特征不突出且神經(jīng)退行性變是主要的潛在機(jī)制。這類患者一般是受益的，但很少見(jiàn)到神經(jīng)功能改善［7，8］。此外，神經(jīng)功能障礙嚴(yán)重的患者發(fā)生不良事件的風(fēng)險(xiǎn)增加［9］。最近研究則側(cè)重于復(fù)發(fā)緩解型MS患者，其中具有活性炎癥特征的患者受益最大［9］。因此，目前認(rèn)為I/AHSCT治療對(duì)象是復(fù)發(fā)緩解型MS患者。

2.2 移植流程 I/AHSCT治療步驟包括外周血造血干細(xì)胞的動(dòng)員，通過(guò)施用預(yù)處理方案免疫消融，然后輸注造血干細(xì)胞以促進(jìn)血液重建。在MS治療中，最常用的方法是環(huán)磷酰胺（Cy）+G-CSF作為動(dòng)員劑，這有助于消耗淋巴細(xì)胞并減少自體反應(yīng)性T細(xì)胞再輸注的概率。

目前預(yù)處理方案的最佳強(qiáng)度仍未確定。最常用的預(yù)處理方案是BEAM與抗胸腺細(xì)胞球蛋白（ATG）相結(jié)合［8，13，14］的中等強(qiáng)度方案，高強(qiáng)度方案因?yàn)槎拘蕴珡?qiáng)而被詬病。Atkins等［15］使用了高強(qiáng)度方案——高劑量白消安和Cy（Bu/Cy）輸注方案［15］并對(duì)白消安方案進(jìn)行了幾項(xiàng)修改以提高耐受性。相反，Burt及其同事［7］提倡抗胸腺細(xì)胞球蛋白治療后給予Cy的低強(qiáng)度方案，效果良好、毒性降低且無(wú)病死率。

2.3 結(jié)果量化 MS臨床試驗(yàn)中最常發(fā)生的不良結(jié)果是復(fù)發(fā)、殘疾加重，量化工具包括擴(kuò)展殘疾狀態(tài)量表（EDSS）、多發(fā)性硬化功能組合、MRI病變活動(dòng)性、標(biāo)準(zhǔn)化的全腦容量［7，8，13-15］以及殘疾的改善［16］。

2.4 臨床試驗(yàn) I/AHSCT是MS中研究最多的干細(xì)胞治療策略。最近一項(xiàng)回顧性分析表明，I/AHSCT治療達(dá)到“沒(méi)有臨床癥狀”的多發(fā)性硬化患者比例（2 年時(shí)為 78%～83%）高于現(xiàn)有試驗(yàn)（13%～46%）［12］。I/AHSCT治療后2年，腦容量損失顯著減慢達(dá)到接近正常老化的水平［17］。與I/AHSCT相關(guān)的死亡率在過(guò)去二十年中有所下降［18］。最近研究顯示死亡率＜5%［9］，一些試驗(yàn)報(bào)告死亡率為零［7］。選擇合適的調(diào)節(jié)強(qiáng)度、患者人群、移植手術(shù)、移植時(shí)間和移植后護(hù)理有助于最大限度地降低移植相關(guān)死亡率的風(fēng)險(xiǎn)。

3 MS與間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）

MSC存在于大多數(shù)組織中，其旁分泌功能在一些疾病中比傳統(tǒng)細(xì)胞替代更有治療作用，在許多組織修復(fù)中發(fā)揮重要作用。MSC移植的潛在治療益處具有自限性，需要重復(fù)給藥。

不同來(lái)源的MSC之間可能存在重要差異，這些差異影響組織來(lái)源選擇。多發(fā)性硬化的潛在生物學(xué)特點(diǎn)可能影響MSC功能。一些研究發(fā)現(xiàn)，從MS患者和非MS患者中分離MSC的培養(yǎng)、分化潛能、表面抗原表達(dá)和免疫調(diào)節(jié)性能差異較大［19-22］，表明自體細(xì)胞移植可能不合適。

MSC治療的最佳劑量仍然是未知的，但目前認(rèn)可的劑量是每千克體重（1～2）×106個(gè)細(xì)胞，因此初級(jí)MSC不可用于臨床，需要廣泛使用擴(kuò)增細(xì)胞方案。但是，擴(kuò)增循環(huán)顯著減弱了修復(fù)和神經(jīng)保護(hù)特性。此外，產(chǎn)量低限制了重復(fù)給藥。因此，需要探索新的擴(kuò)增方法。

細(xì)胞制劑的類型包括混合單核細(xì)胞制劑、純化的培養(yǎng)擴(kuò)增MSC、MSC衍生的神經(jīng)祖細(xì)胞。骨髓單核制劑包括許多細(xì)胞類型，這種混合制劑在修復(fù)脫髓鞘和抑制炎癥以及對(duì)中風(fēng)和其他疾病患者有益。一些研究使用混合/非分離細(xì)胞；也有使用純化和培養(yǎng)擴(kuò)增的MSC［28］。細(xì)胞生產(chǎn)中需要保證嚴(yán)格的質(zhì)量和安全控制，并進(jìn)行表型和核型的評(píng)估、誘變測(cè)試和微生物分析。

3.1 輸注途徑 最佳的輸注途徑仍然不確定。將細(xì)胞直接注射到特定病變中對(duì)彌漫性灰質(zhì)和白質(zhì)受累益處不大，這是多發(fā)性硬化癥的特征。靜脈輸注更安全，大多數(shù)MSCs研究采用靜脈注射［23］。靜脈注射后，許多細(xì)胞被困在肺部，但是仍有顯著數(shù)量進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，分布廣泛，并且可以保持?jǐn)?shù)十年。

3.2 臨床試驗(yàn) 目前研究認(rèn)可MSC治療MS的可行性和安全性，并且沒(méi)有異位組織形成。不良反應(yīng)有：短暫的無(wú)菌性腦膜炎常見(jiàn)于鞘內(nèi)輸注；有鞘內(nèi)注射MSC后急性播散性腦脊髓炎的病例報(bào)告；鞘內(nèi)注射間充質(zhì)、胚胎和胎兒神經(jīng)干細(xì)胞組合后的膠質(zhì)增生性脊髓腫瘤；3例年齡相關(guān)性黃斑變性患者的玻璃體內(nèi)注射脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞后嚴(yán)重視力喪失［27］。

MSC治療最終可能會(huì)讓位于分子治療。如果MSC治療的主要有益效果是旁分泌，那么直接使用沖擊細(xì)胞中的主要效應(yīng)物可以達(dá)到治療效果。MSC治療可降低促炎細(xì)胞因子如 IFN-γ［26，31］，TNF-α［30］，IL-1［31］，IL-2［32］，IL-12［33］和 IL-17［26，35，36］的 水平 ，增加抗炎因子 IL-4［28，35］，IL-5［33］和 IL-10［31］的水平。 在一些研究中發(fā)現(xiàn)促炎和抗炎細(xì)胞因子IL-6的水平增加［27，32］，而一些研究中該細(xì)胞因子水平降低［36］。 此外，一些研究表明，MSC的免疫調(diào)節(jié)特性可部分歸因于具有免疫調(diào)節(jié)功能的分子的表達(dá)，如LIF［27］，PDL-1［34］，COX-2［34］，TGF-β1［34］，TSG-6［34］，CD200［34］，HGF［34，35］，IDO-1［29，34］，VEGF［35］，HLA-G［34］，HLA-E［34］和 HO-1［34］。 另一項(xiàng)研究［34］報(bào)道神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子如BDNF，CNTF，GDNF，NGF 和 NTF3也由 MSC 表達(dá)，證明了這種干細(xì)胞在神經(jīng)退行性疾病中支持旁分泌的潛力。另一項(xiàng)研究［35］證明了MSC通過(guò)抑制實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠脊髓中的MMP-2和MMP-9活性而起作用。

免疫細(xì)胞的增殖和分化顯著受到MSC給藥的影響。用MSC治療MS導(dǎo)致B細(xì)胞和T細(xì)胞［34］的增殖受到抑制，并減少炎癥細(xì)胞進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)和脊髓［35］。 具體而言，MSC 治療會(huì)抑制 CD4+IFN-γ+Th1［33］和 CD4+IL-17+Th17［31］細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的克隆擴(kuò)增和侵入。此外，一些研究報(bào)道，MSC治療導(dǎo)致 CD4+IL-4+Th2［33］和 CD4+CD25+FOXP3+Treg［31］細(xì)胞克隆擴(kuò)增的刺激。部分研究發(fā)現(xiàn)［27］，給予MSC后，CD44+和CD45RO+記憶T-淋巴細(xì)胞的增殖減少，先天免疫系統(tǒng)的細(xì)胞也受到MSC治療影響。MSC處理的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠的細(xì)胞中，CD11b+Ly6G+中性粒細(xì)胞和CD11b+Ly6C+炎癥單核細(xì)胞的百分比均降低。用MSC處理的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠中也檢測(cè)到CD4+細(xì)胞中較低的RORγT和較高的GATA-3轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平，這表明MSC處理后，Th17表型受到抑制而Th2亞群受益。Donders等［30］發(fā)現(xiàn)用MSC處理的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎大鼠，其樹(shù)突細(xì)胞的分化和成熟，抑制了抗原呈遞，并因此啟動(dòng)T細(xì)胞免疫。Tafreshi等［34］發(fā)現(xiàn)磷酸化 GSK3β的損失可以在用MSC處理的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠的神經(jīng)元中恢復(fù)。

MSC治療后臨床條件改善，原因在于干細(xì)胞抑制了B細(xì)胞、Th1和Th17淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的增殖和侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)和脊髓。促炎細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子IFNγ，IL-2和TGF-β分泌的減少，以及MSC分泌的抗炎因子如GM-CSF，PGE2和IL-6，也可以抑制促炎細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞的聚集及其向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的侵入。MSC中促炎性細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子水平的降低以及抗炎因子的分泌也可抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)中星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，并刺激促炎細(xì)胞分化成M2巨噬細(xì)胞和具有免疫調(diào)節(jié)作用的Breg細(xì)胞。位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的促炎細(xì)胞分泌TNF-α，蛋白酶，一氧化氮和髓鞘特異性抗體也受到抑制，減少了少突膠質(zhì)細(xì)胞的死亡和軸突中髓鞘的破壞。最后，通過(guò)MSC分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子如 BDNF、CNTF、GDNF、NGF 和 NTF3 也可作用于少突膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元，進(jìn)一步抑制疾病的進(jìn)展。

4 MS與少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞、多能干細(xì)胞（OPC）

少突膠質(zhì)細(xì)胞的主要功能是包繞軸突、形成絕緣的髓鞘結(jié)構(gòu)、協(xié)助生物電信號(hào)的跳躍式高效傳遞并維持和保護(hù)神經(jīng)元的正常功能。其異常會(huì)導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘病變和神經(jīng)元損傷?；谀z質(zhì)細(xì)胞的髓鞘再生策略一直被認(rèn)為是進(jìn)行性MS的潛在治療方法。給髓鞘發(fā)育不良的顫抖小鼠腦內(nèi)注射表達(dá)A2B5的膠質(zhì)祖細(xì)胞后，導(dǎo)致髓鞘的廣泛形成和臨床表型逆轉(zhuǎn)。

4.1 細(xì)胞來(lái)源、移植處理 OPC主要來(lái)源于胎兒組織，由于增殖能力有限，所以能提供細(xì)胞的數(shù)量有限。誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞（iPSC）可以作為少突膠質(zhì)細(xì)胞的來(lái)源，因此少突膠質(zhì)細(xì)胞具有使用自體細(xì)胞的可能［37］。通過(guò)CD140a和血小板衍生的生長(zhǎng)因子α受體表型選擇，可以進(jìn)一步純化這些細(xì)胞，從而產(chǎn)生更有效的髓鞘碎片。因?yàn)槭峭N異體輸注，所以需要對(duì)受體進(jìn)行免疫抑制。免疫抑制劑皮質(zhì)類固醇、干擾素-β和硫唑嘌呤不會(huì)影響OPC的增殖、存活或遷移能力。

4.2 臨床試驗(yàn) OPC不能從血液或腦脊液進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)實(shí)質(zhì)，需要直接注射到中樞神經(jīng)系統(tǒng)特定位置，其中一些細(xì)胞能夠在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)遷移相當(dāng)長(zhǎng)距離，因此雖然將細(xì)胞注射到限定位置，但仍然能夠獲得廣泛的髓鞘修復(fù)。Thiruvalluvan等［37］在動(dòng)物模型中進(jìn)行的研究表明，人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSC）衍生的OPC向胼胝體中的MS樣病變遷移，并使裸露的軸突髓鞘化；這種新方法表明hiPSC衍生的OPC可用于進(jìn)展期的MS［37］。通過(guò)將iPSC衍生的特異性細(xì)胞移植到不同的動(dòng)物疾病模型中，已經(jīng)廣泛證明了iPSC的治療潛力。iPSC臨床研究需要關(guān)注的是安全性和有效性，因?yàn)槟承﹣?lái)源于iPSC的細(xì)胞自體移植后具有引發(fā)抗原特異性免疫排斥反應(yīng)的傾向。目前正在進(jìn)行一期臨床試驗(yàn)，以評(píng)估在繼發(fā)進(jìn)展型MS患者單一時(shí)間點(diǎn)內(nèi)注射逐步增加劑量的OPC到多個(gè)腦內(nèi)位置的可行性和安全性［38］。

5 展望

現(xiàn)有證據(jù)表明I/AHSCT在抑制MS的炎癥性疾病活動(dòng)方面具有實(shí)質(zhì)性和持續(xù)的效果。但仍然不確定I/AHSCT治療復(fù)發(fā)緩解型MS的確切機(jī)制。受益患者應(yīng)該是相對(duì)年輕的，疾病持續(xù)時(shí)間相對(duì)較短的，或者有活躍的復(fù)發(fā)緩解型MS和累積殘疾，但仍然能夠活動(dòng)者。因此病例選擇也很重要。

不同組織來(lái)源的MSC特性是否相同決定了MSC的選擇。需要尋求足夠證據(jù)證明MSC不會(huì)在組織中持續(xù)存在以確定MSC移植的治療益處是自限性的，為重復(fù)給藥確立依據(jù)。如果MSC治療的主要有益效果是旁分泌，那么MSC治療最終可能會(huì)讓位于分子治療。

缺乏OPC很可能不是MS中髓鞘再造不足的原因，支持和維持髓鞘再生所必需的因子缺乏或者M(jìn)S病變環(huán)境中存在抑制因子，以及退化軸突不能支持髓鞘再生可能是主要障礙。因此，外源性O(shè)PC的應(yīng)用可能無(wú)法滿足需要，這是未來(lái)需要解決的問(wèn)題。