陳燕，楊軼軒

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院感染科，重慶）

0 引言

膿毒癥是機(jī)體對感染的反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致危及生命的器官功能障礙[1]。其病理生理機(jī)制包括宿主反應(yīng)、先天免疫、凝血異常、炎癥反應(yīng)、凝血與炎癥網(wǎng)絡(luò)、免疫抑制、器官功能障礙、基因多態(tài)性等。其發(fā)病率高、病情危重、死亡率高，韓國的一項(xiàng)基于醫(yī)療保險報銷數(shù)據(jù)庫的全國性回顧性觀察性研究表明，在韓國膿毒癥發(fā)病率從2007年的173.8/10萬增加到2016年的233.6/10萬，與膿毒癥相關(guān)的總住院死亡率高達(dá)29.0%[2]。一項(xiàng)新的系統(tǒng)綜述研究表明，膿毒癥識別后1h內(nèi)上抗菌藥物對于死亡率的改善是最佳的[3]。膿毒癥的早期臨床癥狀特異性不高，近1/3的嚴(yán)重膿毒癥患者在入院時沒有表現(xiàn)出組織器官功能障礙的征象，隨后卻在最初的急診科評估后24小時內(nèi)進(jìn)展為嚴(yán)重膿毒癥[4]，所以預(yù)測或是早期診斷膿毒癥就顯得尤為重要。膿毒癥早期診斷和療效評估的生物標(biāo)志物大約有兩百多種[5]，臨床上至今仍缺乏特異性的診斷膿毒癥或是療效監(jiān)測的生物標(biāo)志物。1985年如Wasson等[6]人所述，一個有用的膿毒癥診斷生物標(biāo)記物需要滿足四個標(biāo)準(zhǔn)：（1）生物相關(guān)性基礎(chǔ)；（2）高靈敏度、高特異性和陽性及陰性預(yù)測值高；（3）機(jī)構(gòu)之外的重復(fù)性好；（4）其他獨(dú)立患者人群的有效性。其它所有提出的診斷生物標(biāo)記物都不滿足所有這些標(biāo)準(zhǔn)。HBP符合這一標(biāo)準(zhǔn)。

1 HBP結(jié)構(gòu)

HBP是Shafer等[7]首次從人中性粒細(xì)胞顆粒中分離純化，因其帶正電荷、有抗菌活性、相對分子量為3700，故稱為陽離子抗菌蛋白（CAP37）和天青殺素。成熟（活性）CAP37為單鏈多肽，由221或222個氨基酸殘基組成，相對分子質(zhì)量為24000。Pohl等[8]測定了CAP37的氨基酸序列，CAP37是胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶家族中的一員，具有多種配體的結(jié)合位點(diǎn)（肝素、脂質(zhì)A、脂多糖等），絲氨酸蛋白酶在炎癥的各個方面都很重要[9]，其與人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的同源性最高（45%），與蛋白酶3、組織蛋白酶G的序列同源性分別為為42%、32%；CAP37有3個糖基化位點(diǎn)，分別位于第100、114和145號殘基上；有與彈性蛋白酶、補(bǔ)體因子D和糜蛋白酶結(jié)構(gòu)中相同的8個嚴(yán)格保守的半胱氨酸殘基[10]，另CAP37像彈性蛋白酶一樣具有類糜蛋白酶類型的二硫鍵配對，二硫鍵的存在對于抗菌作用是必要的；最關(guān)鍵的序列差異涉及催化殘基，因其催化三聯(lián)體中的兩個氨基酸殘基被替換，使其無酶活性；但其仍能與胰蛋白酶抑制劑（BPTI）結(jié)合，使得BPTI（牛胰蛋白酶抑制劑）親和色譜法可以提純出HBP，證實(shí)HBP與BPTI結(jié)合是作用于活化中心三聯(lián)體上的。蛋白質(zhì)的一側(cè)存在一個由兩簇堿性氨基酸殘基參與組成的一個高度陽離子的結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域結(jié)合肝素和發(fā)揮抗菌活性，堿性氨基酸殘基還可能與帶負(fù)電荷的內(nèi)皮細(xì)胞膜蛋白多糖分子結(jié)合[11]，從而誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的構(gòu)象變化。成熟CAP37蛋白是一種具有交替的疏水和親水結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，疏水結(jié)構(gòu)域的存在使其能更好地進(jìn)入脂質(zhì)雙層，增強(qiáng)了它們對細(xì)胞膜和隨后的趨化結(jié)合的親和力。

2 HBP定位

嗜天青顆粒存在于原始粒細(xì)胞及早幼粒細(xì)胞中，而分泌型小泡在中性粒細(xì)胞成熟的末期才出現(xiàn)。HBP在中性粒細(xì)胞成熟過程中被合成，在嗜天青顆粒、分泌小泡、質(zhì)膜上儲存量分別約為74%、18%、8%。由于它儲存在中性粒細(xì)胞的嗜天青顆粒和靠近細(xì)胞膜附近的分泌小泡中，故其易于活化，中性粒細(xì)胞受刺激后所分泌的HBP是向細(xì)胞外釋放的，所以我們可以通過檢測技術(shù)了解血漿中的HBP水平。其雙重定位表明該蛋白在中性粒細(xì)胞中具有多種功能。從分泌小泡釋放容易調(diào)動的HBP，在炎癥早期可能具有重要作用；另一方面，嗜天青顆粒釋放率低，只有當(dāng)中性粒細(xì)胞浸潤組織時才釋放，此時中性粒細(xì)胞源性HBP與吞噬體融合后，可能與內(nèi)部細(xì)菌發(fā)生密切接觸，產(chǎn)生重要的抗菌作用[12]。

3 HBP的分泌及功能

中性粒細(xì)胞活化及釋放HBP是對感染作出的反應(yīng)。趨化因子從感染部位釋放，以響應(yīng)入侵病原體的組分與模式識別受體的結(jié)合[13]。這些趨化因子如IL-8激活中性粒細(xì)胞并導(dǎo)致HBP釋放[14]。細(xì)菌蛋白也可以直接激活中性粒細(xì)胞并釋放HBP[15-18]，包括來自化膿性鏈球菌的M1蛋白[15]，來自豬鏈球菌的溶血素[16]，來自銅綠假單胞菌分泌物[18]和來自金黃色葡萄球菌的酚溶性調(diào)節(jié)素α4[17]。內(nèi)皮細(xì)胞是中性粒細(xì)胞分泌小泡釋放的HBP的第一個靶點(diǎn)，當(dāng)其與內(nèi)皮細(xì)胞表面的細(xì)胞粘附分子接觸時，中性粒細(xì)胞也被激活[19]，隨后的HBP釋放導(dǎo)致內(nèi)皮通透性增加，促進(jìn)中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞向感染部位外滲[20]。儲存在嗜天青顆粒中的HBP，只有在中性粒細(xì)胞滲入組織后才釋放[12,21]。因此，HBP既在血液中釋放，也在組織中釋放，在那里它對幾種細(xì)胞類型產(chǎn)生影響。

HBP是一種具有抗菌、趨化多種白細(xì)胞、增加血管內(nèi)皮通透性等多種功能的炎性蛋白。它能夠殺死革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌和白色念珠菌[7,22]，通過作為調(diào)理素增強(qiáng)對病原體的吞噬作用[23]；其抗菌活性主要是針對革蘭氏陰性細(xì)菌，可能是通過與脂多糖（LPS）類脂A結(jié)合而啟動的，HBP可能在感染過程中發(fā)揮中和LPS的作用[24]。除了與病原體的相互作用外，HBP還影響宿主中幾種不同類型的白細(xì)胞以增強(qiáng)免疫反應(yīng)。例如作為單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的趨化劑[14,25]，從而增強(qiáng)白細(xì)胞募集和細(xì)胞因子釋放。穿過內(nèi)皮屏障，循環(huán)中的白細(xì)胞才能外滲至感染部位[26]；內(nèi)皮屏障功能的喪失是膿毒癥發(fā)生的一個重要因素[27]；HBP影響內(nèi)皮細(xì)胞，首先通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)ICAM1，PECAM-1和整合素a3和b1，這有助于中性粒細(xì)胞粘附到內(nèi)皮表面[28]；HBP然后誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞骨架的重排[20]、細(xì)胞收縮和細(xì)胞之間的間隙形成[29]，導(dǎo)致內(nèi)皮通透性增加。HBP也針對內(nèi)皮細(xì)胞中的線粒體，引起形態(tài)學(xué)變化，降低細(xì)胞色素c氧化酶亞基II的表達(dá)，降低線粒體膜電位[30]，對線粒體起到抗凋亡的保護(hù)作用，有助于在體內(nèi)中性粒細(xì)胞激活的情況下將內(nèi)皮細(xì)胞的損傷降至最低。

4 HBP在膿毒癥中的應(yīng)用

HBP是中性粒細(xì)胞中唯一從分泌囊泡分泌到環(huán)境中的顆粒蛋白[24]，因此強(qiáng)調(diào)了其在炎癥反應(yīng)中具有重要作用。有研究表明，銅綠假單胞菌彈性蛋白酶是一種有效的金屬蛋白酶，可以降解像LL-37這樣的抗菌肽，卻不能降解HBP，表明HBP在高度蛋白水解的環(huán)境中是穩(wěn)定的[18]。這些都使得HBP能在血液循環(huán)中被檢測到。

從生物學(xué)上看，HBP是一種早期和預(yù)測性的生物標(biāo)志物，因?yàn)樗穷A(yù)先合成的，并通過遷移中性粒細(xì)胞對細(xì)菌感染的反應(yīng)迅速動員起來。HBP儲存在中性粒細(xì)胞的分泌小泡和嗜天青顆粒中[12]，中性粒細(xì)胞中的分泌小泡在其激活時會出現(xiàn)快速的胞吐，僅在吞噬細(xì)菌30分鐘后就有89%的HBP胞吐，這比其他中性粒細(xì)胞顆粒蛋白的比例要大得多[24]。HBP導(dǎo)致血管滲漏和水腫形成，并對各種白細(xì)胞和上皮細(xì)胞具有促炎作用。血管屏障功能破壞和細(xì)胞炎癥反應(yīng)的失調(diào)可導(dǎo)致器官功能衰竭。HBP在嚴(yán)重細(xì)菌感染的病理生理學(xué)中起主要作用，因此是一種潛在的診斷標(biāo)記物和膿毒癥治療的靶點(diǎn)。

HBP能診斷膿毒癥、預(yù)測膿毒性休克的發(fā)生及判斷預(yù)后。健康人血漿HBP濃度很低，一般不超過10ng/mL。2009年Linder等[31]認(rèn)為血漿HBP水平大于15ng/mL是嚴(yán)重膿毒癥診斷的最佳實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值均高，分別達(dá)87.1%、95.1%、88.4%、94.5%。在26例感染性休克患者中，24例（92.3%）在入選時血漿HBP水平就已升高；在其余44例嚴(yán)重膿毒癥患者中，37例（84.1%）血清水平升高；在100名非嚴(yán)重膿毒癥患者中，只有7名患者的HBP水平升高。表明HBP血漿水平升高與低血壓、器官功能衰竭的發(fā)生密切相關(guān)。研究中的一些登記患者后來被診斷為非傳染性疾病，在這20名患者中，有11名因各種非感染性臨床條件導(dǎo)致循環(huán)衰竭；與嚴(yán)重感染的患者相比，除1例非感染性低血壓患者外，其余患者的HBP水平均較低；這些數(shù)據(jù)支持HBP在嚴(yán)重膿毒癥患者觀察到的循環(huán)衰竭中具有特定的致病作用這一假設(shè)。在所研究的70名有嚴(yán)重膿毒癥和感染性休克的患者中，由多種細(xì)菌引起的嚴(yán)重感染會導(dǎo)致血漿HBP水平升高，當(dāng)比較感染了革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細(xì)菌的患者的HBP水平時，檢測到?jīng)]有顯著差異（未發(fā)表的數(shù)據(jù)）。此外，患者人群中的HBP水平與WBC之間沒有相關(guān)性，這表明如果HBP要釋放到循環(huán)中，就需要特定的中性粒細(xì)胞激活。在本研究中，在發(fā)展為膿毒癥的患者中，有80%在滿足重度膿毒癥標(biāo)準(zhǔn)之前，其HBP水平就升高了（＞30ng/mL），表明HBP可預(yù)測膿毒癥及器官功能障礙的發(fā)生；提示在發(fā)燒患者中檢測到血漿HBP水平升高應(yīng)立即提醒臨床醫(yī)生加強(qiáng)液體復(fù)蘇并開始適當(dāng)?shù)目股刂委?，以降低重癥膿毒癥或感染性休克患者的死亡率[3]。

2012年Linder等[32]研究了ICU中嚴(yán)重膿毒癥和感染性休克患者血漿中HBP水平?？偣舶?79名患者，其中151名有膿毒癥（126名有感染性休克，25名有嚴(yán)重膿毒癥）和28名非膿毒癥危重患者。使用15 ng/mL的截斷值和/或HBP/WBC＞2，發(fā)現(xiàn)87%的膿毒癥患者在研究登記時HBP水平升高。在17.6%的患者中發(fā)現(xiàn)一過性白細(xì)胞減少癥，這是膿毒癥相對常見的特征；膿毒癥患者出現(xiàn)白細(xì)胞減少的可能原因是：膿毒癥發(fā)作時胞吐增強(qiáng)、骨髓細(xì)胞成熟耗竭或停止、中性粒細(xì)胞組織分泌等，所以使用HBP/WBC比值可提高診斷一過性白細(xì)胞減少癥患者是否為膿毒癥的敏感性。這項(xiàng)研究表明：與ICU中的非感染性疾病患者相比，嚴(yán)重膿毒癥或感染性休克患者的血漿HBP水平顯著升高；HBP水平與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)；入院時HBP升高與死亡風(fēng)險增加相關(guān)；隨著時間的推移升高的HBP可能識別出預(yù)后惡化的患者。先前關(guān)于HBP作為嚴(yán)重膿毒癥的敏感標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)在不同的環(huán)境中得到了證實(shí)，強(qiáng)調(diào)了它作為一種有價值的診斷工具的潛力。

2015年Linder等[33]做了一項(xiàng)前瞻性國際多中心隊(duì)列研究，地點(diǎn)為瑞典、加拿大和美國的七個不同的急診科。在674名被診斷為感染的患者中，487名在登記時沒有器官功能障礙。在這487名患者中，141名（29%）在72小時的研究期間內(nèi)出現(xiàn)了器官功能障礙；HBP閾值設(shè)定為30 ng/mL 時，141例患者中有110例（78.0%）在發(fā)生器官功能障礙前血漿HBP濃度超過閾值。HBP預(yù)測進(jìn)展為器官功能障礙的敏感度為78.0%，特異性為76.3%，與其他生物標(biāo)志物（PCT、WBC、CRP、乳酸）相比，肝素結(jié)合蛋白是進(jìn)展為器官功能障礙的最佳預(yù)測因子（受試者工作特征曲線下面積=0.80）。HBP比其他標(biāo)記物先升高，可以用其位于分泌顆粒內(nèi)的位置來解釋，分泌顆粒是中性粒細(xì)胞激活后最先被動員的。釋放后，HBP參與中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的內(nèi)皮通透性改變，導(dǎo)致血管滲漏。如果患者樣本獲取得更接近器官功能障礙的起始點(diǎn)，那么HBP升高的可能性可能會增加。本次研究提出的HBP作為膿毒癥標(biāo)志物的截斷值高于以前的研究。

2019年，一項(xiàng)中國的前瞻性隊(duì)列研究[34]，探討膿毒癥和膿毒性休克國際共識定義（Sepsis-3）中肝素結(jié)合蛋白（HBP）在膿毒癥和膿毒性休克中的釋放水平；膿毒癥組56例和膿毒性休克組37例，在125名感染患者中，以HBP28.1ng/mL作為診斷膿毒癥的臨界值，診斷膿毒癥的敏感性為84.9%，特異性為78.3%。陽性預(yù)測值為94.0%，陰性預(yù)測值為65.9%,這一數(shù)值與該研究結(jié)果（最佳截斷值分別為HBP≥15ng/mL和≥30ng/mL）接近。以≥103.5 ng/mL作為診斷膿毒性休克的臨界值，敏感性為67.6%，特異性為82.1%，陽性預(yù)測值為71.4%，陰性預(yù)測值為79.3%；86人有明確的病原體證據(jù)，其中42人感染了革蘭氏陽性菌，31人感染了革蘭氏陰性菌，革蘭氏陽性細(xì)菌感染患者與革蘭氏陰性細(xì)菌感染患者之間的血漿HBP水平無顯著差異。

綜上所述，HBP是中性粒細(xì)胞合成并釋放的一種多功能炎性蛋白，它是預(yù)先合成的，菌體結(jié)構(gòu)可刺激其從分泌囊泡中快速釋放,它作為炎癥反應(yīng)的放大器，并導(dǎo)致毛細(xì)血管滲漏，這兩者在嚴(yán)重膿毒癥時都是高度失調(diào)的。因此，HBP在感染早期升高，用于預(yù)測器官衰竭及判斷預(yù)后，在生物學(xué)上是非常合理的，多個不同中心的大型臨床研究結(jié)果均提示其診斷、預(yù)測胡判斷預(yù)后的性能均優(yōu)于PCT、CRP等傳統(tǒng)炎性指標(biāo)；但其在臨床應(yīng)用中的截斷值還需要更多大型臨床研究來界定。近年來有研究發(fā)現(xiàn)HBP可作為膿毒癥的治療靶點(diǎn)，尚需深入研究。