高 蕾 曾俊濤 周真真 闞 娜 王小紅

(三亞中心醫(yī)院/海南省第三人民醫(yī)院消化內(nèi)科，三亞 572000)

結(jié)腸癌是常見的發(fā)生于直腸與乙狀結(jié)腸交界處的消化道惡性腫瘤，根據(jù)2017年全國腫瘤登記處資料顯示，我國結(jié)腸癌發(fā)病率居惡性腫瘤第3位，死亡率居惡性腫瘤第5位，且患者術(shù)后5 年生存率不足60%，急需新的治療手段提高患者生存率[1，2]。miR-125家族根據(jù)其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)不同可分為miR-125a、miR-125b-1和miR-125b-2，其中miR-125a與卵巢癌、口腔癌、胰腺癌和頭頸部鱗癌等發(fā)生發(fā)展相關(guān)[3-6]。研究表明，miR-125a-5p在結(jié)腸癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)miR-125a-5p可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡[7]。但miR-125a-5p對結(jié)腸癌的作用機(jī)制及其在體內(nèi)的影響尚未明確。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducers and activators of transcription 3，STAT3)是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。研究表明STAT3能夠促進(jìn)結(jié)腸癌、胃癌和卵巢癌等腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，并干擾腫瘤細(xì)胞凋亡及機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答[8]。本文主要研究過表達(dá)miR-125a-5p抑制結(jié)腸癌的作用機(jī)制及其對移植結(jié)腸癌裸鼠的影響及機(jī)制，為結(jié)腸癌的診斷和治療提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞購自上海通蔚生物科技有限公司；RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清和胰蛋白酶購自美國Hyclone公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京諾博萊德科技有限公司；Lipofectamine 2000 購自美國 Invitrogen 公司；單克隆抗體購自美國 Cell signal technology 公司；二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Transwell小室購自美國Corning公司；裸鼠購自四川大學(xué)華西醫(yī)院基因工程小鼠中心。

1.2方法

1.2.1靶基因預(yù)測 采用在線基因預(yù)測軟件miRanda、TarBase、TargetScan預(yù)測miR-125a-5p的靶基因。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證miR-125a-5p直接作用于STAT3。

1.2.2結(jié)腸癌SW480細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 結(jié)腸癌SW480細(xì)胞培養(yǎng)于含10% 胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素溶液的RMPI1640細(xì)胞培養(yǎng)體系中，5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)。利用Lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，miR-125a-5p mimic與pcDNA-STAT3單獨(dú)或聯(lián)合轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞。

1.2.3熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) miR-125a-5p mimic、STAT3 wt和STAT3 mut分別或同時(shí)對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以海腎熒光素酶的熒光值作為內(nèi)參，按照Dual Luciferase報(bào)告基因試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4RT-PCR TRIzol試劑盒提取細(xì)胞或組織總RNA，按試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-PCR檢測。反應(yīng)條件為： 98℃ 預(yù)變性30 s；98℃ 變性10 s，56℃ 退火30 s，72℃延伸 10 s，共 40 個(gè)循環(huán)；4℃ 保存。miR-125a-5p F：5′-ACTACATCCCTGAGAC-CCTTTAAC-3′，R：5′-TATGGTTGTTCTCCTCTCTGT-GTC-3′。GAPDH作為內(nèi)參，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)攝影，Quan tity One 軟件進(jìn)行掃描分析，計(jì)算采用2-ΔΔCt法。

1.2.5Western blot PBS洗滌沉淀細(xì)胞2次，加入RIPA裂解液，冰浴30 min后離心取上清至新的EP管。BCA試劑盒測定蛋白濃度。取蛋白樣品30 μg在濃縮膠60 V恒定電壓、分離膠100 V恒定電壓下進(jìn)行電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜。室溫下用含5% 脫脂奶粉的TBST搖床封閉30 min。將封閉好的 PVDF膜置于相應(yīng)的一抗溶液中，室溫孵育 2 h。加入 TBST 稀釋的二抗溶液，室溫孵育 1 h，ECL曝光。

1.2.6克隆形成實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期細(xì)胞，以200個(gè)/孔接種于完全培養(yǎng)基，5% CO2、37℃培養(yǎng)2周，Gimesa染色觀察。

1.2.7Transwell檢測 接種膠細(xì)胞懸液鋪于小室上室(100 μl/室)，細(xì)胞終濃度為8×104個(gè)/室，下室加入750 μl 含血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后取出，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照，收集試驗(yàn)數(shù)據(jù)并分析。

1.2.8體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 裸鼠右后肢腹側(cè)皮下注射0.2 ml 1×107個(gè)/ml的結(jié)腸癌SW480細(xì)胞懸液，依據(jù)注射細(xì)胞不同，分為Control組和miR-125a-5p mimic組，每組16只，雌雄各半。術(shù)后繼續(xù)在SPF條件下飼養(yǎng)，正常飲食，觀察裸鼠皮下成瘤情況，30 d 后頸椎脫位法處死裸鼠，完整取出皮下移植瘤，電子天平稱重。組織標(biāo)本于離體30 min內(nèi)保存，一半置于液氮中凍存，一半置于4%多聚甲醛溶液中固定，每組隨機(jī)選取3只進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.9免疫組化 經(jīng)常規(guī)10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，脫蠟水化。過氧化物酶阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，非免疫性動物血清阻斷非特異性反應(yīng)。分別加入鼠抗人Ki67和Vimentin單抗，4℃孵育過夜。滴加生物素標(biāo)記的二抗，DAB顯色，蒸餾水沖洗，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明。封片觀察統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1靶向關(guān)系預(yù)測 通過基因預(yù)測軟件TargetScan、miRanda和TarBase篩選出STAT3作為miR-125a-5p靶基因，miR-125a-5p與STAT3在3′UTR區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)(圖1A)。RT-PCR檢測miR-125a-5p的表達(dá)結(jié)果表明，與Control組相比，miR-125a-5p mimic-NC組miR-125a-5p表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，miR-125a-5p mimic組miR-125a-5p表達(dá)顯著升高(P<0.01,圖1B)。Western blot檢測STAT3表達(dá)結(jié)果表明，與Control組相比，miR-125a-5p mimic組miR-125a-5p表達(dá)顯著降低，說明過表達(dá)miR-125a-5p可抑制STAT3表達(dá)；STAT3組STAT3表達(dá)顯著升高，說明pcDNA-STAT3質(zhì)粒有效；STAT3+mimic組STAT3表達(dá)與Control組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，比miR-125a-5p mimic組顯著升高，比STAT3組顯著降低， 說明miR-125a-5p和 STAT3存在靶向關(guān)系，且miR-125a-5p可抑制STAT3表達(dá)(P<0.01,圖1C)。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明，miR-125a-5p對野生型STAT3表達(dá)有明顯下調(diào)作用，對突變型無明顯作用(P<0.01,圖1D)，提示miR-125a-5p直接靶向作用于STAT3。

圖1 miR-125a-5p直接靶向作用于STAT3Fig.1 miR-125a-5p directly targets STAT3Note:A.Target genes of miR-125a-5p screened by TargetScan,miRanda and TarBase;B.Expression of miR-125a-5p detected by RT-PCR;C.Expression of STAT3 detected by Western blot;D.Targeting relationship was detected by luciferase activity.Compared with control,**.P<0.01;compared with single transfection group,##.P<0.01;compared with PC-DNA,△△.P<0.01.

2.2miR-125a-5p過表達(dá)抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞生長 與Control組相比，miR-125a-5p mimic組克隆形成顯著減少，STAT3組克隆形成顯著增多，說明過表達(dá)miR-125a-5p 可降低SW480細(xì)胞克隆形成能力，STAT3可增強(qiáng)SW480細(xì)胞克隆形成能力；STAT3+mimic組克隆形成與Control組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，比miR-125a-5p mimic組顯著增多，比STAT3組顯著減少，說明過表達(dá)miR-125a-5p通過抑制STAT3進(jìn)而抑制SW480細(xì)胞克隆形成(P<0.01)。與Control組相比，miR-125a-5p mimic組Ki67表達(dá)顯著下調(diào)，caspase-3表達(dá)顯著上調(diào)，STAT3組Ki67表達(dá)顯著上調(diào)，caspase-3表達(dá)顯著下調(diào)，說明過表達(dá)miR-125a-5p可抑制SW480細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)SW480細(xì)胞凋亡，STAT3促進(jìn)SW480細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞SW480凋亡；STAT3+mimic組Ki67和caspase-3表達(dá)與Control組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，比miR-125a-5p mimic組Ki67表達(dá)顯著上調(diào)，caspase-3表達(dá)顯著下調(diào)，比STAT3組Ki67表達(dá)顯著下調(diào)，caspase-3表達(dá)顯著上調(diào)，說明過表達(dá)miR-125a-5p通過抑制STAT3抑制SW480細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)SW480細(xì)胞凋亡(P<0.01,圖2)。

圖2 過表達(dá)miR-125a-5p對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞生長的影響(×100)

2.3miR-125a-5p過表達(dá)抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞侵襲 與Control組相比，miR-125a-5p mimic組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少，STAT3組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增多，說明過表達(dá)miR-125a-5p 可降低SW480細(xì)胞侵襲能力，STAT3可增強(qiáng)SW480細(xì)胞侵襲能力；STAT3+mimic組侵襲細(xì)胞數(shù)與Control組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，比miR-125a-5p mimic組顯著增多，比STAT3組顯著降低，說明過表達(dá)miR-125a-5p通過抑制STAT3抑制SW480細(xì)胞侵襲(P<0.01,圖3)。

2.4miR-125a-5p過表達(dá)抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 與Control組相比，miR-125a-5p mimic組侵襲細(xì)胞排列緊密，STAT3組侵襲細(xì)胞排列疏松，說明過表達(dá)miR-125a-5p可抑制SW480細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，STAT3可促進(jìn)SW480細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；STAT3+mimic組與Control組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，比miR-125a-5p mimic組排列疏松，比STAT3組排列緊密，說明過表達(dá)miR-125a-5p通過抑制STAT3抑制SW480細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(P<0.01)。與Control組相比，miR-125a-5p mimic 組E-cadherin 表達(dá)顯著上調(diào)， Vimentin 和N-cadherin表達(dá)顯著下調(diào)，STAT3組E-cadherin表達(dá)顯著下調(diào)，Vimentin和N-cadherin表達(dá)顯著上調(diào)，說明過表達(dá)miR-125a-5p 可抑制SW480細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，STAT3促進(jìn)SW480細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；STAT3+mimic組Vimentin、N-cadherin和E-cadherin表達(dá)與Control組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，比miR-125a-5p mimic組E-cadherin表達(dá)顯著下調(diào)，Vimentin和N-cadherin表達(dá)顯著上調(diào)，比STAT3組E-cadherin表達(dá)顯著上調(diào)，Vimentin和N-cadherin表達(dá)顯著下調(diào)，說明過表達(dá)miR-125a-5p通過抑制STAT3抑制SW480細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(P<0.01，圖4)。

圖3 Transwell檢測細(xì)胞侵襲情況(×400)

圖4 miR-125a-5p過表達(dá)抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(×100)Fig.4 miR-125a-5p overexpression inhibits epithelial-mesenchymal transition in colon cancer SW480 cell(×100)Note:Compared with control， **.P<0.01;compared with single transfection group,##.P<0.01.

2.5Western blot檢測STAT3下游靶基因Bcl-2、c-Myc和cycD表達(dá) 與Control組相比，miR-125a-5p mimic組Bcl-2、c-Myc和 cycD表達(dá)顯著下調(diào)，STAT3組Bcl-2、c-Myc和 cycD表達(dá)顯著上調(diào)，說明過表達(dá)miR-125a-5p可抑制SW480細(xì)胞STAT3下游靶基因表達(dá)，STAT3促進(jìn)SW480細(xì)胞STAT3下游靶基因表達(dá)；STAT3+mimic組Bcl-2、c-Myc和 cycD表達(dá)與Control組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，比miR-125a-5p mimic組Bcl-2、c-Myc和cycD表達(dá)顯著上調(diào)，比STAT3組Bcl-2、c-Myc和cycD表達(dá)顯著下調(diào)，說明過表達(dá)miR-125a-5p通過抑制STAT3抑制SW480細(xì)胞STAT3下游靶基因表達(dá)(P<0.01,圖5)。

2.6裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 與Control組相比，miR-125a-5p mimic組腫瘤重量顯著減輕，說明miR-125a-5p過表達(dá)可抑制結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展(P<0.01，圖6A)，miR-125a-5p mimic組miR-125a-5p表達(dá)顯著下調(diào)，說明miR-125a-5p過表達(dá)可抑制miR-125a-5p表達(dá)(P<0.01，圖6B)。miR-125a-5p mimic組Bcl-2、c-Myc、 cycD和STAT3表達(dá)顯著下調(diào)，說明過表達(dá)miR-125a-5p 可抑制SW480細(xì)胞STAT3下游靶基因表達(dá)(P<0.01，圖6C)。miR-125a-5p mimic組Ki67和Vimentin陽性比率顯著降低， 說明過表達(dá)miR-125a-5p可抑制SW480細(xì)胞增殖和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(P<0.01，圖6D)。

圖5 Western blot檢測Bcl-2、c-Myc和cycD表達(dá)Fig.5 Bcl-2,c-Myc and cycD expressions by Western blotNote:Compared with control，**.P<0.01;compared with single transfection group,##.P<0.01.

圖6 裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

miR-125a-5p通過不同靶點(diǎn)對腫瘤細(xì)胞發(fā)揮作用。Waresijiang等[9]發(fā)現(xiàn)miR-125a-5p通過靶向MMP-11抑制骨肉瘤細(xì)胞遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；Hsieh等[10]研究發(fā)現(xiàn)miR-125a-5p靶向HDAC4抑制乳腺癌發(fā)生；Zheng等[11]發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-125a-5p以NEDD9為靶點(diǎn)可抑制肺腺癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中，miR-125a-5p直接靶向作用于STAT3，且對STAT3表達(dá)具有抑制作用。

miR-125a-5p在腫瘤細(xì)胞生長過程中起重要作用。Jia等[5]發(fā)現(xiàn)miR-125a-5p在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中表達(dá)豐富，下調(diào)miR-125a-5p表達(dá)可抑制胰腺癌細(xì)胞生長并促進(jìn)早期胰腺癌細(xì)胞凋亡；Li[12]等發(fā)現(xiàn)miR-125a-5p通過下調(diào)ErbB3抑制肝癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡；Zhong等[13]發(fā)現(xiàn)miR-125a-5p通過下調(diào)STAT3抑制肺癌細(xì)胞增殖和侵襲，促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡。本文通過克隆形成實(shí)驗(yàn)和Western blot檢測Ki67和caspase-3表達(dá)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-125a-5p通過抑制STAT3表達(dá)抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其凋亡。

腫瘤細(xì)胞的快速侵襲轉(zhuǎn)移是癌癥治療的難點(diǎn)，miR-125a-5p與腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Cao等[14]發(fā)現(xiàn)miR-125a-5p通過靶向BRMS1抑制胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，Yang等[3]發(fā)現(xiàn)miR-125a通過抑制GALNT14表達(dá)調(diào)控卵巢癌增殖和侵襲，Sun等[15]研究發(fā)現(xiàn)miR-125a-5p作為一種新型的Gab2抑制劑可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲。本研究通過Transwell檢測細(xì)胞侵襲情況可知，過表達(dá)miR-125a-5p通過抑制STAT3表達(dá)進(jìn)而抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞侵襲。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是腫瘤細(xì)胞的特征，miR-125a-5p在腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中起重要作用。Waresijiang等[9]發(fā)現(xiàn)miR-125a-5p通過靶向MMP-11抑制骨肉瘤細(xì)胞遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。本研究通過倒置顯微鏡觀察和Western blot檢測E-cadherin、Vimentin和N-cadherin的表達(dá)可知，過表達(dá)miR-125a-5p通過抑制STAT3表達(dá)進(jìn)而抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

miR-125a-5p通過各種信號通路作用于腫瘤細(xì)胞。其通過p53依賴通路誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞凋亡[16]；Zhang等[17]發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-125a-5p可上調(diào)TAZ-EGFR信號通路并促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤增殖；Liang等[18]發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-125a-5p通過靶向p38/JNK/ERK通路促進(jìn)涎腺腺樣囊性腫瘤發(fā)生發(fā)展。Tong等[7]研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-125a-5p通過靶向調(diào)節(jié)BCL2、BCL2L12 和MCL1通路抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-125a-5p通過抑制STAT3抑制SW480細(xì)胞STAT3下游靶基因Bcl-2、c-Myc和 cycD表達(dá)，從而抑制結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展。

體外研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌細(xì)胞中，過表達(dá)miR-125a-5p可靶向抑制STAT3，從而抑制細(xì)胞增殖、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制STAT3下游靶基因Bcl-2、c-Myc和 cycD表達(dá)。機(jī)體內(nèi)環(huán)境極其復(fù)雜，為更好地研究過表達(dá)miR-125a-5p對結(jié)腸癌的作用機(jī)制，課題組進(jìn)行了裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。Fu等[19]通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了miR-125a-5p在前列腺癌中通過NAIF1調(diào)控癌細(xì)胞增殖和遷移；Qin等[20]通過小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了miR-125a-5p通過靶向ABL2調(diào)控人宮頸癌細(xì)胞增殖和遷移。本文通過裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了在機(jī)體內(nèi)過表達(dá)miR-125a-5p可抑制SW480細(xì)胞增殖和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并可抑制SW480細(xì)胞STAT3下游靶基因Bcl-2、c-Myc和cycD表達(dá)，從而抑制結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，過表達(dá)miR-125a-5p直接靶向抑制STAT3表達(dá)，從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，同時(shí)誘導(dǎo)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞凋亡，并抑制STAT3下游靶基因Bcl-2,c-Myc和 cycD表達(dá)，從而抑制結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展，為結(jié)腸癌的診斷和治療提供了新的依據(jù)。