張宸瑜 陳柯遠 賈雨婷 季少平

(河南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，開封 475000)

近年來，以T細胞為效應(yīng)細胞的靶向性免疫細胞療法成為抗腫瘤研究的熱點，其目的是產(chǎn)生或者增強針對癌細胞的免疫應(yīng)答來對抗癌癥。這些技術(shù)也可稱為過繼性細胞轉(zhuǎn)移(adoptive cell transfer,ACT)療法。近幾年來，此方法廣泛被認為是最有可能征服腫瘤的免疫治療技術(shù)。它主要是從人腫瘤內(nèi)部或外周血中采取自身T淋巴細胞，進行基因工程修飾、加入細胞因子等刺激、進行體外培養(yǎng)，使具有一定抗腫瘤活性的T淋巴細胞大量擴增，再回輸至患者體內(nèi)，從而達到抗腫瘤效果。一般用于過繼性免疫療法的免疫細胞包括：淋巴因子激活的殺傷細胞(lymphokine-activated killer cell，LAK)，細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞(cytokine induced killer，CIK)，細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic lymphocyte，CTL)，腫瘤浸潤性淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocytes，TILs)，T細胞受體(T cell receptor，TCR)T細胞和嵌合抗原受體(chemical antigen receptor，CAR)T細胞等。目前，TIL、TCR-T、CAR-T細胞技術(shù)在臨床試驗中已經(jīng)取得了良好成效。

1 三種ACT療法技術(shù)原理

1.1TILs細胞技術(shù)原理 TILs抗腫瘤技術(shù)是用機械處理或酶消化的方式，從腫瘤組織內(nèi)部分離出TILs，在體外大量擴增后再回輸至患者體內(nèi)進行免疫治療的方法。TILs是淋巴細胞的異質(zhì)群體，主要由T淋巴細胞和自然殺傷細胞(natural killer cell，NK)組成，它可以自發(fā)遷移到任何實體腫瘤內(nèi)部。據(jù)報道，使用自體腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)的過繼細胞轉(zhuǎn)移技術(shù)在治療黑色素瘤轉(zhuǎn)移的患者時，能夠達到約50%的反應(yīng)率[1]。但最近有研究發(fā)現(xiàn)，在腸癌和卵巢癌分離出的TIL中，只有大約10%的TIL細胞有識別周圍癌細胞的能力，其他的都是與癌細胞無關(guān)的T細胞。更意外的是，有兩名患者的腫瘤組織樣本中根本沒有能識別癌細胞的殺傷性T細胞，盡管這兩份組織樣本中也充滿了TIL[2]。由此可以得知，通過體外擴增后回輸?shù)腡IL 細胞絕大部分在體內(nèi)往往不能有效識別腫瘤細胞，因此TIL過繼細胞轉(zhuǎn)移技術(shù)仍需要進一步的研究與改善。

1.2TCR-T細胞技術(shù)原理 TCR-T細胞技術(shù)是通過轉(zhuǎn)染能識別腫瘤相關(guān)抗原(Tumor-associated antigen,TAA)的TCR基因到宿主T細胞中，使T細胞表達能特異性識別TAA的TCR，并具有分泌細胞因子和特異性殺傷腫瘤細胞的能力。TCR是由α鏈和β鏈與T細胞表面的CD3復(fù)合物以非共價結(jié)合構(gòu)成(圖1)。在T細胞殺傷靶細胞的過程中需要抗原提呈細胞(antigen presenting cell,APC)遞呈抗原，并形成抗原肽-MHC分子復(fù)合物，才能被TCR的可變區(qū)識別并初步活化T細胞；同時與T細胞接觸的APC也被活化，上調(diào)表達共刺激分子CD80/CD86，與T細胞表面共刺激分子CD28相互作用，產(chǎn)生T細胞活化第二信號。此時T細胞被完全活化，開始誘導(dǎo)毒性T淋巴細胞分泌殺傷因子并有效殺傷靶細胞，或通過Fas/FasL途徑誘導(dǎo)靶細胞凋亡(圖2)。

TCR-T淋巴細胞的優(yōu)點是可以識別所有能被人源APC呈遞的HLA-Ⅰ類、Ⅱ類抗原，包括細胞內(nèi)和細胞膜上的腫瘤相關(guān)抗原，更容易找到特異性高的“安全靶點”，副作用較小，也更容易侵入腫瘤內(nèi)部。不過在有關(guān)TCR-T的研究中，其缺點也很明顯——Johnson等[3]開發(fā)了針對MART-1表面抗原位點的高親和力TCR， 可以較強識別低表達 MART-1的惡性黑色素瘤細胞。由于MART-1抗原的低特異性，雖然有一些療效，但有超過一半的患者表現(xiàn)出皮膚、眼睛和耳朵中正常黑色素細胞破壞的癥狀,有時需要局部應(yīng)用類固醇給藥來治療葡萄膜炎和聽力喪失。

圖1 TCR的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic of TCR

1.3CAR-T細胞技術(shù)原理 CAR-T細胞免疫治療技術(shù)是通過將患者的T淋巴細胞轉(zhuǎn)入嵌合的CAR序列，表達后在體外大量擴增，然后回輸入患者體內(nèi)并殺死腫瘤細胞的技術(shù)。轉(zhuǎn)入CAR序列，使得T細胞具有特異性識別腫瘤的能力。與TCR-T不同的是，CAR-T細胞能以非MHC限制的方式識別靶細胞，并激活自身增殖，分泌大量細胞因子，同時誘導(dǎo)靶細胞凋亡。

通常，CAR是由胞外用來識別腫瘤抗原位點的抗體可變區(qū)以及胞內(nèi)來自T細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)模塊組合而成的融合蛋白。胞外的單鏈抗體輕、重鏈可變區(qū)scFv片段負責(zé)識別并結(jié)合腫瘤抗原靶點，跨膜區(qū)的鉸鏈提供抗體識別的靈活性，胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)的CD28和CD3ζ負責(zé)向細胞內(nèi)傳遞活化信號和增殖信號。CAR-T細胞被激活后會在短時間內(nèi)分泌大量細胞因子激活自身以及其他免疫細胞，并誘導(dǎo)靶細胞凋亡。

據(jù)報道，CAR已經(jīng)發(fā)展到第四代(圖3)，第一代的CAR是1989年Eshha研究小組發(fā)明的，其胞外是scFv單鏈抗體片段，胞內(nèi)只有CD3ζ。第一代CAR在細胞擴增、體內(nèi)存活時間以及細胞因子分泌等方面存在一定缺陷，導(dǎo)致其臨床療效未達到預(yù)期效果；第二代CAR在第一代的基礎(chǔ)上引入了共刺激分子胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域[(costimulatory molecules endodom-ain)CD28或CD137(4-1BB)]，與第一代相比，第二代CAR-T細胞比第一代具有更強的增殖能力、更高的細胞毒性以及更長的體內(nèi)存活時間；第三代CAR是在加入CD28的同時，又加入了CD137或CD134，進一步延長體內(nèi)T細胞的存活時間，增強其抗腫瘤能力。目前，第二代CAR-T技術(shù)是臨床試驗研究最常用的細胞免疫技術(shù)[4]。第四代CAR-T是在第三代CAR-T的基礎(chǔ)上,同時導(dǎo)入可誘導(dǎo)表達的IL-12基因，使其獲得CAR-T細胞與誘導(dǎo)型IL-12的雙重抗癌活性。IL-12能以自分泌方式增強CAR-T細胞活化，還能以旁分泌方式吸引并激活先天性免疫細胞，而先天性免疫細胞則可以分泌TNF-α來攻擊那些不被CAR-T細胞識別的陰性抗原腫瘤細胞，從而進一步加強了CAR-T細胞抗腫瘤的免疫能力[5]。

圖2 T細胞活化的雙信號途徑與CAR-T細胞對腫瘤細胞的殺傷Fig.2 Double signal pathway of T cell activation and kill of tumor cells by CAR-T cells

目前，CAR-T細胞免疫技術(shù)已經(jīng)在血液腫瘤方面取得了巨大成功,尤其是以CD19為靶點的CAR-T免疫療法已經(jīng)成功治愈慢性淋巴細胞白血病(Chronic lymphocytic leukemia，CLL)和急性淋巴細胞白血病(Acute lymphocytic leukemia，ALL)等血液惡性腫瘤。由于CD19主要表達于B淋巴細胞譜系起源的細胞，因此CD19-CAR-T在治療效果和低毒性方面都具有優(yōu)勢。此外，針對實體瘤的CAR-T細胞療法也具有一定成效，但是依然存在一些潛在障礙，其中包括：①CAR-T細胞不能特異的定位到腫瘤部位;②體內(nèi)具有阻止CAR-T細胞浸潤的物理屏障；③由于實體瘤抗原的高度異質(zhì)性或缺乏特異性導(dǎo)致抗原選擇難度增加；④一些健康器官/細胞中靶點抗原表達導(dǎo)致脫靶毒性的風(fēng)險增高；⑤在腫瘤微環(huán)境中一些免疫抑制因子會使CAR-T細胞功能失調(diào)[6]。目前，正在進行的臨床前研究和臨床試驗試圖通過使用改良的基因轉(zhuǎn)移方法和治療方案來克服這些障礙。 開發(fā)新的更具有特異性的靶標(biāo)進行 CAR

圖3 四代CAR的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.3 Schematic of four-generation CAR

的改造：例如用于結(jié)腸直腸癌的CEA、用于神經(jīng)母細胞瘤和肉瘤的二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂GD2、用于前列腺癌和黑色素瘤的PSMA以及用于膠質(zhì)母細胞瘤的EGFRvⅢ等，可以不同程度地提高抗原的特異性，降低毒副作用，有望增加治療效果。

2 CAR-T細胞療法的臨床應(yīng)用

2.1CD19-CAR-T 2011年起，靶向CD19的第二代CAR-T細胞技術(shù)成為CAR-T細胞免疫療法的主流。CD19在B細胞譜系起源的惡性腫瘤中表達水平較高，并且它不在B細胞譜系之外的細胞表達，因此在一定程度上降低了脫靶毒性，這使得CD19成為非常理想的腫瘤相關(guān)抗原靶點[7]。但由于正常的B淋巴細胞也會有CD19的表達,所以經(jīng)過CD19-CAR-T技術(shù)成功治療的患者通常具有深度B細胞發(fā)育不良的癥狀，需要通過靜脈注射免疫球蛋白來彌補B細胞的損失[7,8]。幸運的是，在停用CD19-CAR-T治療后，大部分患者通過造血使得B淋巴細胞得以恢復(fù)。

ALL患者Emily是第一位成功接受CAR-T細胞治療的人，她于2012年加入了賓夕法尼亞大學(xué)的CAR-T-19臨床試驗，成為全球第一位接受試驗性CAR-T細胞免疫治療的兒童患者。該患者接受治療后曾一度出現(xiàn)細胞因子風(fēng)暴；幸運的是在接受了降低免疫反應(yīng)的藥物依那西普(一種腫瘤壞死因子阻斷劑)和托珠單抗(一種人源化白細胞介素6受體拮抗劑)后，CAR-T的嚴(yán)重副作用幾乎被完全緩解，最終檢查結(jié)果顯示患者體內(nèi)的癌細胞徹底消失，并且5年沒有復(fù)發(fā)[9]。

2.2HER2-CAR-T 人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)作為乳腺癌靶點研究的比較多，但在骨肉瘤、尤文氏肉瘤等其他腫瘤治療中也有一些研究。值得注意的是Ahmed等[10]研究發(fā)現(xiàn)，HER2低水平表達的惡性腫瘤也可以用HER2-CAR-T細胞進行治療并且在臨床前動物模型中這些HER2-CAR-T細胞具有有效的抗腫瘤活性[11]。在臨床試驗中，19名HER2陽性腫瘤患者輸注HER2-CAR-T細胞后，普遍耐受性良好，HER2-CAR-T細胞可以在患者體內(nèi)持續(xù)存在6周而沒有明顯的毒性，患者中位總生存期達到10.3個月(范圍5.1至29.1個月)。這項研究首次評估出HER2-CAR-T細胞在癌癥患者的治療中具有安全性和有效性，為今后HER2-CAR-T細胞免疫療法的癌癥治療研究奠定了基礎(chǔ)[12]。

2.3GD2-CAR-T 二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂(disialoganglioside，GD2)少量表達于人小腦以及外周神經(jīng)細胞中，而在一些腫瘤中，比如神經(jīng)母細胞瘤、黑色素瘤等也有較高表達。GD2是FDA批準(zhǔn)的治療性單克隆抗體的靶標(biāo)，可以作為細胞免疫治療的腫瘤相關(guān)抗原。在Louis等[13]的研究中，19例惡性程度較高的神經(jīng)母細胞瘤患者經(jīng)過GD2-CAR-T細胞的輸注治療后，輸注緩解8例，剩下復(fù)發(fā)的11例當(dāng)中，又有3例完全緩解。在經(jīng)過5年的隨訪中，唯一觀察到與治療相關(guān)的不良癥狀的2名受試者出現(xiàn)低度發(fā)熱和輕度至中度的局部疼痛；1名受試者出現(xiàn)不明原因的局部疼痛，但沒有受試者出現(xiàn)與GD2單克隆抗體輸注相關(guān)的神經(jīng)性疼痛或功能障礙。在這些病例中還觀察到CAR-T細胞在患者體內(nèi)可以存活很長時間(最長時間長達4年)，表明CAR-T細胞可能在患者體內(nèi)具有持久性，并且這種持久性似乎可以預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)，與患者更長的存活率相關(guān)。

2.4CAⅨ-CAR-T 碳酸酐酶Ⅸ(Carbonic anhydr-ase Ⅸ，CAⅨ)在腎癌細胞中表達量較高。Lamers等[14]將CAⅨ-CAR-T用于治療轉(zhuǎn)移性腎細胞癌(metastatic renal cell carcinoma，mRCC)。結(jié)果8名患者均發(fā)生CTC 2～4級肝功能異常。其中4名患者因脫靶作用嚴(yán)重而停止治療，其肝組織活檢的結(jié)果顯示，表達CAⅨ正常的膽管上皮中伴有T細胞和CAR-T細胞的浸潤。為了預(yù)防CAR-T的脫靶毒性，研究者經(jīng)過實驗發(fā)現(xiàn)，2～5 mg G250的用藥劑量(98～320 ng/ml的血液水平)，抗體可以有效覆蓋在低表達CAⅨ的正常肝細胞表面，保護正常肝組織免受CAR-T細胞的傷害，并且該抗體水平并不阻止CAR-T細胞殺傷腫瘤細胞。如果要完全阻斷CAR-T殺傷mRCC腫瘤細胞，則抗體在血液中的水平需要增加到10 μg/ml以上。后來研究者用低劑量的CAⅨ單克隆抗體(mAb)G250對另外4名患者進行預(yù)處理，再進行CAⅨ-CAR-T細胞的輸注治療，結(jié)果顯示并未有肝毒性和外周T淋巴細胞浸潤持續(xù)增強的跡象。該報告顯示實體瘤的脫靶毒性癥狀可以在治療前通過注射靶點mAb改善。未來，這一技術(shù)有可能是CAR-T技術(shù)攻克實體瘤的關(guān)鍵。

3 不良反應(yīng)

3.1細胞因子釋放綜合征(cytokine release syndrome,CRS) CRS是一種由T細胞活化引發(fā)的全身性炎癥反應(yīng)。輸注CAR-T細胞后患者體內(nèi)的T細胞、B細胞、NK細胞以及單核/巨噬細胞會釋放大量的細胞因子，主要是IL-1、IL-6、TNF-α、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MCP-1和IL-8等。這些細胞因子水平顯著升高，從而出現(xiàn)高熱、肌痛、乏力、惡心、低血壓、心動過速、腎損害、肝衰竭，甚至呼吸困難等不良癥狀，嚴(yán)重者會有致死性風(fēng)險。CRS通常發(fā)生在CAR-T治療后的第一周內(nèi)，且于1～2周內(nèi)達到最高峰，其嚴(yán)重程度與腫瘤負荷相關(guān)。最近Theodoros等[15]發(fā)現(xiàn)CRS是由炎性分子IL-1引發(fā)的，在治療方案中加入抑制IL-1的阿那白滯素(IL-1抑制劑，Anakinra)能夠有效控制CRS和神經(jīng)毒性。也有研究發(fā)現(xiàn)，細胞因子的釋放與腎上腺素、去甲腎上腺素、多巴胺等兒茶酚胺類物質(zhì)有關(guān)，通過限制此類物質(zhì)的合成可以有效控制CRS的發(fā)生。在多種免疫治療的小鼠模型中，這種方法都能夠降低細胞因子產(chǎn)生、增加存活率，同時不會影響到治療效果。并且，兒茶酚胺合成的關(guān)鍵限速酶酪氨酸羥化酶(TH)抑制劑α-甲基酪氨酸(MTR)以及α-腎上腺素受體阻滯劑哌唑嗪等物質(zhì)是FDA批準(zhǔn)用于治療高血壓的藥物[16-18]。

3.2神經(jīng)毒性征 CAR-T細胞療法的另一嚴(yán)重副反應(yīng)就是神經(jīng)毒性。神經(jīng)毒性在很大程度上是可逆的，在使用托珠單抗和地塞米松(一種糖皮質(zhì)激素，主要用于過敏性與自身免疫性炎癥性疾病)進行治療后，神經(jīng)毒性一般會于4.5 d(中位天數(shù))后完全緩解。大部分患者的神經(jīng)毒性并發(fā)癥是短暫和輕微的，只有小部分患者會有嚴(yán)重副反應(yīng)，包括昏迷、頭痛、意識水平下降、失語癥、語言障礙、神經(jīng)錯亂、癲癇、局灶性神經(jīng)功能缺損和顱內(nèi)大出血等。在Gust等[19]的研究中，CD19-CAR-T用于治療133名患有難治性CD19陽性B細胞急性淋巴細胞白血病(B-ALL)、CLL和非霍奇金淋巴瘤(NHL)的患者，雖然在Ⅰ期研究中取得較高的反應(yīng)率，但有40%的患者發(fā)生了不同程度的神經(jīng)毒性，在這40%的患者當(dāng)中又有90%的患者同時發(fā)生了CRS，并且更早出現(xiàn)CRS的患者會有更高的神經(jīng)毒性風(fēng)險。目前神經(jīng)毒性的根本原因尚不清楚，不過研究發(fā)現(xiàn)，有內(nèi)皮細胞活化的患者經(jīng)過CD19-CAR-T治療后可能會發(fā)生更為嚴(yán)重的神經(jīng)毒性，且使用托珠單抗等藥物治療后恢復(fù)更慢，說明神經(jīng)毒性與患者內(nèi)皮活化存在一定聯(lián)系[19]。

3.3脫靶毒性 有一些TAA位點，不僅在腫瘤細胞表面表達量較高，而且正常組織細胞表面也會有表達。因此CAR-T細胞在殺傷腫瘤細胞的同時也可能會損傷正常組織細胞，這就產(chǎn)生了脫靶毒性。碳酸酐酶Ⅸ(CAⅨ)在腎透明細胞癌表面高表達，但是正常膽管上皮細胞表面也會表達，Lamers等[14]在研究靶向CAⅨ的第一代CAR-T細胞的試驗中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性腎細胞癌的患者經(jīng)過治療后，出現(xiàn)因T淋巴細胞浸潤導(dǎo)致的膽管炎和一定程度的肝毒性。

同樣在靶向HER2位點的第三代CAR-T細胞療法試驗中，也存在顯著脫靶毒性。研究顯示其毒性是由CAR-T細胞識別并殺死低密度表達的陽性HER2肺上皮細胞引起的，同時引發(fā)肺衰竭和大量細胞因子的釋放。但是Ahmed等[12]同時也發(fā)現(xiàn)低親和力的scFv配合低劑量的CAR-T細胞進行治療是相對安全的，但是其臨床抗腫瘤活性較低，這就迫切需要尋找特異性更強的腫瘤相關(guān)抗原位點，或者研究出有效的靶點單抗對患者進行預(yù)處理保護患者正常組織來降低脫靶毒性[14]。

4 癌癥復(fù)發(fā)

在免疫治療中，腫瘤逃逸是癌癥復(fù)發(fā)的主要原因。雖然大多數(shù)復(fù)發(fā)性的白血病患者在經(jīng)過CD19-CAR-T細胞治療后可以完全緩解，但在一些ALL患者當(dāng)中，CAR-T細胞靶向的CD19陽性腫瘤細胞上抗原表位的缺失會導(dǎo)致CAR-T細胞無法正常識別B-ALL腫瘤細胞，進而導(dǎo)致癌癥復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)后的腫瘤細胞為CD19陰性。在Grupp[9]的研究當(dāng)中，兩名患有復(fù)發(fā)和難治性ALL的兒童經(jīng)過CAR-T治療后，一名患者持續(xù)緩解，另一名患者一年后復(fù)發(fā)，且復(fù)發(fā)患者的腫瘤細胞不再表達CD19。Jacoby等[20]通過對小鼠B-ALL腫瘤模型的研究表明，CD19-CAR-T的作用壓力可誘導(dǎo)B-ALL腫瘤細胞發(fā)生部分或完全的免疫表型改變，引起CD19表達降低或者沉默，從而耐受CD19-CAR-T治療。CD19的缺失表明對于ALL患者的治療除了靶向CD19之外還需要靶向其他分子進行雙靶點或多靶點CAR-T治療。

近期研究發(fā)現(xiàn)在給一名身患復(fù)發(fā)/難治性B細胞急性淋巴細胞白血病(B-ALL)的患者構(gòu)建CAR-T細胞時,CAR基因意外地被加到患者癌變的B細胞上,形成了“CAR-癌細胞”。并且加到癌細胞上的CAR會與癌細胞表面的CD19結(jié)合而屏蔽CD19分子，使得CAR-T細胞失去了識別癌細胞靶標(biāo)的機會。雖然這名患者在接受CAR-T細胞回輸?shù)?8 d之后，病情完全緩解，但在261 d之后由于“CAR-癌細胞”大量增殖，癌癥復(fù)發(fā)?；颊咦罱K死于與白血病相關(guān)的并發(fā)癥[21]。

5 通過基因編輯改良CAR

改變CAR的親和力。通過改變CAR對腫瘤靶點的親和力，能夠使CAR-T細胞更容易區(qū)分健康組織細胞上的低密度抗原分子以及腫瘤細胞上面的高密度抗原分子。比如在Richman等[22]研究的GD2-CAR-T臨床模型中，雖說GD2特異性CAR結(jié)合抗原的能力被增強，并且增加了抗腫瘤活性，然而，這種增強的體內(nèi)抗腫瘤功效也伴隨著致死性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)毒性。其中包括腦內(nèi)CAR-T細胞的大范圍浸潤和增殖以及對神經(jīng)元的破壞。因此既能保證抗腫瘤能力又能控制好脫靶毒性的CAR-T細胞是最佳選擇，這些還需要進一步的優(yōu)化和探索。

消除免疫抑制信號，如CTLA-4和PD-1。CTLA-4(CD152)表達于活化的CD4+和CD8+T細胞，其配體與CD28一樣都是CD80和CD86，但CTLA-4與配體結(jié)合的親和力顯著高于CD28，并傳遞抑制性信號，起下調(diào)或終止T細胞活化的作用；PD-1(programmed death 1)也表達于活化T細胞，配體為PD-L1和PD-L2，PD-L1與配體結(jié)合后可抑制T細胞的增殖分化及Ig的分泌。故可嘗試?yán)没蚓庉嫾夹g(shù)先將T細胞的這兩段基因沉默，再轉(zhuǎn)進CAR基因構(gòu)建CAR-T,從而達到保持CAR-T細胞活性的目的[23]。

靶向兩種或多種抗原位點。靶向單個抗原位點的CAR-T細胞在區(qū)分腫瘤細胞和健康組織細胞的能力方面會有一些限制。為了增強針對腫瘤細胞的特異性,可以開發(fā)靶向兩種或多種抗原位點的聯(lián)合識別技術(shù)。比如對B-ALL患者的治療過程中，可以使用CD19+CD22雙靶點CAR-T療法，即使腫瘤B細胞上的CD19抗原表位缺失，還可以通過靶向CD22來避免腫瘤逃逸[24]。如果產(chǎn)生脫靶效應(yīng)，則可以用mAb封閉靶點抗原來緩解脫靶效應(yīng)。最早的雙靶點CAR-T技術(shù)是將二代CAR的共刺激信號CD28與CD3ζ分開，即1個CAR-T細胞表達兩種CAR。CAR1的scFv識別靶點1，其胞內(nèi)區(qū)是CD3ζ，就像第一代CAR；CAR2的scFv識別靶點2，其胞內(nèi)區(qū)只有CD28或CD137。當(dāng)腫瘤細胞上的兩種靶點被雙靶點CAR-T細胞同時識別時，CAR-T細胞才可以完全活化并且殺傷腫瘤細胞[25]。

給CAR-T細胞添加自殺基因。Stasi等[26]設(shè)計了一種誘導(dǎo)型T細胞安全開關(guān)，它是基于人Caspase 9與修飾過的人FK結(jié)合蛋白的融合，可以條件性二聚化。當(dāng)CAR-T細胞暴露于合成的二聚化藥物時，誘導(dǎo)型半胱天冬酶9(iCasp9)被激活并誘導(dǎo)表達該基因的細胞快速死亡。研究顯示在過繼性細胞轉(zhuǎn)移療法中，一旦發(fā)生移植物抗宿主病，患者只要接受一種生物惰性小分子二聚化藥物便可以在30 min內(nèi)消除體內(nèi)90%的轉(zhuǎn)基因T細胞。因此通過iCasp9細胞自殺系統(tǒng)能夠提高細胞免疫療法的安全性，可以考慮將其拓展到臨床應(yīng)用上。

6 通用型CAR-T細胞

主要組織相容性復(fù)合體(major histocompati-bility complex，MHC)是一組決定移植組織是否相容的基因群，人的MHC稱為人類白細胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)基因復(fù)合體。由于MHC固有的限制性，ACT的治療策略只能體現(xiàn)在自體T細胞，如果可以消除MHC的限制，那么可以使用健康供體的T細胞來構(gòu)建通用型CAR-T。由健康供體T細胞構(gòu)建的CAR-T具有許多克服與癌癥治療相關(guān)的免疫缺陷的潛力，相對患者自體T細胞具有顯著的優(yōu)勢。同時能夠簡化CAR-T的制造工藝，有可能出現(xiàn)即用型的“CAR-T產(chǎn)品”，使得整個治療過程更快捷，更便宜[27]。

根據(jù)Torikai等[28]的研究報道，有兩名患者成功使用了通用型CD19-CAR-T細胞，但由于患者自身的免疫反應(yīng)會使得自身NK細胞去裂解輸注的CAR-T細胞，所以輸注的CAR-T細胞數(shù)量會受到限制，因此治療效果也很有限。為了阻止CAR-T細胞被患者的NK細胞裂解，我們可以利用基因編輯技術(shù)將HLA-E基因插入CAR-T細胞，再刪除CAR-T細胞的HLA-Ⅰ類基因(HLA-A、HLA-B、HLA-C)。HLA-E分子是NK細胞表面CD94/NKG2的專一型配體，可以抑制NK細胞對表達HLA-E分子的細胞的殺傷作用[29]。HLA-Ⅰ類基因表達于所有有核細胞，可以被宿主CD8+T淋巴細胞特異性識別并殺傷。因此將HLA-Ⅰ類基因刪除則可以避免CAR-T細胞被接受者的自身CTL識別和裂解，降低抗腫瘤活性。所以理論上這兩種途徑可以防止接受者自身T細胞殺死通用型CAR-T細胞。

7 結(jié)語

近期CD19特異性CAR-T細胞療法已經(jīng)被美國食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)用于治療難治性B細胞前體ALL和彌漫性大B細胞淋巴瘤，也是第一種獲得美國FDA商業(yè)批準(zhǔn)的基因治療方法?？紤]到細胞因子綜合征和神經(jīng)毒性的風(fēng)險，F(xiàn)DA要求醫(yī)生完成CAR-T不良反應(yīng)的救護培訓(xùn)，進而在CAR-T細胞的治療過程中降低風(fēng)險。

今后CAR-T的發(fā)展有可能與一些新型免疫治療方法相結(jié)合，比如免疫檢查點抑制劑等；發(fā)展即用型CAR-T細胞；也有可能將CAR-T細胞作為藥物載體來靶向輸送抗癌藥物/蛋白，從而達到精準(zhǔn)治療的目的[30]。開發(fā)CAR-T最大的挑戰(zhàn)就是缺乏臨床前模型來評估CAR-T的安全性和有效性，盡管CAR-T細胞在血液腫瘤方面的研究比較成功，但用于實體瘤方面還是存在一定的障礙。隨著科學(xué)家對腫瘤特異性抗原研究的不斷深入以及基因修飾技術(shù)的不斷發(fā)展，未來的CAR-T細胞免疫療法將會更加精準(zhǔn)有效。