陳明霞 張 恩 劉 芳 張娟紅 陸衛(wèi)紅 冷 偉

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)，咸陽 712000)

腎缺血再灌注損傷(renal ischemia-reperfusion injury，RIRI)是指腎臟缺血一段時(shí)間后血液回流到組織而引起的組織損傷，導(dǎo)致細(xì)胞蛋白、脂質(zhì)和DNA嚴(yán)重?fù)p傷，引起氧化應(yīng)激、炎癥，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死。RIRI是術(shù)后急性腎功能不全的主要原因之一，對患者的預(yù)后不利，導(dǎo)致腎衰竭， 甚至危及生命。RIRI的病理生理過程復(fù)雜，目前尚無有效治療方法。因此本研究將開發(fā)新的用于RIRI治療的藥物并研究其分子機(jī)制。

淫羊藿又名仙靈脾、剛前，是一種治療骨質(zhì)疏松癥、心血管功能障礙、改善神經(jīng)功能和性功能的中草藥，為多年生草本植物[1]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載淫羊藿具有滋陰補(bǔ)陽、壯陽強(qiáng)身之效。淫羊藿苷(Icariin，ICA)為淫羊藿活性成分的提取物，具有強(qiáng)大的心血管保護(hù)功能，可抗動脈粥樣硬化、改善血管內(nèi)皮功能障礙[2-5]。研究發(fā)現(xiàn)，ICA對新生兒心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷具有保護(hù)作用，但在RIRI中的作用研究鮮有報(bào)道[6]。因此，本研究借助RIRI大鼠模型，研究ICA對RIRI的保護(hù)作用，及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 SPF級SD大鼠40只，雌雄不限，取自我院動物中心，許可證號：SYXK(川)2018-213，體質(zhì)量200～230 g。于(23±3)℃、濕度40%～70%條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，自由攝食飲水，晝夜節(jié)律12 h。

1.1.2試劑 ICA(110737-201516)購自中國食品藥品檢定研究院，含量94.2%；生理鹽水(merck-millipore，02-0780-00)；水合氯醛(經(jīng)科公司，JKLN006718)；染色液(古朵，GD-K4042)；PBS(Miltenyi，DXT-130-070-525)；ELISA試劑盒(westang，f00001)；MDA檢測試劑盒[jingkang，JK-(a)-2197]；SOD檢測試劑盒[jingkang，JK-(a)-2293]；TUNEL染色酶(Roche，11767305001)；蛋白酶K(源葉，S10085)；DAPI(源葉，S19119)；RIPA裂解液(源葉，R12135)；脫脂奶粉(源葉，S30865);抗體Cleaved Caspase-3(Asp175)Antibody #9661、Cleaved Caspase-9(Asp315)(D8I9E)Rabbit mAb #20750、NRF2(D1Z9C)XP? Rabbit mAb #12721、HO-1(E9H3A)Rabbit mAb(Mouse Specific)#86806、NQO1(A180)Mouse mAb #3187購自CST公司。

1.1.3儀器 生物安全柜(鑫貝西，11228 BBC86)；生物顯微鏡(意大利OPTIKA，B-510BF)；生化分析儀(科華卓越，LFF-LC-1817)；酶標(biāo)儀(QIAGEN，9232933)；玻璃勻漿器-Glass Homogenizer(Ybscience，YB101103-1)；倒置熒光顯微鏡(mshot，MF52)；凝膠成像系統(tǒng)(AXYGEN，GDBL-1000)。1.2方法

1.2.1RIRI造模及分組 采用微型動脈夾夾閉雙側(cè)腎蒂法制備大鼠RIRI模型。術(shù)前禁水4 h，禁食12 h。采用2%異氟烷和氧氣/氧化亞氮混合氣體吸入法麻醉大鼠，10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥固定，切開腹中線。用微型動脈夾夾閉雙側(cè)腎蒂，腎臟顏色變?yōu)榘导t色提示誘導(dǎo)缺血成功，移去微型動脈夾，耗時(shí)約40～50 min。當(dāng)腎臟顏色由紅變白再變?yōu)轷r紅色時(shí)，RIRI模型構(gòu)建成功，縫合傷口。假手術(shù)組僅切開腹中線，不夾閉雙側(cè)腎蒂。術(shù)后將大鼠置于37℃蘇醒，同等條件下正常飼養(yǎng)24 h 后處死，收集血清或腎組織用于后續(xù)試驗(yàn)，-80℃保存?zhèn)溆?。RIRI模型大鼠隨機(jī)分為4組：ICA組(60 mg/kg)、RIRI組、RIRI+ICA低劑量組(30 mg/kg)和RIRI+ICA高劑量組(60 mg/kg)，每組8只。ICA處理組在術(shù)前用相應(yīng)劑量的ICA對大鼠進(jìn)行連續(xù)3 d的灌胃預(yù)處理。假手術(shù)組給予等體積生理鹽水。

1.2.2HE染色觀察腎組織病理損傷 取待檢RIRI組織，固定包埋，切4 μm厚片，各試驗(yàn)組制作5片，從中選取1片進(jìn)行分析。根據(jù)HE染色液說明書進(jìn)行染色。染色后在各切片中選取5個(gè)區(qū)域觀察，隨機(jī)選取1個(gè)區(qū)域作為試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.3腎功能評估 提取RIRI后的待檢血液樣本，4℃、2 000 g離心15 min，取上清。生化分析儀檢測血清中BUN和Cr表達(dá)水平。各試驗(yàn)組檢測5組數(shù)據(jù)，除去最高值和最低值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.4ELISA 根據(jù)ELISA試劑盒說明書檢測待檢血清中炎癥因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)水平。將酶復(fù)合物用稀釋液稀釋，加血清及TNF-α、IL-1β和IL-6的陰性和陽性對照物，孵育1 h，洗板，加底物，避光反應(yīng)30 min后加終止液完成反應(yīng)。酶標(biāo)儀檢測450 nm處TNF-α、IL-1β和IL-6吸光度。

1.2.5氧化應(yīng)激檢測 待檢血液樣本于4℃、2 000 g 離心15 min，取上清。根據(jù)MDA和SOD檢測試劑盒說明書檢測試驗(yàn)組大鼠血清MDA和SOD水平。SOD水平上升、MDA水平下降則表示氧化應(yīng)激減輕。

1.2.6TUNEL檢測細(xì)胞凋亡情況 取待檢RIRI組織，固定包埋，切4 μm厚片，各試驗(yàn)組制作5片，從中選取1片進(jìn)行試驗(yàn)。二甲苯醇脫羧，蛋白酶K(20 μg/ml)37℃處理15 min。PBS洗滌3次，TUNEL染色酶37℃處理30 min。PBS洗滌3次，DAPI染色，倒置熒光顯微鏡分析各試驗(yàn)組腎組織細(xì)胞凋亡情況。

1.2.7Western blot檢測Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Nrf2/p-Nrf2、HO-1和NQO1表達(dá) RIPA裂解液溶解腎組織，提取蛋白，雙辛酸法定量。各試驗(yàn)組取40 μg蛋白行SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉在室溫下封膜2 h。加入Cleaved Caspase-3(1∶1 000)、Cleaved Caspase-9(1∶1 000)、Nrf2/p-Nrf2(1∶1 000)、HO-1(1∶1 000)和NQO1(1∶1 000)一抗4℃孵育過夜。加入二抗室溫孵育2 h。加入ECL觀察條帶，凝膠成像系統(tǒng)(AXYGEN)拍照。

2 結(jié)果

2.1ICA改善缺血再灌注后腎損傷 HE染色結(jié)果顯示，ICA組與假手術(shù)組無明顯病理損傷，表明60 mg/kg ICA對大鼠無明顯毒副作用。RIRI組大鼠腎組織病理損傷明顯，且隨ICA劑量增加病理損傷減輕，表明ICA可劑量依賴性地緩解腎組織病理損傷和功能紊亂(圖1A)。RIRI組大鼠BUN和Cr水平顯著高于對照組和ICA組(P<0.01)，而RIRI+ICA低劑量組和RIRI+ICA高劑量組大鼠BUN和Cr水平比RIRI組顯著降低，RIRI+ICA高劑量組降低更為顯著(P<0.01，圖1B)。提示大鼠腎缺血再灌注后，ICA劑量依賴性地降低血清BUN和Cr水平，改善缺血再灌注后大鼠腎損傷。

2.2ICA減輕RIRI引起的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激 RIRI組炎癥因子水平明顯高于假手術(shù)組和ICA組(P<0.01)，RIRI+ICA低劑量組和RIRI+ICA高劑量組炎癥因子水平降低，且RIRI+ICA高劑量組降低最為顯著(P<0.01)。提示ICA劑量依賴性地降低大鼠RIRI后炎癥因子表達(dá)。RIRI各組SOD水平相比于假手術(shù)組和ICA組明顯下降(P<0.01)，RIRI+ICA低劑量組和高劑量組SOD水平相比于RIRI組明顯上升，且呈劑量依賴性，其中RIRI+ICA高劑量組上升最為顯著(P<0.01)。RIRI組MDA水平比假手術(shù)組和ICA組顯著上升(P<0.01)，而RIRI+ICA低劑量組和高劑量組MDA水平相比RIRI組明顯降低，且呈劑量依賴性，其中RIRI+ICA高劑量組降低最為明顯(P<0.01)。說明ICA劑量依賴性地上調(diào)SOD，下調(diào)MDA，抑制氧化應(yīng)激，緩解RIRI引起的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激(圖2)。

2.3ICA減輕RIRI引起的細(xì)胞凋亡 ICA組與假手術(shù)組細(xì)胞無顯著凋亡現(xiàn)象，表明60 mg/kg ICA對大鼠無明顯毒副作用，RIRI各組細(xì)胞凋亡顯著，隨ICA劑量上升細(xì)胞凋亡減少。RIRI組Cleaved Caspase-3 和 Cleaved Caspase-9 表達(dá)明顯高于假手術(shù)組和ICA組(P<0.01)，且呈劑量依賴性(圖3)。說明ICA通過抑制Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡。

圖1 ICA對缺血再灌注后腎損傷的影響

2.4ICA通過調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1信號通路改善大鼠RIRI RIRI組p-Nrf2/Nrf2、HO-1和NQO1表達(dá)相比于假手術(shù)組和ICA組明顯降低(P<0.01)，且呈劑量依賴性，表明ICA劑量依賴性地激活Nrf2/HO-1信號通路。加入通路抑制劑ML385(10 μmol/L)后，RIRI+ML385組p-Nrf2/Nrf2、HO-1和NQO1表達(dá)水平比RIRI組顯著降低(P<0.05)，而RIRI+ICA+ML385組相比于RIRI+ML385組p-Nrf2/Nrf2、HO-1和NQO1表達(dá)明顯上升(P<0.05)，表明ICA可逆轉(zhuǎn)ML385對Nrf2/HO-1信號通路的抑制作用。RIRI+ML385組BUN和Cr含量明顯高于RIRI組(P<0.05)，而RIRI+ICA+ML385組BUN和Cr含量明顯低于RIRI+ML385組(P<0.05，圖4)。說明ICA可劑量依賴性地逆轉(zhuǎn)通路抑制劑ML385的作用，下調(diào)BUN和Cr水平。ICA以劑量依賴方式通過激活Nrf2/HO-1/NQO1信號通路減輕大鼠RIRI。

圖2 ICA對RIRI引起的炎癥和氧化應(yīng)激的影響Fig.2 Effect of ICA on inflammation and oxidative stress caused by RIRINote:Compared with Sham，**.P<0.01;compared with RIRI，#.P<0.05,##.P<0.01.

圖3 ICA減輕RIRI引起的細(xì)胞凋亡

圖4 ICA通過調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1信號通路改善大鼠RIRI損傷Fig.4 ICA improves rat RIRI injury by modulating Nrf2/HO-1 signaling pathwayNote:Compared with Sham,**.P<0.01;compared with RIRI，#.P<0.05,##.P<0.01.

3 討論

RIRI是指腎缺血再灌注對腎組織造成的損傷，其原因并非缺血，而是恢復(fù)血液供應(yīng)后，過量自由基攻擊重新獲得血液供應(yīng)的組織內(nèi)細(xì)胞。RIRI主要發(fā)生在創(chuàng)傷性休克、外科手術(shù)、器官移植、燒傷、凍傷和血栓等血液循環(huán)障礙性疾病之后，主要引發(fā)腎功能紊亂、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致?lián)p傷加重[7]。本研究利用生化分析儀檢測RIRI后腎功能變化，結(jié)果顯示BUN和Cr含量上升，說明缺血再灌注對腎臟造成了組織學(xué)損傷，以此標(biāo)準(zhǔn)評估腎功能。RIRI后BUN和Cr含量上升，說明缺血再灌注導(dǎo)致腎組織損傷和腎功能紊亂[8]。ELISA檢測RIRI后炎癥因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)表達(dá)水平，結(jié)果顯示，炎癥因子表達(dá)水平上升，引起大鼠腎組織炎癥反應(yīng)，與既往研究結(jié)論相似[8]。SOD是氧化應(yīng)激的重要酶，MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物。研究發(fā)現(xiàn)，RIRI后使用SOD清除自由基，對損傷組織具有一定保護(hù)作用[7]。本研究利用SOD和MDA檢測試劑盒分別檢測SOD和MDA表達(dá)水平，結(jié)果顯示，RIRI后SOD表達(dá)水平降低，MDA表達(dá)水平上升，說明RIRI引發(fā)大鼠氧化應(yīng)激。Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP被認(rèn)為是不良組織反應(yīng)的分子標(biāo)志物和早期指標(biāo)，提示細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白改變[9，10]。本研究采用TUNEL染色檢測RIRI后細(xì)胞凋亡情況，并進(jìn)一步檢測Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RIRI后細(xì)胞凋亡增加，Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9表達(dá)升高，說明RIRI導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，不良組織反應(yīng)分子標(biāo)志物表達(dá)上升。本研究中RIRI對腎的損害作用與既往研究結(jié)論相似[11，12]。研究發(fā)現(xiàn)，氧化苦參堿、阿立哌唑、四氫生物蝶呤、舒洛地特、羅布麻素等藥物通過抑制炎癥因子、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡及激活抗凝血酶Ⅲ減弱RIRI[11-16]。本研究亦發(fā)現(xiàn)ICA可作為RIRI治療的潛在藥物。

ICA是從中草藥淫羊藿中提取的黃酮類化合物，可減輕DNA損傷、抑制平滑肌細(xì)胞增殖和遷移、減少病灶面積和巨噬細(xì)胞浸潤，防止血小板活化。ICA還能有效改善心血管系統(tǒng)功能，調(diào)整內(nèi)分泌水平。臨床上，ICA主要用于治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥[17]。Zhang等[18]發(fā)現(xiàn)，ICA通過誘導(dǎo)Caspase依賴性凋亡抑制急性早期幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞生長。Jia等[19]研究表明，ICA通過抗氧化、抗炎癥、抗凋亡特性在脊髓損傷中起神經(jīng)保護(hù)作用。本研究探究了ICA對RIRI 的作用及分子機(jī)制。在大鼠RIRI后給予低劑量(30 mg/kg)和高劑量(60 mg/kg)ICA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ICA劑量依賴性地下調(diào)血清BUN、Cr、炎癥因子、MDA、Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9水平，上調(diào)SOD水平，抑制細(xì)胞凋亡。說明ICA劑量依賴性地改善大鼠RIRI引起的腎損傷。

核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor-E2-related factor-2，Nrf2)被認(rèn)為是治療癌癥的靶分子，通過抑制Nrf2和誘導(dǎo)Nrf2 2種路徑靶向治療腫瘤[21]。Nezu等[22]研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2在早期RIRI中高度活化可阻止腎小管損傷進(jìn)展。本研究利用Western blot檢測ICA對Nrf2表達(dá)的影響，并用通路抑制劑ML385(10 μmol/L)再次驗(yàn)證了Nrf2表達(dá)水平。結(jié)果顯示，ICA劑量依賴性地上調(diào)RIRI后p-Nrf2/Nrf2、HO-1和NQO1表達(dá)，且可逆轉(zhuǎn)通路抑制劑ML385對Nrf2通路的抑制作用，并使BUN和Cr含量降低，改善腎組織損傷和腎功能紊亂。結(jié)果表明，ICA劑量依賴性地調(diào)節(jié)Nrf2信號通路，減輕大鼠RIRI，與既往研究結(jié)果相似[22]。

醌氧化還原酶1(quinone oxidoreductase 1，NQO1)和血紅素加氧酶(heme oxygenase 1，HO-1)屬于抗氧化和抗凋亡基因[7]。NQO1是一種調(diào)節(jié)ROS生成的抗氧化蛋白，對RIRI誘導(dǎo)的腎損傷具有保護(hù)作用[23]。研究發(fā)現(xiàn)，RIRI后西地那非通過激活Nrf2、HO-1和NQO1對腎損傷起保護(hù)作用[24]。精氨酸通過Nrf2/HO-1信號通路減輕RIRI[25]。Nrf2/HO-1信號通路通過抑制糖原合酶Kinase-3β緩解糖尿病大鼠RIRI[26]。本研究利用Western blot檢測給予ICA后HO-1和NQO-1表達(dá)水平的變化，并用通路抑制劑ML385再次驗(yàn)證了HO-1和NQO-1的表達(dá)及BUN、Cr含量。結(jié)果顯示，ICA劑量依賴性地上調(diào)RIRI后HO-1和NQO1表達(dá)水平，且可逆轉(zhuǎn)通路抑制劑ML385對HO-1和NQO1的抑制作用，下調(diào)BUN和Cr含量，調(diào)節(jié)HO-1和 NQO1信號通路，減輕大鼠腎損傷。

總之，ICA劑量依賴性地調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1/ NQO1信號通路，改善RIRI引起的腎組織損傷和腎功能紊亂，減輕RIRI引起的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，并抑制細(xì)胞凋亡。