韓小娟，趙 玥，田洪倫，何 軍

（1.貴州省第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴陽 550004；2.溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江溫州 325035）

酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）具有簡便、快速、成本低等優(yōu)點(diǎn)而被臨床廣泛運(yùn)用[1-3]。近年來，由于全自動(dòng)酶免分析儀能減少人工成本及人為操作誤差，使檢測流程更加標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范，提高檢測結(jié)果的精確性和可溯源性，因此在臨床檢驗(yàn)中受到廣泛應(yīng)用。但全自動(dòng)酶免儀樣本孵育時(shí)間長，影響臨床樣本檢測效率。酶標(biāo)板快速孵育器因能縮短孵育時(shí)間，提高工作效率，在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用越來越多，但快速孵育法仍需要人工加樣，增加了人工參與造成的誤差。本實(shí)驗(yàn)通過利用全自動(dòng)酶免分析儀聯(lián)合酶標(biāo)板快速孵育器檢測乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg），探討優(yōu)化ELISA 操作流程在臨床檢驗(yàn)中的實(shí)用性。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2018年1月～2019年9月經(jīng)化學(xué)發(fā)光法定量檢測HBsAg 陽性高值（≥250 IU/ml）、中 值（101～250 IU/ml）、低 值（0.05～100 IU/ml）樣本各50 例，HBsAg 陰性樣本50 例。其中男性112 例，女性88 例，年齡4 ～93 歲，平均年齡46 歲。

1.2 儀器與試劑 四川邁克i3000 化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，嘉興科瑞迪全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析儀（HB-500E)，成都蓋森酶標(biāo)板快速孵育器（MKF-6)。邁克生物股份有限公司化學(xué)發(fā)光法乙型肝炎病毒表面抗原檢測試劑盒，北京萬泰生物藥業(yè)有限公司酶聯(lián)免疫法乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 所有收集的血清樣本均保存于-80℃低溫冰箱中直至分析。取出待檢樣本置于室溫至完全融化混勻，待測。

1.3.2 化學(xué)發(fā)光法定量檢測HBsAg (C 法)： 按照邁克生物股份有限公司乙型肝炎病毒表面抗原檢測試劑盒說明書和儀器SOP 操作，并嚴(yán)格執(zhí)行質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.3 ELISA 定性檢測HBsAg：試劑盒室溫放置30min 后分別用四種實(shí)驗(yàn)方法檢測，A 法：使用全自動(dòng)酶免分析儀進(jìn)行孵育檢測；B1，B2，B3 法：均使用全自動(dòng)酶免分析儀加樣、加試劑、洗板、比色，孵育時(shí)轉(zhuǎn)移到酶標(biāo)板快速孵育器進(jìn)行孵育，其中B1 法孵育時(shí)間為說明書規(guī)定時(shí)間的1/2，B2法孵育時(shí)間為說明書規(guī)定時(shí)間的1/3，B3 法孵育時(shí)間為說明書規(guī)定時(shí)間的1/4，具體孵育時(shí)間見表1，其他操作步驟嚴(yán)格遵守試劑盒說明書和儀器SOP 進(jìn)行。

1.3.4 計(jì)算每份樣本的S/CO 值：以S/CO 值≥1時(shí)判斷為樣本HBsAg 陽性，S/CO 值＜1 時(shí)判斷為樣本HBsAg 陰性。A，B1，B2，B3 法分別與化學(xué)發(fā)光法（C 法）進(jìn)行差異比較，同時(shí)計(jì)算各方法的總樣本符合率、敏感度和特異度。

表1 各方法實(shí)驗(yàn)孵育時(shí)間

1.3.5 精密度評價(jià)實(shí)驗(yàn)：選用試劑盒配套的HBsAg陰陽性對照及第三方弱陽性質(zhì)控品，使用 ELISA(A，B1，B2，B3 法)方法進(jìn)行檢測，每個(gè)質(zhì)控品連續(xù)重復(fù)測定20 次，計(jì)算變異系數(shù)（CV%）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，多組間差異的比較采用卡方（χ2）檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各方法檢測HBsAg 精密度結(jié)果 見表2。根據(jù)說明書要求，陰性對照結(jié)果吸光度值＜0.10、陽性對照結(jié)果吸光度值＞0.80 時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效，第三方弱陽性質(zhì)控S/CO 值為2 ～5 有效。20 次質(zhì)控實(shí)驗(yàn)中，陰性對照結(jié)果吸光度均值0.008，陽性對照結(jié)果吸光度均值3.68，第三方弱陽性質(zhì)控S/CO均值為3.98，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效。A，B1，B2，B3 法批內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)（精密度）判斷標(biāo)準(zhǔn)為說明書要求的精密度變異系數(shù)（CV%）≤15%，均在要求以內(nèi)。

表2 各方法對HBsAg 的精密度檢測（CV%)

2.2 各方法檢測HBsAg 定性結(jié)果 見表3。各方法與化學(xué)發(fā)光法（C 法）檢測結(jié)果進(jìn)行比較，只有全自動(dòng)酶免儀聯(lián)合酶標(biāo)板快速孵育器孵育時(shí)間縮短1/2（B1 法）時(shí)的陰陽性檢測結(jié)果與化學(xué)發(fā)光法完全一致，全自動(dòng)酶免儀單獨(dú)檢測（A法）時(shí)陰性結(jié)果一致，陽性結(jié)果有2 例不一致。但所有結(jié)果差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0～0.323，均P＞0.05）。

2.3 各方法檢測HBsAg 總樣本符合率、敏感度、特異度情況 見表4 。

表3 各方法檢測HBsAg 定性結(jié)果（n=200）

表4 各方法檢測HBsAg 總樣本符合率、敏感度、特異度情況(%)

3 討論

基于ELISA 具有成本低、簡便、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，因而ELISA 的臨床檢驗(yàn)項(xiàng)目在各級醫(yī)院都得到廣泛開展。近年來，同一ELISA 檢測方法在不同檢測系統(tǒng)間的陽性符合率也越來越得到人們關(guān)注[4]。在ELISA 實(shí)驗(yàn)中，孵育是檢測中影響檢測成敗的最關(guān)鍵因素之一[5]，因此，在確保檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的前提下，優(yōu)化檢測流程和縮短檢測時(shí)間對臨床檢驗(yàn)實(shí)際工作有重要的參考意義。

本研究以化學(xué)發(fā)光法作為檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，本次實(shí)驗(yàn)收集所有樣本的乙肝血清學(xué)模式均為HBsAg，HBeAg 和HBcAb 陽性或HBsAg，HBeAb 和HBcAb陽性。本次實(shí)驗(yàn)采用全自動(dòng)酶免分析儀聯(lián)合酶標(biāo)板快速孵育器新流程。新流程在縮短1/2 時(shí)間的情況下，其檢測HBsAg 項(xiàng)目的敏感度比單純的全自動(dòng)酶免分析儀敏感度更高。由此可見，新流程極大地縮短了檢驗(yàn)項(xiàng)目的時(shí)長，減少了臨床醫(yī)生和患者的等待時(shí)間。當(dāng)新流程將孵育時(shí)間縮短為原規(guī)定時(shí)間的1/3 和1/4 時(shí)，雖然和化學(xué)發(fā)光法檢測結(jié)果比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但敏感度相對較低，有陽性漏檢的可能，所以不推薦將孵育時(shí)間縮短為原時(shí)間的1/3 和1/4。

本研究還發(fā)現(xiàn)，全自動(dòng)酶免分析儀聯(lián)合酶標(biāo)板快速孵育器檢測一些低滴度陽性標(biāo)本中的敏感度高于全自動(dòng)酶免分析儀，其原因可能為酶標(biāo)板快速孵育器的升溫原理不一樣。酶標(biāo)板快速孵育器的原理主要是通過發(fā)熱模塊產(chǎn)生空氣循環(huán)加熱，使用多個(gè)方向風(fēng)扇旋轉(zhuǎn)使孵育腔內(nèi)形成流動(dòng)氣體，保證溫度的均勻性，且孵育全過程中結(jié)合振蕩，促進(jìn)抗原抗體結(jié)合，能一定程度上增加試劑的靈敏度[6]。而全自動(dòng)酶免儀孵育室只有微孔板金屬載架加溫，反應(yīng)板孔受熱不均勻，孵育室整體空間比較大，升溫曲線較慢，溫度不準(zhǔn)確，以及反應(yīng)板周圍環(huán)境可達(dá)到預(yù)期溫度而孔內(nèi)溫度不能達(dá)到預(yù)期溫度[7-8]。因此，在孵育過程中其實(shí)有大量的時(shí)間是用于升溫過程，而最佳孵育段的時(shí)間并沒有那么長。由此，金屬底板單面加熱可能是ELISA 自動(dòng)化儀器的缺陷[9]。

研究中，HBsAg 含量越低，快速孵育縮短的時(shí)間越短，ELISA 漏檢率越高。本文結(jié)果與劉麗等[6]人的研究結(jié)果相比，縮短1/3 時(shí)間敏感度略有不同，可能與本文所選取的低值樣本較多和儀器試劑的敏感度不同有關(guān)。且本實(shí)驗(yàn)除孵育環(huán)節(jié)不一致外，其它步驟均由同一儀器操作完成，減少了實(shí)驗(yàn)的系統(tǒng)誤差和偶然誤差，使結(jié)果更具可比性。

通過本研究證實(shí)，優(yōu)化后的全自動(dòng)酶免分析儀聯(lián)合酶標(biāo)板快速孵育器的方法檢測HBsAg，將孵育時(shí)間縮短至規(guī)定時(shí)間的1/2，在確保結(jié)果準(zhǔn)確性的同時(shí)，縮短了整個(gè)檢驗(yàn)項(xiàng)目的檢測時(shí)間，提高了工作效率，這對臨床標(biāo)本的檢測具有重要的應(yīng)用價(jià)值。