牛熙 李升 齊芬芳

[摘 要]為了能夠讓本科“分子生物學”實驗課程更為新穎和豐富，提高大型儀器流式細胞儀的使用效率，根據(jù)分子生物學課程的實驗教學特點，結(jié)合理論教學的同時，在實驗課程教學中使用流式細胞儀開展細胞凋亡和細胞周期檢測實驗。通過實驗課的開展，鍛煉學生基本實驗技能，為今后科研工作打下良好的實驗基礎。

[關(guān)鍵詞]流式細胞儀;分子生物學;實驗課程

[基金項目]2019年貴州大學本科教學工程建設項目“貴州大學分子生物學課程本科教學工程建設項目”（JG201977）;2018年貴州大學培育項目“香豬卵巢繁殖力相關(guān)lncRNA的鑒定與生物學功能分析”（黔科合平臺人才〔2018〕5781-40號）;2015年貴州科技廳與貴州大學聯(lián)合基金項目“PDIA4基因多態(tài)性與香豬產(chǎn)仔數(shù)性狀關(guān)聯(lián)研究”（黔科合LH字〔2015〕7673）

[作者簡介]牛 熙（1987—），女，貴州貴陽人，碩士，在讀博士，貴州大學農(nóng)業(yè)生物工程研究院實驗師，研究方向為動物分子生物學;齊芬芳（1986—），女，湖南株洲人，碩士，貴州大學農(nóng)業(yè)生物工程研究院博士研究生，遵義醫(yī)藥高等?？茖W校講師（通信作者），研究方向為微生物及動物分子生物學。

[中圖分類號] G642.0[文獻標識碼] A[文章編號] 1674-9324（2020）45-0-03[收稿日期] 2020-05-14

20世紀50年代以來，以實驗為基礎的分子生物學作為生物學的前沿學科，其實驗課的教學內(nèi)容就十分重要。[1-3]以貴州大學為例，目前本科生雖然開展的分子生物學課程，但仍以一些基本的實驗操作為主，如動物基因組DNA提取，PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳、目的片段膠回收、大腸桿菌感受態(tài)的制備、目的基因連接與轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、植物葉片RNA的提取等，實驗項目較為簡單，造成本科生科研經(jīng)驗和科研能力不足等問題。高校大型精密儀器作為提升實驗教學質(zhì)量、培養(yǎng)高素質(zhì)人才，提高科研水平的重要保障條件[4-6]，在本科生實驗教學中增加大型精密儀器的使用，可讓本科生在掌握基礎實驗技術(shù)的同時，為今后的科研提供較好的學習平臺。目前為了提升本科生的科研技能，貴州大學雖然開展了本科SRT項目設計、大學生創(chuàng)業(yè)創(chuàng)新項目和實驗室設備管理處開放項目[7]，但只受益于部分本科生，大型精密儀器在本科實驗中尚未普及。

流式細胞儀（flow cytometer，F(xiàn)CM）作為大型精密儀器，能對處在直線、快速、流動狀態(tài)中的單個細胞或生物顆粒進行分析及精確分選，目前已廣泛應用于分子生物學和臨床檢驗等領域[8-11]。因此，在本科實驗教學中加入流式細胞儀的掌握，除了能夠提高大型精密儀器的使用效率，同時讓更多的本科生能夠有機會熟悉和掌握大型精密儀器的原理、方法和操作，提升學生的科研競爭力。

目前貴州大學農(nóng)業(yè)生物工程研究院通過建設，已擁有了能夠面向校內(nèi)外科研人員的生物科學大型儀器共享平臺[12]。目前該平臺主要開展了對外分析測試服務，針對生物學學科教學主要是以參觀教學為主。我院流式細胞儀型號為BDFACS Aria Ⅱ（分析/分選型），除用于藥學相關(guān)研究外，還在本校的實驗室設備管理處開放項目資助下，結(jié)合理論課向部分本科生開放細胞凋亡、細胞周期以及黏蛋白13（mucin13，MUC13）與產(chǎn)腸毒素大腸桿菌F4ac型的結(jié)合實驗，取得了較好的實驗效果。為了能夠讓更多的本科生了解流式細胞術(shù)，計劃在本科生“分子生物學”課程實驗教學中增加相關(guān)實驗。

一、流式細胞儀的結(jié)構(gòu)和工作原理

流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)主要包括以下幾個部分：（1）光學系統(tǒng)。由于流式細胞儀器主要是通過對光信號的采集和檢測來對樣品進行分析的，因此光學系統(tǒng)在流式細胞儀中有著最為重要的作用。它由激發(fā)光源和若干組透鏡、濾光片和分光鏡等光學元件組成。（2）電子系統(tǒng)。電子系統(tǒng)作為流式細胞儀的大腦，主要負責將探測器產(chǎn)生的光電流信號進行數(shù)字化，處理信號并儲存相關(guān)數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析。該系統(tǒng)主要由光電轉(zhuǎn)換器件、放大器和信號處理電路組成。（3）液流系統(tǒng)。該系統(tǒng)是由鞘液系統(tǒng)和樣品流動系統(tǒng)組成，主要負責將測試樣本從樣品管轉(zhuǎn)移至流動室，在鞘液的作用下，得到準確的細胞熒光信息，然后樣品被分選出來（在細胞分選儀中）或移到廢液中。（4）數(shù)據(jù)系統(tǒng)。流式細胞儀的數(shù)據(jù)系統(tǒng)主要是通過計算機以及分析軟件保障儀器運行、數(shù)據(jù)的采集和分析。除上述固定基礎結(jié)構(gòu)外，具有分選功能的流式細胞儀還包括分選系統(tǒng)，該系統(tǒng)能根據(jù)某類細胞的特性，給這類細胞的液滴充以特定電荷，帶電荷的液滴進入偏轉(zhuǎn)板靜電場時發(fā)生向左偏轉(zhuǎn)或向右偏轉(zhuǎn)，落入固定的收集器內(nèi)，不帶電的液滴則直接進入到廢液槽中，從而達到獲得特定細胞的目的[13-15]。

二、實驗教學設計

以敵敵畏對人腎細胞凋亡及細胞周期的影響為研究對象，結(jié)合學校實際情況、實驗運行成本及操作難度、時間等因素，計劃在本科生《分子生物學》課程實驗教學中開展細胞凋亡檢測和細胞周期檢測2個實驗。

流式細胞儀的教學可分成理論教學和實驗操作兩個部分。理論教學部分主要以教師集中授課方式進行，教學內(nèi)容主要分為三個部分：（1）課堂講授流式細胞術(shù)的發(fā)展簡史及流式細胞儀的結(jié)構(gòu)和工作原理;（2）采取儀器現(xiàn)場觀摩、學生分組輪換的形式向?qū)W生闡述待測標本經(jīng)過儀器的各結(jié)構(gòu)的情況，將流式細胞儀的檢測原理拓展并貫穿至儀器的各個結(jié)構(gòu)中，使學生對流式細胞儀有個比較清晰的認識;（3）根據(jù)實驗指導向?qū)W生講授細胞凋亡檢測和細胞周期檢測實驗的原理、方法、步驟、注意事項及考查方式等[13]。實驗操作部分則以學生自主學習為主：首先在保障儀器對外服務的同時，采取現(xiàn)場教學的方式對學生進行儀器使用培訓;然后根據(jù)儀器使用情況及班級人數(shù)，按照分組進行細胞凋亡和細胞周期的檢測;最后分析實驗結(jié)果，完成實驗報告[6]。

三、實驗實操部分課程設計

（一）儀器使用培訓

儀器使用培訓的教學內(nèi)容主要包括4個方面：（1）演示開機程序：首先確認是否需要添加鞘液及傾倒廢液;然后逐一打開穩(wěn)壓電源、計算機、儀器主開關(guān)、激光光源控制器、控制軟件;最后強調(diào)開機過程中的注意事項。（2）運行儀器控制軟件，講解軟件的構(gòu)成和使用。（3）利用BD公司培訓用熒光微球，用單色和雙色實驗演示細胞凋亡（Annexin V-FITC/PI雙色）及細胞周期（PI單色）的分析檢測方法。（4）演示關(guān)機程序及強調(diào)日常維護的注意事項。

（二）實驗操作設計

1.實驗一：敵敵畏對人腎細胞凋亡的影響。制備293T人腎細胞懸液（1×106cells/mL）。向12孔細胞培養(yǎng)板板中加入1mL細胞懸液進行培養(yǎng)至貼壁（5%CO2、37℃）后，加入含有不同濃度敵敵畏（可由學生自行設計）的培養(yǎng)液處理1h。用胰蛋白酶消化細胞后收集于1.5mL的離心管中，低速短時離心后（1000r/min離心3min），加入PH7.5的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗2～3次。將清洗后的細胞制成單細胞懸液（1～5×106 cells/mL），根據(jù)細胞數(shù)量加入適量的Binding Buffer懸浮細胞（100～500μL）。根據(jù)試劑盒說明書，向制好的懸浮細胞中加入適量Annexin V-FITC混勻后，再加入適量Propidium Iodide（PI）混勻，反應5～15min（室溫避光）。所有樣品必須在1h內(nèi)進行檢測[16，17]。

2.實驗二：敵敵畏對人腎細胞周期的影響。取293T人腎細胞（濃度：1×106cells/mL;狀態(tài)：對數(shù)生長期）接種于12孔細胞培養(yǎng)板中。在5%CO2、37℃的條件下培養(yǎng)細胞貼壁后，向293T人腎細胞加入含有不同濃度敵敵畏（可由學生自行設計）的培養(yǎng)液。1h后，用胰蛋白酶處理并收集細胞。用PBS處理細胞后（2～3次），制成適當濃度的單細胞懸液。取3mL單細胞懸液，1000r/min離心3min，去除上清液后，逐滴加入預冷的無水乙醇1.5ml（乙醇終濃度為75%），-20℃固定過夜。取出固定后的樣品，低速離心去除上清液。用預冷的PBS重懸細胞后，低速離心收集細胞。加入RNaseA 150μL重懸細胞（需用PBS稀釋，濃度為250～500ug/ml）。最后加入150μL PI工作液，4℃避光染色30min，上機檢測[16]。

（三）結(jié)果與分析

1.實驗一：敵敵畏對人腎細胞凋亡的影響。在正常人腎細胞中，磷脂酰絲氨酸（PhosphatidyISerine，PS）通常只分散在細胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，經(jīng)過不同濃度敵敵畏處理后，人腎細胞就會發(fā)生不同程度凋亡。在細胞發(fā)生凋亡的早期，細胞膜中的PS會由細胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V作為Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白（分子量為35～36kD），能特異性結(jié)合PS，故可利用用異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標記后的Annexin V鑒別出發(fā)生早期凋亡的細胞。碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）作為一種核酸染料，不能透過完整的細胞膜，而在中晚期凋亡細胞或者死亡細胞中，細胞核能被透過細胞膜的PI染紅。因此通常在細胞凋亡試劑盒中，使用Annexin V與PI來檢測處于不同凋亡時期的細胞[11，12]。實驗操作及數(shù)據(jù)分析均有學生自己獨立完成。流式細胞儀檢測細胞凋亡的結(jié)果后，學生利用軟件所給的雙參點數(shù)圖（圖1）[12]，區(qū)分活細胞、早期凋亡細胞和死細胞，同時總結(jié)不同濃度敵敵畏處理人腎細胞后，細胞凋亡率、早期凋亡率、晚期凋亡率，分析敵敵畏對人腎細胞凋亡的影響。

2.實驗二：敵敵畏對人腎細胞周期的影響。在不同細胞周期狀態(tài)下，DNA的含量是不同的，其中G2/M期細胞的核酸含量是G0/G1期細胞的2倍。熒光染料PI可與雙鏈DNA分子特異性的結(jié)合，熒光強度的多少可以用來確定細胞中DNA的含量，從而明確細胞所處的周期狀態(tài)[16]。實驗操作及數(shù)據(jù)分析均有學生自己獨立完成。流式細胞儀檢測細胞周期的結(jié)果后，學生利用MODFIT軟件分析單參數(shù)直方圖（圖2），學會分析細胞周期圖，分析細胞周期各時期所占比例，從而明確不同濃度敵敵畏對人腎細胞周期的影響[17]。

四、結(jié)語

目前，流式細胞儀已在醫(yī)學、藥學、細胞生物學等課程的實驗教學中得到了應用，但在分子生物學課程中的實驗教學較少。隨著多學科交叉研究越來越廣泛，將流式細胞儀應用在分子生物學課程實驗教學中就顯得比較重要。將該實驗課引入到本科生的分子生物學實驗教學課程，在最大程度發(fā)揮學校大型儀器資源優(yōu)勢的同時，讓學生掌握基本實驗技能，提高學生科研分析能力。

參考文獻

[1]柏素花.分子生物學實驗教學改革的實踐與探討[J].科技信息（學術(shù)研究），2008（8）：110-111.

[2]李小潔，唐璟，童淑芬.本科生分子生物學實驗教改中存在的問題及對策[J].科技信息，2011（9）：188，412.

[3]崔銀秋，林鳳，逯家輝，等.建立與科研課題結(jié)合的分子生物學實驗教學新模式[J].實驗室研究與探索，2009，28（11）：109-111.

[4]許建峰.對高校大型儀器設備管理現(xiàn)狀分析與思考[J].實驗室科學，2012，15（4）：193-196.

[5]李建容，曾曉芳，趙德剛.自動嫁接機在高校實驗教學課程中的應用研究[J].中國多媒體與網(wǎng)絡教學學報（上旬刊），2019（9）： 28-29.

[6]吳安慶，聶晶，裴海龍，等.流式細胞儀在放射生物學實驗教學中的應用[J].實驗技術(shù)與管理，2017，34（1）：184-186，190.

[7]耿慧霞，王來，王強.流式細胞儀在生物學中的應用[J].生物學雜志，2005（4）：44-45，51.

[8]趙雷.17-DMAG對EGFR-TKI耐藥的非小細胞肺癌細胞株A549和H1975作用的體外研究[D].石家莊：河北醫(yī)科大學，2013.

[9]閻璐.H.pylori對人牙周膜成纖維細胞細胞增殖和細胞周期影響的研究[D].太原：山西醫(yī)科大學，2011.

[10]喬光，洪怡.大型儀器設備在本科實驗教學中使用問題的探討[J].實驗室科學，2017，20（4）：207-209.

[11]梁智輝，朱慧芬，陳九武.流式細胞術(shù)基本原理與實用技術(shù)[M].武漢：華中科技大學出版社，2008.

[12]王書奎，周振英.實用流式細胞術(shù)彩色圖譜[M].上海：第二軍醫(yī)大學出版社，2004.

[13]章海榮，韓玲，王萬銀，等.流式細胞儀在航海醫(yī)學實驗教學中的設計與應用[J].中國現(xiàn)代教育裝備，2015（17）：19-21.

[14]盧圣菲，冉雪琴，牛熙，等.印楝素對豬睪丸ST細胞的生長和基因表達的影響[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報，2019，27（4）：677-683.

[15]許亞楠，劉暢，張策，等.敵敵畏對腎細胞系293T增殖的影響[J].基因組學與應用生物學，2017，36（3）：1184-1188.

[16]江育瑩，包旭，李宏，等.化合物ZWF對A549細胞遷移、細胞周期和凋亡的作用[J].華西藥學雜志，2020，35（2）：167-170.

[17]劉華，張林西.流式細胞儀在細胞生物學實驗教學改革中的應用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2012，40（11）：6958-6959.

Discussion on the Application of Flow Cytometrer in the Experimental Teaching

of "Molecular Biology" for Undergraduates

NIU Xi1， LI Sheng1， QI Fen-fang1，2

（1. Institute of Agro-Bioengineering， Guizhou University， Guiyang， Guizhou 550025， China;

2. Zunyi Medical and Pharmaceutical College， Zunyi， Guizhou 563006， China）

Abstract： According to the characteristics of experimental teaching in Molecular Biology， an opinion was proposed that flow cytometrer was used to detect cell apoptosis and cell cycle in experimental teaching of "Molecular Biology" for undergraduates. These experiments are carried out in order to enrich the content of experimental courses and improve the utilization rate of instruments. Through the practice of these experiments， students can improve their experimental skills. The course also can lay a good foundation for the technology work and scientific research and design in the future.

Key words： flow cytometrer; Molecular Biology; experiment course