陳文娟 薛永耐

(1.重慶市開州區(qū)人民醫(yī)院麻醉科,重慶 405400)(2.武警重慶總隊(duì)醫(yī)院麻醉科,重慶 400061)

肺移植是治療終末期肺疾病的有效手段,缺血再灌注損傷(Ischemia-reperfusion injury,IRI)是肺移植術(shù)后常見的并發(fā)癥,是導(dǎo)致患者死亡的重要原因之一[1]。IRI是指組織器官缺血恢復(fù)血流后,不僅組織器官功能未恢復(fù),反而使缺血引起的功能、代謝障礙和結(jié)構(gòu)破壞進(jìn)一步加重,甚至出現(xiàn)不可逆情況。目前為止,IRI的發(fā)病機(jī)制尚未明了,可能與免疫炎癥、氧化應(yīng)激損傷、細(xì)胞凋亡和基因等因素有關(guān)[2]。氧化應(yīng)激在IRI中的作用是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。氧化應(yīng)激可以通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)變性、線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或死亡受體途徑等介導(dǎo)組織損傷[3]。七氟醚是臨床上常用的吸入性麻醉藥物,有研究顯示,七氟醚預(yù)處理可以緩解某些器官的IRI和移植后排斥反應(yīng),如肝臟和腎臟等[4-6]。七氟醚對(duì)IRI的保護(hù)作用與改善氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)[7]。七氟醚預(yù)處理是否能緩解肺移植后 IRI,既往報(bào)道較少。Yamada等[8]發(fā)現(xiàn),七氟醚預(yù)處理可以改善肺移植后原發(fā)性移植物功能障礙和急性排斥反應(yīng),并且明顯下調(diào)肺組織和血漿中白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)水平,提示七氟醚可能對(duì)肺移植后IRI有一定保護(hù)作用。本研究建立大鼠左肺原位移植模型,從凋亡和自噬兩方面探討七氟醚預(yù)處理對(duì)IRI的保護(hù)作用,及對(duì)肺組織和血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響,旨在為七氟醚在肺移植中的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

30只雄性SD大鼠購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為 SCXK(京)2006-2009。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境為溫度(22±2)℃、相對(duì)濕度(50±10)%、明暗周期12 h/12 h,自由攝食和飲水。其中12只大鼠作為肺臟提供用鼠(6只的肺臟提供給B組,6只的肺臟提供給C組),剩余18只大鼠依據(jù)隨機(jī)數(shù)字的方法分為A組(僅開胸,不做肺部移植)、B組(肺部移植)和C組(七氟醚預(yù)處理+肺部移植),每組均為6只。

1.2 試劑

戊巴比妥鈉(上海斯信生物科技有限公司),低鉀右旋糖酐溶液(北京普博斯生物科技有限公司),七氟醚(日本Maruishi公司),HE染色試劑盒(武漢博士德生物科技有限公司),碘化丙啶PI染色液(美國(guó) Sigma公司),免疫組化 SP試劑盒(美國(guó)Inventrigen公司),兔抗 LC3-Ⅱ抗體和兔抗 LC3-Ⅰ抗體(美國(guó)Sigma公司),ELISA試劑盒(武漢博士德生物科技有限公司)。

1.3 原位左肺移植及七氟醚預(yù)處理

1.3.1 肺臟提供用鼠的左肺摘除:將計(jì)劃提供C組肺臟的6只大鼠置于自制密閉麻醉箱(20 cm×12 cm×10 cm)中,暴露于1.5%七氟醚和50%氧氣中,持續(xù)30 min[8];將計(jì)劃提供B組的6只大鼠暴露于50%氧氣中30 m in。之后將全部大鼠進(jìn)行腹腔1%戊巴比妥(40 mg/kg體質(zhì)量)注射,完成麻醉。固定大鼠后切開氣管,連接呼吸機(jī)(型號(hào)R415,深圳瑞沃德生命科技有限公司生產(chǎn);頻率70次/min,潮氣量10 mL/kg)。將左側(cè)胸腔切開,游離左肺動(dòng)脈、肺靜脈和支氣管。自右心室流出道插入導(dǎo)管至左肺動(dòng)脈開口,低壓灌注15 mL低鉀右旋糖酐溶液,灌注完畢后,將供肺取出進(jìn)行套管,順序?yàn)榉蝿?dòng)脈、肺靜脈、支氣管。用無(wú)菌注射器洗凈支氣管中的液體,然后充氣使其處于半膨脹狀態(tài),隨后用動(dòng)脈夾夾住。用濕紗布包裹供肺,放入4℃的低鉀右旋糖酐溶液中保存。供肺熱缺血時(shí)間為2～3 min,總?cè)毖獣r(shí)間為1 h左右。

1.3.2 B組與C組大鼠的左肺移植:B組與C組大鼠麻醉和氣管插管過(guò)程與肺臟提供大鼠相同。將大鼠開胸后暴露肺門,向近心端和遠(yuǎn)心端游離支氣管、肺動(dòng)脈和肺靜脈。從支氣管和肺靜脈間穿入2根7號(hào)絲線,把左肺向外牽拉,于近心端先結(jié)扎支氣管和肺動(dòng)脈,隨后結(jié)扎肺靜脈。從遠(yuǎn)心端切除左側(cè)肺臟并帶出肺門結(jié)構(gòu)。用連續(xù)外翻褥式縫合法吻合支氣管膜部、肺動(dòng)脈和肺靜脈,進(jìn)行左肺原位移植[9]。A組大鼠僅作開胸。本研究所有大鼠術(shù)后均存活。

移植成功的標(biāo)準(zhǔn)為:肺部充氣和彈性回縮良好,呈粉紅色,血管吻合口未見滲血,并且氣管無(wú)漏氣[10]。等待移植肺完全擴(kuò)張后,用無(wú)菌棉簽將其回納入胸腔,給予持續(xù)2 cm H2O的呼氣末正壓,以防止肺不張。再灌注后2 h放血處死 A、B、C組的全部大鼠,收集全部大鼠的股動(dòng)脈血,收集A組大鼠的左肺以及B組、C組大鼠的移植肺。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 動(dòng)脈血?dú)夥治?用ABL90 FLEX血?dú)夥治鰞x(上海生科儀器有限公司)分析動(dòng)脈血氧合指數(shù)(PaO2/FiO2)、肺內(nèi)分流率(Qs/Qt)。取上1/3肺組織,用濾紙吸干表面液體,稱取濕質(zhì)量。隨后置入80℃烤箱中,48 h后稱干質(zhì)量,計(jì)算肺濕干比。

1.4.2 移植肺組織病理學(xué)觀察:將中間1/3肺組織置于甲醛溶液中固定,用石蠟包埋,切片,隨后進(jìn)行HE染色。用CX43顯微鏡(日本奧林巴斯公司)觀察肺泡出血、水腫等情況。根據(jù)肺泡觀察結(jié)果進(jìn)行評(píng)分:1分為無(wú)損傷;2分為損傷25%;3分為損傷50%;4分為損傷75%;5分為彌漫性損傷[11]。

1.4.3 碘化丙啶染色觀察肺組織細(xì)胞凋亡:取肺組織切片,脫蠟、水化,抗原修復(fù)后用BSA封閉。用碘化丙啶(PI,紅色,50μg/mL)及 4,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI,藍(lán)色,50μg/mL)染色 5 min,甘油封片后顯微鏡下觀察。PI標(biāo)記凋亡細(xì)胞,DAPI標(biāo)記細(xì)胞核。

1.4.4 免疫組化SP法檢測(cè)自噬蛋白Beclin-1水平:取肺組織切片,脫蠟、水化,抗原修復(fù)后用 BSA封閉。滴加一抗,4℃孵育過(guò)夜,PBS洗去抗體,隨后加入二抗,溫室孵育 15 min,加入 SP液 37℃15 m in,進(jìn)行 DAB顯色,細(xì)胞質(zhì)有藍(lán)顆粒沉著為陽(yáng)性。

1.4.5 Western-blot檢測(cè)自噬蛋白 LC3-Ⅱ和 LC3-Ⅰ表達(dá)水平:取下1/3肺進(jìn)行組織勻漿,加入蛋白裂解液,冰上裂解 25 min后,15 000轉(zhuǎn)/m in離心15 min,將上清液轉(zhuǎn)移至EP管中。樣品中加入SDS緩沖液煮沸5 min使蛋白變性。SDS-PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,用5%脫脂奶粉封閉1 h,逐次孵育一抗和二抗。ECL顯色,以GAPDH作為內(nèi)參,計(jì)算目的蛋白條帶與GAPDH灰度比值。

1.4.6 ELISA檢測(cè)肺組織和血清氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白水平:用ELISA法檢測(cè)肺組織勻漿液和血清中超氧化物岐化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。呈正態(tài)分布計(jì)量數(shù)據(jù)用(±s)表示,3組呈正態(tài)分布計(jì)量數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析,兩兩比較用SNK-q法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組血?dú)夥治黾胺谓M織濕干比的比較

3組的 PaO2/FiO2、Qs/Qt、肺濕干比數(shù)據(jù)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=23.335,21.056,17.756,P＜0.05),PaO2/FiO2的數(shù)值為A組高于C組,C組高于B組(P＜0.05),Qs/Qt、肺濕干比的數(shù)值均為B組高于 C組,C組高于A組(P＜0.05),見表1。

表1 3組血?dú)夥治黾胺谓M織濕干比的比較(±s)Table 1 Comparison of blood gas analysis and lung tissue wet-dry ratio between the three groups(±s)

表1 3組血?dú)夥治黾胺谓M織濕干比的比較(±s)Table 1 Comparison of blood gas analysis and lung tissue wet-dry ratio between the three groups(±s)

注:與 A組比較,aP＜0.05;與 B組比較,bP＜0.05;與 C組比較,cP＜0.05Note:Compare with group A,aP＜0.05;Compare with group B,bP＜0.05;Compare with group C,cP＜0.05

組別 n PaO2/FiO2 Qs/Qt 肺濕干比A 組 6 408.32±28.36bc 8.01±0.62bc 4.12±0.28bcB 組 6 289.33±36.01ac 26.38±1.05ac 5.58±0.36acC 組 6 360.01±30.01ab 14.33±0.96ab 4.90±0.41ab

2.2 3組肺組織病理學(xué)變化及評(píng)分的比較

3組的HE染色肺病理?yè)p傷評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=15.323,P＜0.05),HE染色肺病理?yè)p傷評(píng)分為B組高于C組,C組高于 A組(P＜0.05),見表 2和圖 1。

表2 3組HE染色肺病理?yè)p傷評(píng)分(±s,分)Table 2 Pulmonary injury scores with HE staining in the three groups(±s,score)

表2 3組HE染色肺病理?yè)p傷評(píng)分(±s,分)Table 2 Pulmonary injury scores with HE staining in the three groups(±s,score)

注:與 A組比較,aP＜0.05;與 B組比較,bP＜0.05;與 C組比較,cP＜0.05Note:Compare with group A,aP＜0.05;Compare with group B,bP＜0.05;Compare with group C,cP＜0.05

組別 n 分值A(chǔ) 組 6 0.00±0.00bcB 組 6 4.86±0.12acC 組 6 3.67±0.20ab

圖1 3組肺組織HE染色(×200)注:a:A組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)清晰,肺泡壁薄且完整,未見出血或水腫;b:B組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)破壞,部分肺泡代償性肺氣腫,肺泡內(nèi)有滲出物,肺泡隔增厚,鏡下可見大量炎細(xì)胞浸潤(rùn);c:C組大鼠組織損傷比B組輕,肺泡隔較薄,炎細(xì)胞浸潤(rùn)也較少Fig.1 HE staining of lung tissue in three groups(×200)Note:a:rats in group A had clear alveolar structure,thin and complete alveolar walls,and no bleeding or edema was observed;b:the alveolar structure of rats in group B was damaged,partial alveolar compensatory emphysema was found,exudate was found inalveoli,alveolar septum was thickened,and a large number of inflammatory cells were seen under the microscope;c:rats in groupC suffered less tissue damage than those in group B,with thinner alveolar septum and less inflammatory cell infiltration

2.3 3組肺組織凋亡情況的比較

3組的肺組織細(xì)胞凋亡率數(shù)據(jù)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=18.866,P＜0.05),肺組織細(xì)胞凋亡率為B組高于C組,C組高于 A組(P＜0.05),見圖2和表3。

圖2 PI染色觀察肺組織細(xì)胞凋亡率(×200)注:a:A組大鼠;b:B組大鼠;c:C組大鼠;凋亡細(xì)胞染為紅色,細(xì)胞核染為藍(lán)色Fig.2 The apoptosis rate of lung tissue was observed by PI staining(×200)Note:a:rats in group A;b:rats in group B;c:rats in group C;The apoptotic cells were stained red and the nuclei were stained blue

表3 3組肺組織凋亡情況的比較(±s,%)Table 3 Comparison of lung tissue apoptosis in the three groups(±s,%)

表3 3組肺組織凋亡情況的比較(±s,%)Table 3 Comparison of lung tissue apoptosis in the three groups(±s,%)

注:與 A組比較,aP＜0.05;與 B組比較,bP＜0.05;與 C組比較,cP＜0.05Note:Compare with group A,aP＜0.05;Compare with group B,bP＜0.05;Compare with group C,cP＜0.05

組別 n 凋亡率A 組 6 4.12±0.09bcB 組 6 13.36±1.25acC 組 6 9.32±0.15ab

2.4 3組肺組織自噬情況的比較

3組的 Beclin-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ數(shù)據(jù)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=20.007,19.531,P＜0.05),Beclin-1 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的數(shù)值均為A組高于C組,C組高于B組(P＜0.05),見圖 3、圖 4和表 4。

圖3 肺組織Beclin-1陽(yáng)性免疫組化圖(×200)注:a:A組大鼠;b:B組大鼠;c:C組大鼠Fig.3 Immunohistochemicalmap of beclin-1 positive lung tissue(×200)Note:a:rats in group A;b:rats in group B;c:rats in group C

圖4 Western-blot檢測(cè)LC3-Ⅰ和 LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平Fig.4 Western b lot detection LC3-Ⅰand LC3-Ⅱprotein expression levels

表4 3組肺組織自噬情況的比較(±s)Table 4 Com parison of au tophagy of lung tissue in the three groups(±s)

表4 3組肺組織自噬情況的比較(±s)Table 4 Com parison of au tophagy of lung tissue in the three groups(±s)

注:與 A組比較,aP＜0.05;與 B組比較,bP＜0.05;與 C組比較,cP＜0.05Note:Compare with group A,aP＜0.05;Compare with group B,bP＜0.05;Compare with group C,cP＜0.05

組別 n Beclin-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) LC3-Ⅱ/LC3-ⅠA 組 6 963.21±102.01bc 0.21±0.05bcB 組 6 320.01±63.25ac 0.09±0.01acC 組 6 806.21±103.88ab 0.18±0.08ab

2.5 3組肺組織勻漿液中氧化應(yīng)激指標(biāo)水平的比較

3組肺組織勻漿液中的 SOD、GSH-Px、CAT、ROS、MDA數(shù)據(jù)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=15.336、22.253、14.536、15.097、25.337,P＜0.05),SOD、GSH-Px、CAT的數(shù)值為 A組高于 C組,C組高于B組(P＜0.05),ROS、MDA的數(shù)值均為B組高于C組,C組高于A組(P＜0.05),見表5。

表5 3組肺組織勻漿液中氧化應(yīng)激指標(biāo)水平的比較(±s)Table 5 Com parison of oxidative stress index levels in lung tissue homogenate between three groups(±s)

表5 3組肺組織勻漿液中氧化應(yīng)激指標(biāo)水平的比較(±s)Table 5 Com parison of oxidative stress index levels in lung tissue homogenate between three groups(±s)

注:與 A組比較,aP＜0.05;與 B組比較,bP＜0.05;與C組比較,cP＜0.05Note:Compare with group A,aP＜0.05;Compare with group B,bP＜0.05;Compare with group C,cP＜0.05

組別 n SOD/(U/mL) GSH-Px/(μmol/L) CAT/(U/mL) ROS/(U/mL) MDA/(nmol/L)A 組 6 16.12±1.01bc 26.20±2.69bc 22.33±4.85bc 15.26±2.87bc 22.68±3.63bcB 組 6 11.01±3.62ac 10.32±2.10ac 16.36±1.11ac 19.32±3.02ac 26.23±2.34acC 組 6 15.13±2.27ab 24.30±1.90ab 19.82±2.96ab 17.33±1.00ab 23.05±1.17ab

2.6 3組血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)水平的比較

3 組血清中的 SOD、GSH-Px、CAT、ROS、MDA 數(shù)據(jù)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=27.693、31.025、17.753、18.357、20.367,P＜0.05),SOD、GSH-Px、CAT的數(shù)值為 A組高于 C組,C組高于 B組(P＜0.05),ROS、MDA的數(shù)值均為B組高于C組,C組高于 A組(P＜0.05),見表6。

表6 3組血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)水平的比較(±s)Table 6 Comparison of serum Levels of oxidative stress in three groups(±s)

表6 3組血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)水平的比較(±s)Table 6 Comparison of serum Levels of oxidative stress in three groups(±s)

注:與 A組比較,aP＜0.05;與 B組比較,bP＜0.05;與C組比較,cP＜0.05Note:Compare with group A,aP＜0.05;Compare with group B,bP＜0.05;Compare with group C,cP＜0.05

組別 n SOD/(U/mL) GSH-Px/(μmol/L) CAT/(U/mL) ROS/(U/mL) MDA/(nmol/L)A 組 6 6.05±0.32bc 13.25±1.01bc 12.42±0.34bc 4.13±0.20bc 3.69±0.51bcB 組 6 4.03±0.20 ac 7.32±1.01acC 組 6 5.14±0.61ab 12.63±0.85ab 9.01±0.10ab 6.20±0.69ab 4.11±0.17abac 11.36±1.20ac 8.32±0.89ac 8.47±0.35

3 討論

IRI是一個(gè)極為復(fù)雜的過(guò)程,與免疫炎癥、氧化應(yīng)激損傷、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬等密切相關(guān)[2,12]。IRI導(dǎo)致的肺損傷一直是肺移植后早期發(fā)病和死亡的重要原因之一。嚴(yán)重的IRI會(huì)增加急性排斥反應(yīng)和移植后阻塞性支氣管炎的風(fēng)險(xiǎn),并且導(dǎo)致遠(yuǎn)期移植物的功能障礙[13]。本研究發(fā)現(xiàn)七氟醚預(yù)處理可以明顯改善PaO2/FiO2和Qs/Qt,緩解肺病理?yè)p傷,提示七氟醚預(yù)處理對(duì)肺移植IRI有一定保護(hù)作用。

七氟醚是臨床上常用的吸入性麻醉藥物,除了具有良好的麻醉效應(yīng)外,還能明顯改善多種器官的IRI,如心肌、大腦、肺、腎、肝[4-5]。七氟醚對(duì) IRI的保護(hù)作用可能與改善免疫炎癥和氧化應(yīng)激損傷、調(diào)控micro-RNA表達(dá)、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和自噬等有關(guān)[14-15]。本研究從凋亡和自噬兩方面探討七氟醚對(duì)肺移植后IRI的保護(hù)作用。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的形式之一,以核固縮、胞膜發(fā)泡和凋亡小體形成為特征,是維持機(jī)體自身穩(wěn)定的一種重要機(jī)制。IRI細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制尚未闡明,可能與氧自由基、鈣超載、細(xì)胞因子、線粒體等有關(guān)[16]。自噬在 IRI中的作用越來(lái)越受到重視,在缺血階段,自噬發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用,而在再灌注階段,自噬可能會(huì)加重細(xì)胞損傷甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡[17]。Liu等[18]建立了大鼠原位肺移植模型,并采用自噬抑制劑(3-甲基腺嘌呤)進(jìn)行干預(yù),結(jié)果證實(shí)自噬在肺移植IRI中有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn),七氟醚預(yù)處理可以改善移植肺組織的凋亡和自噬。在心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(H/R)損傷的研究中,Lu等[19]同樣發(fā)現(xiàn)七氟醚預(yù)處理可以改善H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和自噬,并且抑制Beclin-1/PI3KC3復(fù)合物的形成。

IRI可引起器官氧化應(yīng)激損傷。研究發(fā)現(xiàn),肺移植IRI可以使肺組織和血清ROS和MDA水平升高,SOD、GSH-Px和 CAT水平降低。七氟醚改善IRI誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷已有報(bào)道。與本研究結(jié)果類似的是,有研究發(fā)現(xiàn)七氟醚可以明顯緩解IRI時(shí)心肌組織SOD、GSH和MDA水平。有趣的是,氧化應(yīng)激損傷與凋亡和自噬有關(guān)。氧化應(yīng)激可通過(guò)線粒體、死亡受體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬[20]?？梢酝茰y(cè),七氟醚可能通過(guò)抗氧化應(yīng)激損傷改善凋亡和自噬,進(jìn)而發(fā)揮肺移植IRI保護(hù)作用。

本研究的局限性為:(1)僅檢測(cè)了七氟醚預(yù)處理對(duì)氧化應(yīng)激指標(biāo)水平的影響,未進(jìn)行深入的機(jī)制研究;(2)本研究只分析肺移植前七氟醚預(yù)處理對(duì)大鼠的影響,未分析后處理或預(yù)處理聯(lián)合后處理對(duì)大鼠的影響。

綜上所述,通過(guò)建立大鼠左肺原位移植再灌注肺部損傷模型,證實(shí)七氟醚預(yù)處理可以通過(guò)抗凋亡和自噬對(duì)肺移植IRI起到保護(hù)作用,七氟醚還可以改善移植肺組織和外周血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)的水平。由于七氟醚是臨床常用的吸入性麻醉藥物,也為臨床預(yù)防IRI提供了思路,未來(lái)需要進(jìn)一步深入研究。