鹿雙雙 榮 蓉 龐 帥 師曉萌 王昕昉 劉 哲 劉曉宇

(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心,北京 102206)

流行性感冒(簡(jiǎn)稱(chēng)流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病,其抗原性易變,具有高度的傳染性,每年可引起季節(jié)性流行,在學(xué)校、托幼機(jī)構(gòu)和養(yǎng)老院等人群聚集的場(chǎng)所可發(fā)生暴發(fā)疫情,是嚴(yán)重危害全球公眾健康的呼吸道傳染病,歷史上曾多次引起大規(guī)模的世界性大流行[1-3]。近年來(lái),不斷出現(xiàn)的新型流感病毒仍然在威脅著人類(lèi)的生命安全,2009年甲型H 1N1流感病毒在全世界范圍大暴發(fā),引起了較高的發(fā)病率及死亡率,對(duì)人類(lèi)健康造成了巨大威脅[4]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)估計(jì),每年季節(jié)性流感可導(dǎo)致全球300萬(wàn)～500萬(wàn)重癥病例,其中29萬(wàn)～65萬(wàn)死亡[5]。由于治療流感至今尚無(wú)特效藥,接種流感疫苗被認(rèn)為是預(yù)防和控制流感大流行的最經(jīng)濟(jì)且行之有效的方法。世界衛(wèi)生組織每年會(huì)根據(jù)全球流感流行情況,預(yù)測(cè)流感流行趨勢(shì),從而推薦適合本年度流感疫苗生產(chǎn)的毒株,目前市場(chǎng)上的人用流感疫苗主要是以雞胚為生產(chǎn)基質(zhì)制備的H1N1,H3N2和B型三價(jià)流感病毒裂解疫苗。為了驗(yàn)證季節(jié)性流感病毒裂解疫苗在動(dòng)物體內(nèi)的安全性和免疫原性,本研究參照《中國(guó)人民共和國(guó)藥典(2015版)》第三部《生物制品》中“通則1141方法”規(guī)定[6],使用小鼠動(dòng)物模型進(jìn)行安全性和免疫原性評(píng)價(jià)?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下:

1 材料與方法

1.1 疫苗

華蘭生物疫苗有限公司生產(chǎn)的流感病毒裂解疫苗(該公司已上市銷(xiāo)售疫苗),注射劑型,規(guī)格為0.5 mL/支,含流感病毒株血凝素為 15μg/型。國(guó)藥準(zhǔn)字:S20083016,生產(chǎn)批號(hào):201807B009。疫苗系用WHO推薦的甲型和乙型流感病毒毒株,分別為:A/Michigan/45/2015(H1N1)pdm09類(lèi)似株、A/Sigapore/INFIMH-16-0019/2016(H3N2)類(lèi)似株、B/Colorado/06/2017(Victoria系)類(lèi)似株。

1.2 流感病毒標(biāo)準(zhǔn)參考抗原及標(biāo)準(zhǔn)參考抗血清

標(biāo)準(zhǔn)參考抗原:A/Michigan/45/2015(H 1N1),A/Sigapore/INFIMH-16-0019/2016 ( H3N2 ),B/Colorado/06/2017;標(biāo)準(zhǔn)參考抗血清:雪貂抗A/Michigan/45/2015(H1N1)毒株血清,雪貂抗A/Sigapore/INFIMH-16-0019/2016(H 3N2)毒株血清,雪貂抗B/Colorado/06/2017毒株血清;均為國(guó)家流感中心制備并提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雌性健康BALB/c小鼠(6～8周齡,),購(gòu)自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2016-0002。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在接種疫苗前均未檢測(cè)出相關(guān)流感抗體。

1.4 主要試劑耗材

受體破壞酶(RDE),WHO提供;1%的火雞及豚鼠紅細(xì)胞懸液,國(guó)家流感中心制備并提供;磷酸鹽緩沖液(PBS),Gibco by life technology;96孔“V”型底微量板,CORNING。

1.5 小鼠異常毒性試驗(yàn)

參照《中國(guó)藥典》三部(2015版)方法進(jìn)行異常毒性檢查。BALB/c小鼠在屏障區(qū)適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后,每只小鼠稱(chēng)體質(zhì)量,體質(zhì)量符合藥典要求18～22 g。將小鼠隨機(jī)分為疫苗接種組和空白對(duì)照組,每組5只。疫苗接種組每只小鼠腹腔注射0.5 mL測(cè)試疫苗,空白對(duì)照組以相同的方式注射0.5 mL PBS。接種后連續(xù)觀察7 d,每天記錄動(dòng)物的活動(dòng)、飲食、體質(zhì)量及精神狀況,判斷是否有不良臨床反應(yīng)。

1.6 小鼠免疫原性試驗(yàn)

BALB/c小鼠在屏障區(qū)適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后,將小鼠隨機(jī)分為試驗(yàn)組和空白對(duì)照組,每組10只。試驗(yàn)組每只小鼠均肌肉注射0.1 mL測(cè)試疫苗,空白對(duì)照組每只小鼠注射0.1 mL PBS。接種后連續(xù)觀察49 d,每天記錄動(dòng)物的活動(dòng)、飲食及體質(zhì)量情況。分別于接種后 0、14、28、35 和 49 d,采用小鼠眼眶后靜脈叢方法采血并分離血清。

1.7 血清抗體檢測(cè)

用紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)(hemagglutination inhibition,HI)檢測(cè)血清中抗體水平[全國(guó)流感監(jiān)測(cè)技術(shù)指南(2017年版)],用于評(píng)估免疫原性。判定標(biāo)準(zhǔn):免疫前HI抗體效價(jià)＜1∶10,免疫后HI抗體效價(jià)≥1∶40判為陽(yáng)轉(zhuǎn);或免疫前HI抗體效價(jià)≥1∶40,免疫后HI抗體效價(jià)4倍或4倍以上增長(zhǎng)判為陽(yáng)轉(zhuǎn)[7]。

1.8 試驗(yàn)設(shè)施

中國(guó)疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心ABSL-2實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠接種疫苗的異常毒性試驗(yàn)

空白對(duì)照組和疫苗接種組小鼠在7 d觀察期內(nèi)均全部存活,小鼠外觀體征、行為活動(dòng)、呼吸、糞便等均未見(jiàn)異常。小鼠飲食、飲水及精神狀況均正常,未見(jiàn)明顯的不良臨床反應(yīng)。觀察期內(nèi)空白對(duì)照組和疫苗接種組小鼠體質(zhì)量均增加(圖1)。本試驗(yàn)表明,該疫苗的安全性良好,對(duì)小鼠的生長(zhǎng)無(wú)影響,符合《中國(guó)藥典》三部(2015版)判定標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 小鼠異常毒性試驗(yàn)的體質(zhì)量變化情況注:C為空白對(duì)照組,T為疫苗接種組Fig.1 The Changes in body mass of mice in toxicity testNote:C means the negative control group,T means the test group

2.2 小鼠免疫原性試驗(yàn)結(jié)果

本試驗(yàn)?zāi)M人體疫苗接種,只進(jìn)行一次免疫,觀察免疫后不同時(shí)間的抗體水平。免疫接種組結(jié)果:免疫前,所有小鼠的HI抗體滴度均為檢測(cè)水平以下＜10;免疫后14 d,4只小鼠血清抗A(H 1N1)pam09陽(yáng)性,2只小鼠抗 A(H3N2)陽(yáng)性,所有小鼠抗 B(Victoria系)均為陰性;免疫后28 d,所有小鼠血清抗A(H1N1)pam09和 A(H3N2)抗體均陽(yáng)性,B(Victoria系)抗體依然沒(méi)有明顯變化,均為陰性。免疫后35 d,小鼠血清抗體水平均繼續(xù)升高,達(dá)到峰值,抗A(H1N1)pam09和 A(H 3N2)抗體最高值達(dá)到了 1 ∶320;B(Victoria系)抗體水平明顯升高,7只小鼠抗體陽(yáng)性,最高 HI滴度達(dá)到了1∶80。免疫后49 d,小鼠血清抗體仍然維持在35 d的水平。對(duì)照組的所有小鼠血清抗體在觀察期間均為檢測(cè)水平以下＜10(表1)。本試驗(yàn)表明,該季節(jié)性流感病毒裂解疫苗對(duì)小鼠進(jìn)行一次性免疫,即能達(dá)到良好的免疫效果。

2.3 免疫后小鼠血清H I抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率分析

小鼠疫苗免疫后,28 d血清抗A(H1N1)pam09和A(H3N2)HI抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率均達(dá)到了100%,此時(shí)抗B(Victoria系)抗體水平?jīng)]有變化,為0%;免疫后35 d,B(Victoria系)的抗體水平明顯上升,陽(yáng)轉(zhuǎn)率達(dá)到70%。小鼠抗A(H1N1)pam09、A(H3N2)和 B(Victoria系)抗體水平均達(dá)到峰值。HI抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率分析表明,對(duì)該疫苗進(jìn)行一次接種,合格率達(dá)到了70%及以上(表2)。

表1 裂解疫苗免疫小鼠血清抗體檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of serum antibody test in mice immunized with spilt vaccine

表2 裂解疫苗免疫小鼠血清陽(yáng)轉(zhuǎn)率分析Table 2 The analysis of serum positive conversion rate in mice immunized with spilt vaccine

3 討論

3.1 疫苗免疫是必要的

流感的發(fā)生是因機(jī)體在遭受流感病毒感染后所引起的一種急性呼吸道感染癥狀,特點(diǎn)是“突然暴發(fā),迅速蔓延,發(fā)病率高,并發(fā)癥重”,嚴(yán)重危害人群健康。由于流感病毒基因多變和宿主多樣的生物學(xué)特性,不斷出現(xiàn)新的變異毒株,因此可在人群中廣泛傳播,造成反復(fù)感染和發(fā)病[8]。流感流行在人群中導(dǎo)致較重的健康和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),不同人群的流感疾病負(fù)擔(dān)差異較大,嬰幼兒、老年人和慢性基礎(chǔ)疾病患者等高危人群,患流感后出現(xiàn)嚴(yán)重疾病和死亡的風(fēng)險(xiǎn)較高。有報(bào)道表明,老年人和慢性疾病流感患者常引起肺炎、心肌炎、中耳炎及腦炎并發(fā)癥,老年流感患者的死亡率可高達(dá)7%[9]。在流感大流行期間,兒童受襲擊的可能性最大,大量研究表明,流感是導(dǎo)致兒童就診和住院的重要原因。據(jù)估計(jì),每年約有10%～15%的兒童因流感感染而需就診[10],尤其是＜1歲嬰兒就診率最高[11]。

中國(guó)是被世界公認(rèn)為流感的高發(fā)地區(qū),因此國(guó)內(nèi)流感流行動(dòng)態(tài)已引起WHO和世界各國(guó)的矚目。我國(guó)A型流感呈多樣化的空間模式和季節(jié)性特征:北緯33°以北的北方省份,呈冬季流行模式;北緯27°以南的最南方省份,呈夏季流行模式;而兩者之間的中緯度地區(qū),每年1～2月和 6～8月的雙周期高峰。B型流感在我國(guó)大部分地區(qū)呈單一冬季高發(fā)[12]。在中國(guó)北方城市和南方城市,流感相關(guān)呼吸和循環(huán)系統(tǒng)疾病超額死亡率年均分別為12.4例/10萬(wàn)人和8.8例/10萬(wàn)人[13],至目前為止,還未找到理想的防治流感的藥物,流感疫苗的免疫接種仍為當(dāng)今防治流感疾病發(fā)生和流行最有效的一種手段,每年接種流感疫苗可以顯著降低接種者罹患流感和發(fā)生嚴(yán)重并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。藥物預(yù)防不能代替疫苗接種,只能作為沒(méi)有接種疫苗或接種疫苗后尚未獲得免疫能力的重癥流感高危人群的緊急臨時(shí)預(yù)防措施。

3.2 疫苗是安全的

目前,流感滅活裂解疫苗是目前全世界最為廣泛使用的流感疫苗,在國(guó)內(nèi)外經(jīng)過(guò)多年的臨床驗(yàn)證,已證明具有較好的安全性。我國(guó)市場(chǎng)上最多的為三價(jià)流感病毒裂解疫苗,流感裂解疫苗可降低全病毒滅活疫苗的接種不良反應(yīng),并保持相對(duì)較高的免疫原性,不僅接種保護(hù)效果好,而且臨床不良反應(yīng)極少,適合各年齡段的人群接種[14]。本次觀察結(jié)果顯示,大劑量腹腔注射接種該批次疫苗,小鼠飲食、飲水及精神狀況均正常;疫苗接種后小鼠體質(zhì)量穩(wěn)定增長(zhǎng),說(shuō)明疫苗對(duì)小鼠生長(zhǎng)無(wú)影響。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果提示,本試驗(yàn)使用的該批次疫苗,異常毒性檢查結(jié)果符合《中國(guó)藥典》三部(2015版)相關(guān)規(guī)定,表明該批次流感病毒裂解疫苗是安全和可靠的,可以放心接種。

3.3 疫苗是有效的

流感疫苗免疫原性的評(píng)價(jià)指標(biāo)主要為病毒株特異性HI抗體水平和血清抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率,根據(jù)歐盟藥品評(píng)價(jià)局和美國(guó)食品藥品管理局的標(biāo)準(zhǔn)要求流感疫苗接種后:(1)HI抗體≥1 ∶40;(2)血清陽(yáng)轉(zhuǎn)率,即免疫接種前HI抗體＜1 ∶10,免疫后HI抗體≥1 ∶40,或免疫接種前HI抗體≥1∶10,免疫接種后HI抗體幾何平均滴度(geometric mean titers,GMT)增長(zhǎng)4倍及以上。小鼠免疫原性試驗(yàn)結(jié)果表明,免疫后28 d,所有小鼠血清抗 A(H1N1)pam09和 A(H3N2)抗體均陽(yáng)性(HI滴度為 40～160),抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率達(dá)到了100%;到35 d,B(Victoria系)的抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率也達(dá)到了70%,提示該三價(jià)流感裂解疫苗具有較好的免疫原性,免疫接種小鼠是有效的。

綜上所述,本研究使用的流感季節(jié)性裂解疫苗免疫小鼠,通過(guò)大劑量安全試驗(yàn),未見(jiàn)小鼠有不良臨床反應(yīng)及疫苗副反應(yīng),對(duì)生長(zhǎng)無(wú)影響,說(shuō)明疫苗安全性較好;效力試驗(yàn)表明,免疫后 28 d,A(H 1N1)pam09和A(H3N2)抗體合格率均可達(dá)到100%,免疫后35d,B(Victoria系)的抗體合格率均可達(dá)到70%,提示疫苗保護(hù)效果較好。Essen等[15]曾對(duì)50個(gè)發(fā)達(dá)國(guó)家和發(fā)展中國(guó)家進(jìn)行了流感疫苗使用概況的統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)全世界67%的流感疫苗被用于北美、西歐、澳大利亞、新西蘭等發(fā)達(dá)國(guó)家,而占世界人口絕大多數(shù)的發(fā)展中國(guó)家僅使用了33%的疫苗。目前我國(guó)每年接種流感疫苗約600萬(wàn)人份,按城鎮(zhèn)人口估算接種率為10‰,接種率非常低,尚未形成有效的流感免疫屏障。因此,減少感染流感的機(jī)會(huì),防止流感大流行緊急事件的發(fā)生,普及流感疫苗的接種,積極推廣流感疫苗接種是十分必要的。