石家莊市中醫(yī)院脾胃科

孟 萍 南月敏△ 趙素賢△(石家莊 050051)

提要 目的：研究益氣活血方在CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型中抑制肝細(xì)胞凋亡、阻止肝纖維化進(jìn)展的作用及機(jī)制。方法：將27只Wistar大鼠隨機(jī)分為3組，模型組和益氣活血方治療組腹腔注射30%CCl4橄欖油溶液，對照組腹腔注射等量橄欖油。益氣活血方治療組以益氣活血方中藥配方顆粒劑溶液灌胃，另2組大鼠以0.9%氯化鈉溶液灌胃。HE、Masson染色觀察大鼠肝纖維化程度；肝組織凋亡相關(guān)基因FasL、Fas、Bax、Bcl-2、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3) mRNA表達(dá)以qRT-PCR檢測，蛋白表達(dá)以Western Blot檢測。結(jié)果：模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，纖維組織增生形成纖維間隔，并可見假小葉，伴隨FasL、Fas、caspase-3mRNA及Bax mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)，Bcl-2mRNA及蛋白表達(dá)下調(diào)，與對照組比較差異有非常顯著性(P均<0.01)。應(yīng)用益氣活血方肝纖維化明顯減輕，F(xiàn)asL、Fas、caspase-3mRNA和Bax mRNA及蛋白表達(dá)明顯抑制，Bcl-2mRNA及蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P均<0.05)。結(jié)論：益氣活血方可通過抑制肝細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗炎抗肝纖維化作用。

肝纖維化指肝臟細(xì)胞外基質(zhì)過量堆積致肝組織正常結(jié)構(gòu)功能發(fā)生異常改變的嚴(yán)重病理過程。肝細(xì)胞凋亡是多種肝臟疾病的共同病理表現(xiàn)，新近研究發(fā)現(xiàn)，[1]伴隨肝損傷而產(chǎn)生的凋亡可能對肝臟炎癥及纖維化產(chǎn)生一定影響，與肝纖維化的持續(xù)進(jìn)展相關(guān)。中藥有效成分有多途徑、多靶點及安全性高的特點，在肝纖維化治療中具有明顯的優(yōu)勢。研究證實，益氣活血方可調(diào)節(jié)肝細(xì)胞自噬，減輕肝損傷，抑制肝星狀細(xì)胞(HSC)活化，促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、Ⅳ型膠原等降解，進(jìn)而阻止或逆轉(zhuǎn)肝纖維化。[2-3]然而，其對肝細(xì)胞凋亡的影響尚不十分清楚。本研究中，我們利用CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型，探討益氣活血方是否通過調(diào)節(jié)死亡受體途徑Fas/FasL及線粒體途徑Bcl-2/Bax的表達(dá)發(fā)揮抗肝纖維化作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑 選用27只雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量180～220 g，購買于河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。兔抗GAPDH抗體購自美國Affinity公司；兔抗Bcl-2、兔抗Bax、兔抗天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)抗體購自英國Abcam公司；山羊抗兔二抗購自美國ProteinTech公司。益氣活血自擬方以黃芪、丹參、云茯苓、白豆蔻、郁金等中藥配伍組成，由江陰天江藥業(yè)有限公司免煎顆粒劑制備沖劑。

1.2 動物模型建立及標(biāo)本采集 實驗大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組和益氣活血方治療組，每組9只。模型組和益氣活血方治療組大鼠腹腔注射30%CCl4橄欖油溶液(0.2 mL/100 g體質(zhì)量)，對照組大鼠以相同方法給予等量的橄欖油，2次/周。建模的同時，益氣活血方治療組大鼠以自擬益氣活血方中藥配方顆粒劑溶液灌胃(1 mL/100 g體質(zhì)量)，其他2組大鼠灌胃等量的0.9%氯化鈉溶液，1次/d。于第8周末處死實驗大鼠，取出肝臟，適量肝組織以4%中性甲醛溶液固定，余肝組織經(jīng)液氮快速冷凍，-80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 肝臟組織病理學(xué)檢查 固定后的肝組織經(jīng)透明、包埋、切片，行HE染色及Masson三重染色。于光鏡下觀察肝纖維化程度。每個標(biāo)本隨機(jī)選取5個視野，參照CCl4肝纖維化新型分期標(biāo)準(zhǔn)[4]，對肝纖維化進(jìn)行評估。

1.4 肝組織FasL、Fas、Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA表達(dá) 采用qRT-PCR法，各基因引物序列見表1。Trizol試劑提取肝組織總RNA，應(yīng)用PrimeScriptTMRT reagent Kit(日本Takara公司)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以GAPDH作為內(nèi)參照，應(yīng)用ABI 7500實時熒光定量PCR儀進(jìn)行cDNA擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20 μL。結(jié)果運用2-△△CT法進(jìn)行分析。詳見表1。

表1 qRT-PCR基因引物序列

1.5 肝組織Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白表達(dá) 取肝組織20 mg，加蛋白裂解液1 mL，4℃研磨成勻漿，經(jīng)離心分離制備蛋白樣品。使用BCA蛋白定量試劑盒定量，每組取總蛋白20 μg上樣，12%SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，濕轉(zhuǎn)恒流37 mA 40 min，將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入GAPDH(1∶10 000)、Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、caspase-3(1∶1 000)抗體，4℃孵育過夜。充分洗滌，分別加入辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗大鼠第二抗體(1∶20 000)，室溫孵育1 h，充分洗滌后，發(fā)光、顯影、定影、曝光、掃描，以GAPDH為內(nèi)參照。用掃描儀將硝酸纖維素膜上的蛋白條帶掃描至計算機(jī)，應(yīng)用Quantity One軟件分析條帶灰度。目的蛋白灰度值與內(nèi)參照蛋白灰度值的比值即為目的蛋白表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)處理應(yīng)用SPSS16.0軟件。多組間比較采用單因素方差分析，采用LSD-t檢驗進(jìn)行兩兩比較。P<0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 益氣活血方可減輕CCl4誘發(fā)的大鼠肝纖維化 如圖1所示，對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，未見纖維結(jié)締組織增生(S0)。模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，纖維組織增生形成纖維間隔，可見假小葉(S5.49±0.23)。應(yīng)用益氣活血方大鼠肝纖維化顯著改善，肝小葉結(jié)構(gòu)基本存在(S3.64±0.41)，與模型組相比，差異有非常顯著性(P<0.001)，見圖2。

注： A HE染色結(jié)果(×200)；B Masson染色結(jié)果(×200)。

圖2 肝纖維化模型組與益氣活血方治療組肝纖維化分期比較

2.2 實驗大鼠肝組織FasL、Fas mRNA表達(dá) 如圖3A所示，qRT-PCR檢測結(jié)果，肝纖維化模型組FasL、Fas mRNA表達(dá)與對照組相比均顯著增高(P值均<0.01)，應(yīng)用益氣活血方組大鼠肝組織FasL、Fas mRNA表達(dá)水平較模型組明顯降低(P值均<0.05)。

2.3 實驗大鼠肝組織Bax、Bcl-2mRNA及蛋白表達(dá) 如圖3(B、C、D)所示，qRT-PCR及Western blot檢測結(jié)果，肝纖維化模型組大鼠肝組織Bax mRNA和蛋白表達(dá)與對照組相比均明顯增加，而Bcl-2mRNA和蛋白表達(dá)明顯減少(P值均<0.01)；使用益氣活血方干預(yù)，Bax mRNA和蛋白表達(dá)較模型組明顯下調(diào)，而Bcl-2mRNA及蛋白表達(dá)較模型組明顯上調(diào)(P值均<0.05)。

2.4 實驗大鼠肝組織caspase-3mRNA及蛋白表達(dá) 如圖3(B、C、D)所示，肝纖維化模型組caspase-3mRNA表達(dá)明顯高于對照組(P<0.001)，應(yīng)用益氣活血方組較模型組明顯降低(P<0.01)。Western blot結(jié)果顯示，caspase-3蛋白表達(dá)各組間無明顯差異(P>0.05)。

3 討論

肝纖維化是肌體對慢性肝損傷的一種修復(fù)愈合反應(yīng)，是各種肝損傷的共有病理過程。注射CCl4為建立肝纖維化模型經(jīng)典方法，廣泛應(yīng)用于防治肝纖維化藥物篩選及其作用機(jī)制的研究。本研究通過復(fù)制經(jīng)典的CCl4動物模型[5]，注射8周后觀察發(fā)現(xiàn)，隨著CCl4應(yīng)用，大鼠肝組織纖維結(jié)締組織增生明顯，纖維化分期達(dá)(S5.49±0.23)，說明肝纖維化大鼠模型制備成功。

肝纖維化多屬中醫(yī)“積聚”“臌脹”等范疇。中藥組方在臨床上應(yīng)用于肝臟疾病的預(yù)防及治療，可起到調(diào)節(jié)免疫，保護(hù)肝臟，逆轉(zhuǎn)肝纖維化等作用。益氣活血方由黃芪、丹參、云茯苓、白豆蔻、郁金組方而成。方中黃芪為君藥，具有補氣升陽、益衛(wèi)固表、利水退腫功效，可促進(jìn)HSC凋亡，降低膠原沉積，推動膠原降解，降低TGF-β1的含量，且抗炎、免疫調(diào)節(jié)及抗氧化，有效抗肝纖維化。[6]丹參活血祛瘀、涼血安神，可抑制靜止HSC活化，并增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞的活化以清除活化的HSC，下調(diào)肝組織TGF-β表達(dá)。[7-8]云茯苓利水滲濕、健脾，可對抗自由基、抑制肌體的脂質(zhì)過氧化。[9]白豆蔻可化濕行氣、溫中止嘔，調(diào)節(jié)TGF-β表達(dá)，抑制細(xì)胞外基質(zhì)的合成，緩解肝纖維化程度。[10]郁金具有活血止痛、行氣解郁、利膽退黃的功效，可改善肝功能，減輕肝組織炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)，調(diào)節(jié)肝細(xì)胞免疫，并能阻止肝細(xì)胞凋亡。[11-12]本研究在應(yīng)用CCl4造模的同時予益氣活血方灌胃進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示肝組織纖維組織增生減少，纖維化分期降至(S3.64±0.41)，提示益氣活血方可減少膠原組織沉積，阻止并逆轉(zhuǎn)肝纖維化。

注：A FasL、Fas mRNA水平變化；B Bax、Bcl-2及caspase-3 mRNA水平變化；C、D Bax、Bcl-2及caspase-3蛋白表達(dá)變化。

研究發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞凋亡在肝纖維化的形成和發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，凋亡肝細(xì)胞誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、HSC及Kupffe細(xì)胞吞噬凋亡小體，致使促纖維化因子分泌增多并激活HSC，引起肝纖維化。[13]為了進(jìn)一步明確益氣活血方緩解肝纖維化的分子機(jī)制，本研究觀察了不同組別大鼠肝組織凋亡通路因子的表達(dá)變化。研究結(jié)果顯示，經(jīng)CCl4注射8周的肝纖維化模型組FasL、Fas表達(dá)明顯上調(diào)，應(yīng)用益氣活血方干預(yù)，可明顯抑制FasL、Fas的表達(dá)，表明肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展與FasL、Fas的表達(dá)及其誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡有關(guān)。Fas是細(xì)胞膜表面受體蛋白，其細(xì)胞內(nèi)區(qū)傳導(dǎo)“死亡信號”的結(jié)構(gòu)域與FasL結(jié)合而活化，誘導(dǎo)下游內(nèi)在及外在細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘發(fā)肝細(xì)胞凋亡而致肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。

線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑主要受Bcl-2家族調(diào)控，Bcl-2和Bax分別為家族中抗凋亡和促凋亡的調(diào)控基因。肝細(xì)胞發(fā)生凋亡時，Bax可破壞線粒體膜的完整性，使線粒體膜電位降低，細(xì)胞色素C釋放增加，進(jìn)而與凋亡蛋白酶活化因子-1結(jié)合激活caspase-9前體，然后激活caspase-3等，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；[14-15]而Bcl-2則在線粒體外膜發(fā)揮作用，以維持膜的完整性。[16]Mitchell[17]等應(yīng)用Bcl-2轉(zhuǎn)基因小鼠肝纖維化模型，發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞Bcl-2過度表達(dá)在肝損傷早期可對抗肝損傷，其機(jī)制可能與減輕線粒體功能障礙及脂質(zhì)過氧化有關(guān)。本研究結(jié)果提示，Bax在肝纖維化模型組可顯著上調(diào)，而Bcl-2明顯下降，經(jīng)益氣活血方干預(yù)后，Bax的表達(dá)明顯降低，Bcl-2有所升高，說明益氣活血方可阻止肝細(xì)胞凋亡，減輕肝損傷。

caspase家族是一種半胱氨酸蛋白酶，正常情況下，caspase-3以無活性的酶原形式存在于細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)作為傳感器的細(xì)胞表面死亡受體Fas接受由死亡配體FasL發(fā)出的死亡信號，使Fas激活，并傳遞到細(xì)胞內(nèi)，激活caspase家族成員，借助凋亡信號結(jié)構(gòu)域(死亡效應(yīng)域、caspase“募集”結(jié)構(gòu)域)導(dǎo)致caspase成員相繼激活，最終使caspase-3激活，進(jìn)而降解特定的靶蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。[18]caspase-3是死亡受體通路、線粒體通路及其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路的匯聚點，是凋亡過程的中心環(huán)節(jié)和關(guān)鍵執(zhí)行者。[19]本研究發(fā)現(xiàn)，模型組caspase-3mRNA的表達(dá)較對照組明顯上調(diào)，益氣活血方干預(yù)后caspase-3表達(dá)減少，表明由于Fas的激活，進(jìn)一步通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活caspase-3，與疾病的進(jìn)展密切相關(guān)，隨著纖維化的形成而表達(dá)增強(qiáng)，促使細(xì)胞凋亡。研究證實，在大鼠模型中應(yīng)用caspase阻滯劑可抑制肝細(xì)胞凋亡，明顯減輕肝纖維化。[20]

筆者研究發(fā)現(xiàn)，益氣活血方可抑制CCl4導(dǎo)致的肝細(xì)胞凋亡，阻止肝纖維化進(jìn)展，其可能的機(jī)制為：CCl4誘導(dǎo)可產(chǎn)生大量的自由基，在細(xì)胞膜上發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，生成氧自由基增多，激活FasL/Fas系統(tǒng)，進(jìn)一步激活caspase家族中的caspase-3，形成蛋白酶促級聯(lián)反應(yīng)，激活核酸內(nèi)切酶，致DNA斷裂、染色體濃縮，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。而益氣活血方可對抗自由基，降低肝組織氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制FasL/Fas系統(tǒng)的激活，上調(diào)線粒體途徑Bcl-2/Bax比例，繼而抑制caspase-3的激活，從而抑制細(xì)胞凋亡。

綜上所述，益氣活血方對CCl4所致的大鼠肝損傷起到保護(hù)作用，其機(jī)制可能通過抑制肝細(xì)胞凋亡，有效阻止或延緩肝纖維化的形成。益氣活血方抗纖維化機(jī)制的研究結(jié)果為其在臨床的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。