剌浩亮，符兆英,2*

(1.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院；2.延安大學(xué)分子生物學(xué)與免疫學(xué)研究所，陜西 延安 716000)

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)是原核生物染色體DNA中的一種片段，由具有回文結(jié)構(gòu)的重復(fù)序列(repeats)和間隔序列(spacers)組成，Cas(CRISPR associated)基因與CRISPR片段緊密相鄰，CRISPR-Cas系統(tǒng)可見于約40%的細(xì)菌和約90%的古生菌，是原核生物的免疫系統(tǒng)，可抵抗噬菌體和質(zhì)粒等外來基因的入侵[1-2]。2012年，CRISPR-Cas系統(tǒng)被研究人員用于進(jìn)行真核基因編輯(genome editing)[3]。CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)是一種強(qiáng)有力的基因編輯工具，并有快速、簡便易行、節(jié)省經(jīng)費(fèi)、可操作對象廣等優(yōu)點(diǎn)；這一技術(shù)創(chuàng)立后，迅即被世界各國相關(guān)實(shí)驗(yàn)室紛紛采用，Science雜志于2015年初稱CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)為繼PCR以來生物醫(yī)學(xué)技術(shù)上一次新的突破或革命[4]。在CRISPR-Cas9基因編輯的基礎(chǔ)上，近幾年衍生出了幾種新技術(shù)。

1 CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)與發(fā)展歷史

1987年，Yoshizumi Ishino首次描述了大腸桿菌染色體DNA中成簇的重復(fù)序列，但完全不知道它們的功能[5]。2000年，通過計(jì)算機(jī)DNA序列分析，在其他細(xì)菌和古生菌中發(fā)現(xiàn)了類似的重復(fù)序列，被稱為SRSR(Short Regularly Spaced Repeats)。2002年，其他研究人員用基因序列分析軟件在更多的其他細(xì)菌和古生菌中發(fā)現(xiàn)了類似的重復(fù)序列，SRSR被更名為CRISPR；此外，與CRISPR相關(guān)的一組基因也被他們發(fā)現(xiàn)，這組基因被命名為Cas基因[6]。Cas基因編碼的蛋白質(zhì)為核酸酶或解旋酶，可以切割DNA，但是，CRISPR-Cas系統(tǒng)的功能仍然不明確。

2005年，三個研究小組各自獨(dú)立報道，一些CRISPR間隔序列與噬菌體DNA和細(xì)菌染色體外DNA(質(zhì)粒)具有同源性[7-8]。這些間隔序列片段可能是細(xì)菌在先前被病毒感染時獲得的。這一重要發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致了一個假說的提出：CRISPR-Cas系統(tǒng)可能在細(xì)菌體內(nèi)發(fā)揮適應(yīng)性免疫的作用[9]。當(dāng)時認(rèn)為，CRISPR間隔序列可以作為合成RNA的模板，細(xì)菌的CRISPR-Cas系統(tǒng)可能與真核生物的RNAi系統(tǒng)具有類似的作用。

2007年，加拿大拉瓦爾大學(xué)的Moineau研究小組和丹麥Danisco公司的研究人員發(fā)現(xiàn)，改變CRISPR間隔序列DNA可以改變嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus，屬乳酸菌)對噬菌體攻擊的抵抗力[10]，證實(shí)了CRISPR-Cas系統(tǒng)在細(xì)菌體內(nèi)發(fā)揮適應(yīng)性免疫作用的假說。這些研究人員發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌被噬菌體感染后，噬菌體來源的間隔序列可整合入受體菌CRISPR區(qū)域內(nèi)，這些細(xì)菌即具有了對同一種系的噬菌體感染的抵抗力；如果把間隔序列從CRISPR區(qū)域去掉，這種抵抗力就會喪失。他們的研究還顯示，Cas基因編碼切割RNA的核酸酶，細(xì)菌抗噬菌體免疫的發(fā)揮，至少需要有一個Cas基因的參與。

2012年，美國加利福尼亞大學(xué)伯克利分校的Jinek和Doudna等設(shè)計(jì)用一個(操作起來)比較簡單的CRISPR-Cas系統(tǒng)，即II型CRISPR-Cas系統(tǒng)，編輯基因(這個系統(tǒng)使用Cas9蛋白質(zhì))，創(chuàng)立了CRISPR-Cas9基因組編輯技術(shù)[11]。2013年以來，CRISPR-Cas9基因組編輯技術(shù)很快被其他實(shí)驗(yàn)室采用，用于編輯多種生物的基因組，在世界范圍內(nèi)掀起了一個用CRISPR-Cas9技術(shù)編輯基因的熱潮。

2 CRISPR-Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)

CRISPR-Cas系統(tǒng)有3種主要的型別，I型、II型和III型；3種型別的區(qū)分，主要在于Cas基因的不同。CRISPR-Cas系統(tǒng)的序列，從5′末端到3′末端，依次是Cas基因、前導(dǎo)序列和重復(fù)序列與間隔序列交替的CRISPR陣列。Cas基因編碼Cas蛋白質(zhì)，不同型別的CRISPR-Cas系統(tǒng)可有不同數(shù)量和不同種類的Cas基因，但所有型別的CRISPR-Cas系統(tǒng)均含有Cas1基因和Cas2基因；前導(dǎo)序列含有轉(zhuǎn)錄CRISPR片段的啟動子；重復(fù)序列含有回文(palindromic)序列，可以形成發(fā)夾式結(jié)構(gòu)；間隔序列是從入侵的噬菌體或質(zhì)粒DNA獲取的，所以各不相同，可以用于區(qū)分不同種屬的細(xì)菌。CRISPR座位或陣列的大小不等，重復(fù)序列可以是23-55bp，一般是28-37bp；間隔序列可以是21-72bp，一般是32-38bp。一個細(xì)菌細(xì)胞一般含1～2個CRISPR-Cas座位，但亦有19個座位和25個座位的報道[12]。

3 CRISPR-Cas系統(tǒng)的免疫防御機(jī)制

原核生物不斷遇到各種外源性基因比如噬菌體和質(zhì)粒DNA的侵襲，所以它們必須有一定的防御機(jī)制，必須能區(qū)分外源DNA與自身DNA，以保護(hù)他們免受噬菌體和質(zhì)粒的入侵，使它們能在相應(yīng)的環(huán)境中生存。和真核生物類似，原核生物也有固有性和獲得性/適應(yīng)性免疫或防御機(jī)制。固有性防御包括防止吸附、阻止DNA注入、使感染流產(chǎn)等，這些機(jī)制對防御噬菌體入侵有效；固有性防御還包括限制性核酸內(nèi)切酶系統(tǒng)，對抵御質(zhì)粒入侵有效。新近發(fā)現(xiàn)的CRISPR-Cas系統(tǒng)能夠提供一種有效的和特異性的適應(yīng)性或獲得性免疫機(jī)制，對抵御噬菌體入侵和質(zhì)粒入侵均有效[1]。

CRISPR-Cas系統(tǒng)的免疫防御機(jī)制分為兩個階段：間隔序列獲得階段(免疫力獲得階段)和干擾階段(免疫力執(zhí)行階段)。噬菌體首次入侵細(xì)菌后，細(xì)菌中的Cas核酸酶將噬菌體DNA的特定部位切割形成短的片段(原間隔序列)，原間隔序列整合入已有的CRISPR座位的5′末端(前導(dǎo)序列的3′末端側(cè))，形成一個新的間隔序列及相應(yīng)的重復(fù)序列，即原來的CRISPR座位增加了一個間隔序列和相應(yīng)的一個重復(fù)序列片段；以上為免疫力獲得階段。細(xì)菌遇到同一種系的噬菌體的再次入侵后，CRISPR重復(fù)序列和間隔序列轉(zhuǎn)錄出一條長的RNA分子，這條長的RNA鏈然后被切割為短的crRNAs(CRISPR RNAs)，特異性的crRNA間隔序列與入侵的噬菌體或質(zhì)粒DNA通過堿基互補(bǔ)特異性結(jié)合，然后通過Cas核酸酶切割破壞目標(biāo)DNA；這一階段為免疫力實(shí)現(xiàn)階段[2]。

不同型別的CRISPR-Cas系統(tǒng)的作用機(jī)制不完全相同，其區(qū)別主要在免疫力執(zhí)行階段。以下比較詳細(xì)地并分型別描述CRISPR-Cas系統(tǒng)的免疫防御作用機(jī)制。

3.1 免疫力獲得

噬菌體或質(zhì)粒侵入細(xì)菌細(xì)胞后，細(xì)菌細(xì)胞中的Cas1蛋白和Cas2蛋白在特定部位識別并切割外源性DNA并將其整合入已有的CRISPR序列。三個主要型別的CRISPR系統(tǒng)均有Cas1和Cas2，為細(xì)菌獲得間隔序列所必須；Cas1和Cas2變異后，細(xì)菌喪失獲得間隔序列的能力，但仍保留免疫應(yīng)答能力。Cas1和Cas2的作用機(jī)制尚不完全明了，但已知Cas1是金屬依賴酶，能識別DNA的特定序列并與之結(jié)合。Cas2具有ssRNA或dsDNA核酸內(nèi)切酶活性。Cas1和Cas2均能將外源性DNA剪切出一個片段并將其插入CRISPR陣列[6]。外源性DNA中被Cas1和Cas2識別和切割的序列稱原間隔序列(protospacer)，Cas1和Cas2能通過原間隔序列相鄰模體(protospacer adjacent motif,PAM)進(jìn)行特異性識別。分析發(fā)現(xiàn)，基于PAM的識別只對I型和II型CRISPR-Cas系統(tǒng)重要而對III型不重要。PAM是3～5個堿基對的DNA序列，位于CRISPR的3′末端并與其相鄰。Cas1和Cas2識別PAM后，在其5′末端附件剪切出原間隔序列，用的是Cas1蛋白所固有的“量尺(ruler)”機(jī)制，從而保證切割出的序列長度的規(guī)則性。不同型別的CRISPR系統(tǒng)的PAM序列的保守性不同，主要與Cas1和前導(dǎo)序列相關(guān)[7]。新的間隔序列一般在CRISPR陣列的5′末端(前導(dǎo)序列和已有的第一個重復(fù)序列/間隔序列之間)插入。在大腸桿菌的I-E型CRISPR-Cas系統(tǒng)，第一個直接重復(fù)序列被復(fù)制出一個拷貝，新的間隔序列在第一個直接重復(fù)序列和第二個直接重復(fù)序列之間插入。

3.2 免疫力執(zhí)行

免疫力的執(zhí)行可分為兩個階段：CRISPR-RNA(crRNA)的生物合成階段和外源性DNA降解破壞階段(免疫階段)。

3.2.1 crRNA的生物合成 CRISPR序列首先轉(zhuǎn)錄出一條長的RNA鏈，這條鏈經(jīng)切割加工后形成多個短的crRNA，每個crRNA片段含有一個完整的或不完整的間隔序列。3種類型的CRISPR序列切割加工形成crRNA的機(jī)制不同。在I-E型和I-F型CRISPR系統(tǒng)，Cas6e和Cas6f分別識別重復(fù)序列形成的發(fā)夾式結(jié)構(gòu)，并在雙鏈和單鏈RNA的交界處進(jìn)行切割，形成的crRNA從5′端至3′端依次是8 nt的重復(fù)序列、完整的間隔序列和重復(fù)序列的發(fā)夾式結(jié)構(gòu)。II型CRISPR系統(tǒng)首先合成與重復(fù)序列互補(bǔ)的一個RNA片段，叫做tracrRNA(trans-activating RNA)；tracrRNA與CRISPR轉(zhuǎn)錄物的重復(fù)序列以堿基互補(bǔ)結(jié)合形成雙鏈RNA，然后在RNase III的作用下形成前crRNA或不成熟crRNA，所形成的前crRNA從5′端至3′端依次是不完整的重復(fù)序列片段-完整的間隔序列-不完整的重復(fù)序列片段，前crRNA在3′端被進(jìn)一步切割，失去10 nt的間隔序列和不完整的重復(fù)序列片段，形成成熟的crRNA。在III型CRISPR系統(tǒng)，重復(fù)序列不形成發(fā)夾式結(jié)構(gòu)，而是包繞Cas6，Cas6在間隔序列和重復(fù)序列交界處上游8 nt的地方進(jìn)行切割形成前crRNA或不成熟crRNA，前crRNA從5′端至3′端依次是8 nt的重復(fù)序列-完整的間隔序列-比較長但不完整的重復(fù)序列，前crRNA在3′端被進(jìn)一步切割，形成成熟的crRNA[1-2]。

3.2.2 crRNA引導(dǎo)的Cas介導(dǎo)的外源性DNA降解破壞 在免疫階段(immunity stage)，crRNA與Cas形成復(fù)合體、crRNA識別靶分子上的互補(bǔ)序列并與之結(jié)合、Cas介導(dǎo)外源性DNA的降解破壞。3種類型的CRISPR序列切割加工形成crRNA的機(jī)制不同。在I型CRISPR系統(tǒng)，crRNA與5種Cas蛋白形成復(fù)合體，識別與crRNA互補(bǔ)的靶分子鏈上的PAM序列，crRNA序列與靶分子上的互補(bǔ)序列結(jié)合，引起crRNA-Cas復(fù)合體構(gòu)象改變，招募Cas3，導(dǎo)致DNA降解。II型CRISPR系統(tǒng)依賴多功能的Cas9發(fā)揮作用，其crRNA與單一的Cas9蛋白形成復(fù)合體，識別與crRNA同意義(same sense)的靶分子鏈上的PAM序列，然后由Cas9蛋白的核酸內(nèi)切酶活性切割降解靶分子DNA[1-2]。與I型CRISPR系統(tǒng)類似，III型CRISPR系統(tǒng)的crRNA亦與多種Cas蛋白(6種或7種)形成復(fù)合體，但與另外兩個型別的CRISPR系統(tǒng)不同，III型CRISPR系統(tǒng)的crRNA-Cas復(fù)合體可以靶向和降解RNA類的靶分子，如RNA噬菌體。

4 基于CRISPR-Cas的基因編輯技術(shù)

CRISPR-Cas基因組編輯技術(shù)用的是II型CRISPR系統(tǒng)，這個系統(tǒng)使用單一但多功能的Cas9蛋白質(zhì)，所以操作起來比使用蛋白復(fù)合體的I型CRISPR系統(tǒng)和III型CRISPR系統(tǒng)都簡單，而且高保真[13]。

CRISPR-Cas9基因組編輯技術(shù)通常利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，故該技術(shù)首先要構(gòu)建CRISPR-Cas9質(zhì)粒，CRISPR-Cas9質(zhì)粒必須含有crRNA、tracrRNA和Cas9基因，根據(jù)需要亦可含有DNA修復(fù)模板。一般用轉(zhuǎn)染方式將CRISPR-Cas9質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞，質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞后表達(dá)產(chǎn)生crRNA-tracrRNA和Cas9蛋白。一個或多個crRNA片段與一個tracrRNA片段一起構(gòu)成的一條鏈叫做sgRNA或gRNA(single guide RNA or guide RNA)，其中的tracrRNA一般呈發(fā)夾-環(huán)式結(jié)構(gòu)。gRNA和Cas9蛋白結(jié)合形成有活性的復(fù)合體，復(fù)合體中的crRNA可靶向引導(dǎo)該復(fù)合體到特異的宿主DNA序列(包括與crRNA互補(bǔ)的序列及其3′鄰近部位的PAM)，有活性的Cas9蛋白切割目標(biāo)DNA，形成單鏈缺口(single strand nicking)或雙鏈斷裂(double strand break,DSB)。DSB激活細(xì)胞的DSB修復(fù)功能，從而實(shí)現(xiàn)對基因的編輯[14]。

細(xì)胞主要有兩種修復(fù)DSB的機(jī)制：同源定向修復(fù)(homology directed repair,HDR)和非同源末端連接(non-homologous end joining,NHEJ)修復(fù)。在有同源DNA序列，如DNA修復(fù)模板存在時，可用HDR、否則用NHEJ修復(fù)。對基因編輯而言，NHEJ導(dǎo)致靶基因功能的喪失/敲除；而(在有DNA修復(fù)模板存在的情況下)HDR機(jī)制可將所需基因片段插入基因組DNA[15]。

CRISPR-Cas9基因組編輯技術(shù)精確有效、成本低、易于操作，讓許多科學(xué)家實(shí)現(xiàn)了基因操作的夢想，無論是在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域還是農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，成千上萬個實(shí)驗(yàn)室開始使用并應(yīng)用這一技術(shù)。雖然人們對這種技術(shù)亦有一些擔(dān)憂，特別是對人類生殖細(xì)胞和胚胎的基因編輯存在著爭議，但CRISPR-Cas9基因組編輯技術(shù)已經(jīng)在生物技術(shù)領(lǐng)域引起了暴風(fēng)驟雨般改變的事實(shí)是無人否認(rèn)的，這一技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展應(yīng)用，必將會在生命科學(xué)領(lǐng)域帶來更加令人矚目的成就。

5 從CRISPR-Cas9基因編輯衍生出的技術(shù)

近年，在CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)的基礎(chǔ)上衍生出了幾項(xiàng)新的技術(shù)，這些技術(shù)可以從轉(zhuǎn)錄水平沉默基因，可以編輯RNA或從轉(zhuǎn)錄后水平沉默mRNA，亦可以優(yōu)化對DNA基因的編輯。

5.1 CRISPRi基因沉默技術(shù)

在CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)的基礎(chǔ)上首先衍生出來的一項(xiàng)技術(shù)，叫做CRISPR干擾(CRISPR interference,CRISPRi)，該項(xiàng)技術(shù)屬于一種轉(zhuǎn)錄水平上的基因沉默技術(shù)[16]。CRISPRi技術(shù)用的仍然是CRISPR-Cas9系統(tǒng)，其基本原理與CRISPR-Cas9基因編輯類似，但是利用了沒有酶活性的Cas9(dCas9)蛋白(通過在Cas9基因的D10A和H840A兩處引入點(diǎn)突變)，所以當(dāng)gRNA將dCas9引導(dǎo)到目標(biāo)基因的特定序列時，其結(jié)果不是切割或破壞DNA序列，而是阻遏目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄，即沉默目標(biāo)基因[16]。CRISPRi主要是通過阻遏轉(zhuǎn)錄啟動或阻遏轉(zhuǎn)錄延伸而沉默基因。阻遏轉(zhuǎn)錄啟動可通過設(shè)計(jì)與啟動子區(qū)域互補(bǔ)的gRNA而實(shí)現(xiàn)；阻遏轉(zhuǎn)錄延伸可通過設(shè)計(jì)與外顯子區(qū)域互補(bǔ)的gRNA而實(shí)現(xiàn)(模板鏈和非模板鏈均可利用，但與非模板鏈互補(bǔ)的gRNA的阻遏效率更高)。CRISPRi的基因沉默效率在原核生物一般可以達(dá)到99%，在人類細(xì)胞可以達(dá)到90%[17]。有報道稱，若將Kruppel相關(guān)盒(KRAB)與dCas9進(jìn)行融合，則在人類細(xì)胞也能夠得到99%的基因沉默效率[18]。

5.2 CRISPR-Cas13基因編輯/沉默技術(shù)

2017年，麻省理工學(xué)院張鋒實(shí)驗(yàn)室利用2類VI型CRISPR-Cas系統(tǒng)的Cas13a(亦稱C2c2)具有核糖核酸酶活性、能夠切割RNA的特性，創(chuàng)立了CRISPR-Cas13技術(shù)[19]。該技術(shù)仍然利用gRNA，將Cas13a蛋白導(dǎo)向于目標(biāo)，但利用的是后者的RNA酶活性切割RNA或者用沒有酶活性的Cas13a蛋白抑制或干擾mRNA的翻譯，所以可以用于編輯或抑制RNA；如果將gRNA設(shè)計(jì)為靶向mRNA的，即可從轉(zhuǎn)錄后水平沉默基因[20]。CRISPR-Cas13技術(shù)與RNAi技術(shù)都可從轉(zhuǎn)錄后水平沉默基因，二者沉默基因的效率基本接近，但CRISPR-Cas13技術(shù)比RNAi技術(shù)具有特異性高的優(yōu)點(diǎn)[21]。

5.3 基于CRISPR-Cpf1的第二代基因編輯技術(shù)

由Doudna等于2012年創(chuàng)立的CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)可被稱為第一代CRISPR基因編輯技術(shù)。2015年，張鋒小組[22]利用Prevotella and Francisella菌的Cas蛋白Cpf1(CRISPR-associated endonuclease in Prevotella and Francisella 1)，屬2類CRISPR系統(tǒng)的V型，創(chuàng)立了CRISPR-Cpf1基因編輯技術(shù)，該技術(shù)被認(rèn)為是第二代的基于CRISPR的基因編輯技術(shù)，近兩年在國際上得到了廣泛的應(yīng)用[23]。和CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)相比，CRISPR-Cpf1基因編輯技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)[24]：(1)Cpf1只需一個RNA分子(crRNA)協(xié)助所以操作更簡單，而Cas9需要2個RNA分子協(xié)助，crRNA和tracrRNA；(2)Cpf1的分子量比Cas9小，其基因更容易被導(dǎo)入細(xì)胞故編輯成功率高；(3)Cpf1系統(tǒng)的PAM序列距離crRNA識別位點(diǎn)遠(yuǎn)，使編輯位置的選擇有更多的可選項(xiàng)；(4)Cpf1切割產(chǎn)生黏性末端，便于新的DNA序列插入(Cas9切割產(chǎn)生平端)。

6 結(jié)語

CRISPR相關(guān)基因編輯技術(shù)的創(chuàng)立，使人們能夠相對比較容易地修復(fù)基因錯誤或使某些基因失去功能即敲除這些基因，從而可以治療或預(yù)防疾病、改變或優(yōu)化生物性狀，在醫(yī)療、制藥、生命科學(xué)和農(nóng)林畜牧業(yè)等方面有著廣闊的應(yīng)用前景，但是基因編輯技術(shù)本身卻是一把“雙刃劍”，如果應(yīng)用不當(dāng)，可能會給人類社會和生態(tài)環(huán)境造成破壞或帶來災(zāi)難。應(yīng)進(jìn)一步加深對CRISPR基因編輯技術(shù)的認(rèn)識，對CRISPR基因編輯技術(shù)的應(yīng)用應(yīng)謹(jǐn)慎而合法。