陳進(jìn)寶 徐 可 邱艷艷 王海靜 吳文韜 吳宏磊 賈琳琳 李 煒 殷佩浩 曹亦軍

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院普外科，上海 200062)

結(jié)腸癌是臨床較為常見的消化道惡性腫瘤之一，據(jù)相關(guān)研究顯示其發(fā)病率與死亡率均位居前列[1]。目前，臨床對于結(jié)腸癌的治療是以外科手術(shù)為主，結(jié)合放化療、中藥治療及免疫治療的綜合性治療?；熓墙Y(jié)腸癌最常見的治療方案之一，但化療對患者身體的傷害導(dǎo)致其應(yīng)用有很大的局限性，且對患者造成一定的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此迫切需要尋求一種溫和有效的藥物治療方法。

中藥具有多靶點(diǎn)治療等特點(diǎn)，在抗腫瘤方面具有一定優(yōu)勢，可用于腫瘤進(jìn)展的多個(gè)時(shí)期。目前，越來越多的研究開始關(guān)注某些中藥的抗腫瘤作用[2]。蟾酥是中華大蟾蜍或黑框蟾蜍耳后腺及表皮腺體分泌物的干燥成分[3]，相關(guān)研究已經(jīng)證實(shí)蟾酥的相關(guān)活性成分的抗腫瘤作用，臨床用于治療肺癌、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤[4-5]。沙蟾毒精為蟾毒內(nèi)脂類成分之一，研究證實(shí)沙蟾毒精對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系PC-9具有明顯的抑制和促凋亡作用，并且這一作用可能是通過線粒體途徑誘導(dǎo)的[5]。此外，沙蟾毒精還可通過Bax-PGAM5L-Drp1復(fù)合物介導(dǎo)內(nèi)源性凋亡,抑制結(jié)直腸癌的生長和轉(zhuǎn)移[6]。自噬是細(xì)胞中重要的降解系統(tǒng)，其主要作用是將包裹的內(nèi)容物進(jìn)行降解，進(jìn)一步達(dá)到一些更新與內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用[7-8]。在腫瘤研究中自噬所起的作用尚不明確。有相關(guān)研究表明，細(xì)胞的自噬水平可由一些分子和蛋白質(zhì)(LC3、Beclin1、P62)在一定程度上反映與體現(xiàn)[9]。越來越多的研究表明，自噬可以為腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)以維持其生存，但同時(shí)自噬可能被過度激活，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡，從而為腫瘤的治療提供了新方法[10-11]。沙蟾毒精對腫瘤細(xì)胞自噬的作用仍不清楚，因此本研究通過體外實(shí)驗(yàn)研究沙蟾毒精對人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞和SW620細(xì)胞增殖和自噬的影響，對其可能的分子機(jī)制進(jìn)行初步探討，從而為沙蟾毒精用于抗腫瘤的治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 人結(jié)腸癌HCT116、SW620細(xì)胞株，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.2 藥品、試劑及耗材 沙蟾毒精,規(guī)格:每支20 mg,批號464-74-4，購自成都瑞芬思生物科技有限公司(稱取一定量的沙蟾毒精，根據(jù)分子量計(jì)算，使用二甲基亞砜溶解后加入滅菌雙蒸水，用槍頭輕柔混勻，配制成母液，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要稀釋為不同濃度)；青霉素/鏈霉素雙抗溶液、胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胰酶消化液(Trypsin-EDTA),購自美國Gibco公司；微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)抗體、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體、自噬相關(guān)蛋白(P62)抗體,購自英國Abcam公司；雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抗體、磷酸化雷帕霉素靶蛋白(P-mTOR)抗體、酵母Atg6同系物(Beclin-1)、B淋巴細(xì)胞瘤-xl(Bcl-xl)抗體，購自美國CST公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(CCK-8)(CK04-10000tests)，購自東仁化學(xué)科技(上海)有限公司；電致化學(xué)發(fā)光液(ECL)(WBKLS0500)，聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，購自美國Miliipore公司；凋亡抗體(Annexin V-FITC和PI-556547)，購自美國RD公司；蛋白裂解液RIPA(P0013B)，購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；3-甲基腺嘌呤(3-MA)，購自德國Sigama公司。

1.3 儀器 BioRad-680多功能酶標(biāo)儀,購自美國Bio-Rad公司；FACSCalibur流式細(xì)胞儀，購自美國BD公司；165-8001垂直電泳系統(tǒng)及170-3930轉(zhuǎn)印系統(tǒng),購自美國Bio-Rad公司；Gel-DocEQ化學(xué)發(fā)光成像儀,購自美國Bio-Rad公司；Leica Dmi1倒置顯微鏡，購自德國徠卡公司。HERAcell 240i CO2恒溫培養(yǎng)箱，購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞復(fù)蘇使用DMEM培養(yǎng)基，HCT116細(xì)胞復(fù)蘇使用RPMI1640培養(yǎng)基，兩者培養(yǎng)基中均含有1%青霉素/鏈霉素雙抗溶液、10%胎牛血清，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行恒溫培養(yǎng)(37 ℃，5%CO2)。待細(xì)胞生長至70%左右的對數(shù)生長期時(shí)，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，培養(yǎng)瓶中加入0.5～1 mL胰酶消化后，鏡下觀察消化狀態(tài)，加入培養(yǎng)基終止后收集液體至離心管，1 200 r/min離心5 min進(jìn)行傳代繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞經(jīng)過2次傳代后取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 觀察指標(biāo)及方法

1.5.1 CCK-8檢測細(xì)胞活力 2塊96孔板分別接種HCT116細(xì)胞和SW620細(xì)胞，100 μL/孔(約1.3×105個(gè)/mL)，第2 d貼壁后去除原培養(yǎng)液，2塊板分別加入含不同終濃度(0、25、50、100、200 nM)的沙蟾毒精培養(yǎng)液100 μL，將2塊96孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)不同時(shí)間(24、48、72 h)，同時(shí)設(shè)置空白對照孔(比色時(shí)主要用于空白孔調(diào)零)，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)平行樣本。加入CCK-8試劑配置液體，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1～2 h，通過酶標(biāo)儀測定進(jìn)行細(xì)胞活力的計(jì)算。

1.5.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 2塊6孔板中分別接種SW620細(xì)胞與HCT116細(xì)胞，2 mL/孔，細(xì)胞接種密度為2.5×105個(gè)/mL，6孔板各孔分別加入0、25、50、100 nM濃度的沙蟾毒精，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞在含不同濃度沙蟾毒精的細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h后，各孔PBS洗后滴加胰酶進(jìn)行消化，并用完全培養(yǎng)基進(jìn)行終止后收集細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，將上清吸出丟棄，加入2 mL PBS重懸，1 200 r/min離心5 min，加入2 mL PBS重懸轉(zhuǎn)移至流式細(xì)胞管，離心后將上清棄掉，彈勻細(xì)胞，加入流式抗體Annexin V-FITC和PI各5 μL，室溫用錫紙包裹進(jìn)行避光孵育15～20 min，加入PBS 2 mL，用槍頭輕輕混勻后，1 000 r/min離心5 min，離心結(jié)束后將上清去掉，加入PBS 500 μL重懸后上機(jī)，通過細(xì)胞流式儀檢測各處理?xiàng)l件下的細(xì)胞凋亡率。

1.5.3 倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 2塊6孔板中分別接種SW620細(xì)胞與HCT116細(xì)胞，2 mL/孔，細(xì)胞接種密度為2.5×105個(gè)/mL，分為空白對照組和沙蟾毒精干預(yù)組。待貼壁后沙蟾毒精干預(yù)組分別加入濃度為50 nM與100 nM沙蟾毒精培養(yǎng)液，分別繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，采用倒置相差顯微鏡觀察各組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。

1.5.4 蛋白免疫印跡法(Western Blotting，WB)檢測自噬與凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 將生長良好的HCT116細(xì)胞和SW620細(xì)胞分別接種于3塊6孔板，細(xì)胞計(jì)數(shù)為2.5×105個(gè)/mL，第2 d貼壁后去除原培養(yǎng)液，2塊板分別單獨(dú)加入含100 nM的沙蟾毒精培養(yǎng)液2 mL/孔，將2塊6孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。此外，再次按照上述的鋪板密度接種于2塊6孔板，分別加入含10 mM的3-MA試劑的培養(yǎng)液2 mL、含10 mM的3-MA+100 nM沙蟾毒精培養(yǎng)液2 mL及培養(yǎng)液(空白組)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。使用PBS對各孔細(xì)胞清洗2次，加入RIPA裂解液及蛋白酶抑制劑等提取各組蛋白，4 ℃，13 000 r/min離心25 min，然后吸取上清液，切勿吸到底部。每組蛋白濃度用BCA法進(jìn)行測定。金屬浴上蛋白變性10～15 min后，取蛋白20 μg上樣進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后通過濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到0.45 μm的PVDF膜上，在室溫下用配制的5%脫脂牛奶封閉1～2 h，加入一抗(根據(jù)各自說明書進(jìn)行稀釋)，4 ℃環(huán)境下孵育過夜。第2 d用TBST緩沖液洗膜，搖床上每次洗膜10 min，洗3次，加入相應(yīng)的二抗(根據(jù)各自說明書進(jìn)行不同比例稀釋)于室溫孵育1 h，搖床上每次洗膜10 min，洗3次，用ECL顯色，并在凝膠成像系統(tǒng)上成像與拍照。β-actin作為內(nèi)參，用ImageJ軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，如果數(shù)據(jù)符合正態(tài)性和方差齊性，采用單因素方差分析檢驗(yàn)，組間多重比較采用最小顯著差法(LSD)檢驗(yàn)；多樣本均數(shù)多因素比較采用析因設(shè)計(jì)方差分析；如果數(shù)據(jù)滿足正態(tài)性，但不滿足方差齊性，采用Welch檢驗(yàn)；如果數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)性和方差齊性，采用秩和檢驗(yàn)。標(biāo)準(zhǔn)為α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異極有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度沙蟾毒精對人結(jié)腸癌HCT116、SW620細(xì)胞凋亡的影響 見表1，封3圖1。

表1 不同濃度沙蟾毒精對人結(jié)腸癌HCT116、SW620細(xì)胞凋亡的影響

由表1可見，不同濃度(25、50、100 nM)的沙蟾毒精處理細(xì)胞48 h后，HCT116與SW620結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡率均有所增加(P<0.05，P<0.01)。

2.2 沙蟾毒精對人結(jié)腸癌HCT116、SW620細(xì)胞活力的影響 見表2。

表2 沙蟾毒精對人結(jié)腸癌HCT116、SW620細(xì)胞活力的影響

由表2可見，結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞與SW620細(xì)胞在不同濃度(0、25、50、100、200 nM)及不同時(shí)間(24、48、72 h)的沙蟾毒精處理后，沙蟾毒精以劑量依賴性及時(shí)間依賴性的方式抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖(P<0.05，P<0.01)。

2.3 沙蟾毒精對人結(jié)腸癌HCT116、SW620細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，僅加入培養(yǎng)液的空白對照組細(xì)胞生長狀態(tài)較佳，細(xì)胞與細(xì)胞之間呈現(xiàn)緊密連接的狀態(tài)。與空白對照組比較，50 nM、100 nM沙蟾毒精干預(yù)組HCT116細(xì)胞和SW620細(xì)胞增殖水平受到一定程度的抑制，細(xì)胞數(shù)量顯著減少，連接分散，各細(xì)胞之間間隙增大，一些細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變，形態(tài)不規(guī)則，并且貼壁能力有所下降(見封3，圖2)。

3.4 沙蟾毒精對人結(jié)腸癌HCT116、SW620細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響，見圖3、表3。

圖3 沙蟾毒精對人結(jié)腸癌HCT116、

表3 沙蟾毒精對人結(jié)腸癌HCT116、SW620細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

由表3可見，與0濃度比較，100 nM沙蟾毒精組HCT116、SW620細(xì)胞Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)升高(P<0.01)，P62、Bcl-xl、P-mTOR蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05),而總蛋白mTOR的表達(dá)水平無明顯改變(P>0.05)。

2.5 沙蟾毒精與3-MA聯(lián)合后對人結(jié)腸癌HCT116、SW620細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的影響，見圖4，表4。

圖4 沙蟾毒精與3-MA聯(lián)合后對人結(jié)腸癌HCT116、

表4 沙蟾毒精與3-MA聯(lián)合對人結(jié)腸癌HCT116、SW620細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的影響

由表4可見，與空白組比較，加入3-MA后LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，P62蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05，P<0.01)。與沙蟾毒精組比較，沙蟾毒精+3-MA組LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05，P<0.01)，P62蛋白表達(dá)水平升高(P<0.01)。

3 討 論

結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤之一，目前在中國男性和女性的發(fā)病率分別排名第4位及第3位。早期結(jié)腸癌一般通過手術(shù)治療，但較多的結(jié)腸癌患者就診時(shí)已處于中晚期，需進(jìn)行姑息治療，使得患者5年生存率明顯下降[12]?；熀头暖熥鳛橹委熃Y(jié)腸癌的重要手段，在其發(fā)揮控制與治療腫瘤的同時(shí)，也會(huì)對患者造成較為嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如骨髓抑制、免疫抑制等，一定程度上影響了患者的生活質(zhì)量水平[13-14]。中藥在抗腫瘤治療中具有一定優(yōu)勢，在治療腫瘤的過程中輔助中藥治療已成為一種趨勢[2]。

研究報(bào)道，從中藥蟾酥中提取的沙蟾毒精具有良好的抗腫瘤作用[14-15]。沙蟾毒精通過下調(diào)β-連環(huán)蛋白進(jìn)而抑制前列腺癌上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移，此外有研究表明沙蟾毒精可通過Noxa相關(guān)途徑誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡[15-16]。本研究結(jié)果顯示，沙蟾毒精可顯著抑制人結(jié)腸癌HCT116、SW620細(xì)胞的增殖，且呈劑量與時(shí)間依賴性，用藥后細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生一些變化。此外，沙蟾毒精還可促進(jìn)結(jié)腸癌HCT116、SW620細(xì)胞的凋亡，隨著濃度的遞增，凋亡細(xì)胞數(shù)量也隨之增加。作為抗凋亡蛋白之一的Bcl-xl,可形成異二聚體，從而阻止細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沙蟾毒精作用于人結(jié)腸癌HCT1116、SW620細(xì)胞后，Bcl-xl表達(dá)降低，表明其可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。

在應(yīng)激條件下，自噬首先被激活，自噬體隨后形成進(jìn)而與溶酶體結(jié)合導(dǎo)致自噬溶酶體的產(chǎn)生，進(jìn)而降解細(xì)胞內(nèi)的“貨物”，從而滿足細(xì)胞代謝和內(nèi)部環(huán)境穩(wěn)定性的需求等[17]。隨著對自噬相關(guān)研究的深入，自噬在肺癌的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮著越來越重要的作用[18]。此外也有研究表明，婦科惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與自噬的發(fā)生及改變密切相關(guān)[19]。在自噬發(fā)生的早期，適度的自噬能夠保護(hù)細(xì)胞免受外部損害并繼續(xù)存活，而當(dāng)外部環(huán)境較惡劣時(shí)，細(xì)胞過度自我吞噬時(shí)會(huì)造成自噬死亡。某些基因可調(diào)控細(xì)胞自噬過程，其中Beclin-1調(diào)節(jié)自噬過程中吞噬泡的形成，為檢測自噬的常用指標(biāo)之一[20-23]。LC3是參與自噬調(diào)節(jié)的另一個(gè)關(guān)鍵基因，發(fā)生自噬時(shí)，LC3-Ⅰ可轉(zhuǎn)變?yōu)長C3-Ⅱ，自噬泡的數(shù)量與LC3-Ⅱ的含量成正比。P62是一種多功能信號分子，由原癌基因C-myc編碼，隨著細(xì)胞自噬水平的不斷增高，P62會(huì)不斷被消耗；而自噬活性受到抑制時(shí)，P62會(huì)不斷積累,可在一定程度上用于評估細(xì)胞的自噬水平[24]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，沙蟾毒精能上調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)，同時(shí)下調(diào)P62蛋白表達(dá)。3-MA是一種自噬發(fā)生的抑制劑，能夠抑制自噬體的形成[25]。本研究結(jié)果證實(shí)，與沙蟾毒精單獨(dú)處理組比較，沙蟾毒精+3-MA聯(lián)用組的LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平下調(diào)，P62表達(dá)水平升高，說明沙蟾毒精誘導(dǎo)人結(jié)腸癌HCT116、SW620細(xì)胞發(fā)生的自噬能夠被3-MA逆轉(zhuǎn)。證實(shí)沙蟾毒精可以誘導(dǎo)HCT116、SW620細(xì)胞自噬，從而進(jìn)一步引發(fā)自噬性死亡，抑制細(xì)胞的增殖活力。越來越多的研究表明，中醫(yī)藥可以不同程度地影響細(xì)胞自噬的發(fā)生，但其相關(guān)機(jī)制仍不是非常清楚[26]。相關(guān)研究表明，自噬的發(fā)生涉及大量的基因表達(dá)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中mTOR途徑是調(diào)節(jié)自噬的經(jīng)典途徑，自噬的誘導(dǎo)與mTOR信號通路的抑制有一定的相關(guān)性；同時(shí)該通路與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展也密切相關(guān)[27-29]。mTOR激酶作為自噬的負(fù)調(diào)控因子之一，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)充足，mTOR可以通過抑制下游信號通路抑制自噬的發(fā)生。有研究指出，天然抗癌藥物可通過mTOR信號通路誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞及結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生自噬[30-31]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沙蟾毒精處理后降低了人結(jié)腸癌HCT116、SW620細(xì)胞P-mTOR表達(dá)水平，說明沙蟾毒精可誘導(dǎo)自噬發(fā)生，可能是通過mTOR信號通路發(fā)揮作用。

綜上所述，沙蟾毒精可誘導(dǎo)人結(jié)腸癌HCT116與SW620細(xì)胞發(fā)生自噬，從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖水平，發(fā)揮相應(yīng)的抑制腫瘤作用，其機(jī)制可能與沙蟾毒精抑制mTOR信號通路相關(guān)。