白旭東 孫曉娟 谷巖

【摘要】 目的：建立食品中羅丹明B的液相色譜-電噴霧質(zhì)譜檢測方法（UPLC-ESI-MS/MS）。方法：樣品經(jīng)酸化乙腈提取，正己烷去脂后，經(jīng)固相萃取小柱（MCX）凈化，富集后采用液相色譜-電噴霧質(zhì)譜進(jìn)行檢測，以正離子多反應(yīng)監(jiān)測模式測定，外標(biāo)定量。結(jié)果：羅丹明的線性范圍為2-50 ng/mL，加標(biāo)回收率為90.0%～110.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10.0%（n=6）;方法檢出限為1 ?g/kg。結(jié)論：該方法快速、準(zhǔn)確、靈敏，適合用于食品中羅丹明B的確證檢測。

【關(guān)鍵詞】 羅丹明B;液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀;固相萃取;食品;殘留量

【DOI編碼】 10.3969/j.issn.1674-4977.2020.05.022

Determination of Rhodamine B Residues in Feed by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

BAI Xu-dong，SUN Xiao-juan，GU Yan

（Liaoning Inspection，Examination & Certification Centre，Shenyang 110036，China）

Abstract： Objective To establish an analytical method for the detection of rhodamine B residues in feed. Methods After the samples were extracted by acidified acetonitrile，it was purified by solid phase extraction cartridge（MCX）after removal of fat，after enrichment，it was detected by a high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）. The positive electrospray ionization（ESI+）mode and multiple reactions monitoring（MRM）were adopted to detect，external standard method was used for quantitative determination. Results The linear range of rhodamine B was 2.0-50 ng/mL. The average recoveries of rhodamine B from spiked sample at three concentration levels were between 90% and110% with RSD（n=6），the relative standard deviations（RSDs）were less than 10%（n=6）. The limits of quantitation（LOD）were 1 ?g/kg. Conclusion The proposed method is fast，accurate and sensitive，which is suitable for detecting rhodamine B in feed samples.

Key words： Rhodamine B;liquid chromatography tandem mass spectrometer;solid phase extraction;food;residues

羅丹明B（rhodamine B，RhB），又稱玫瑰紅B，俗稱花粉紅[1]。羅丹明B是以氧雜蒽為母體的堿性咕噸染料，具有特殊的結(jié)構(gòu)及熒光特性，是常用的熒光分析試劑，是用于腈綸、造紙、油漆、鋼鐵、礦業(yè)等領(lǐng)域的工業(yè)染料，羅丹明B具有潛在的致癌、致畸和致突變作用[2-3]，日本及歐美等國家和地區(qū)均已禁止用于食品加工中，中國衛(wèi)生部也將其列在《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單（第一批）》中，禁止在食品中使用。由于羅丹明B價(jià)格低廉、色彩絢麗、穩(wěn)定性強(qiáng)，仍有部分不法商販為了牟取暴利，違法將其加入到辣椒油、辣椒醬等調(diào)味品中，因此，建立食品中羅丹明B的檢測方法，有助于控制工業(yè)染料在食品中的濫用，應(yīng)對(duì)突發(fā)的食品安全事件。

羅丹明B目前的主要檢測方式是高效液相色譜法[4-6]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[7-10]、熒光探針法[11]、免疫檢測法[12]等，主要樣品的前處理方式是液-液萃取法[7]、固相萃取法[9]、微波輔助萃取法[13]、QuEChERS[14]以及凝膠滲透色譜凈化法[8，15]。

本文采用酸化乙腈提取樣品，經(jīng)固相萃取柱進(jìn)行凈化，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)行檢測，方法靈敏度高，準(zhǔn)確度高，適合于多種食品中羅丹明B的檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

TQD型三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（沃特斯公司，配有電噴霧離子源）;氮吹儀（屹堯公司）;離心機(jī)（美國日立公司）。

羅丹明B（購于德國DR.公司）。

乙腈、甲醇、正己烷和冰醋酸（色譜純，F(xiàn)isher公司）;乙酸銨（分析純，國藥集團(tuán)）;MCX固相萃取柱（6 mL，150 mg，Waters公司）;實(shí)驗(yàn)室用水為Milli-Q超純水。

樣品為市售。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液配制：精密稱取羅丹明B適量，用甲醇溶解，分別將待測物質(zhì)配制成0.5 mg/mL的儲(chǔ)備溶液。

1.2.2 樣品制備

將樣品混勻，精密稱取2.00 g于50 mL離心管中，加入10 mL2%的酸化乙腈，渦旋2 min，超聲10 min，水平震蕩10 min（速度200 Moti/min），在-10 ℃下10000 rpm離心8 min;轉(zhuǎn)移上清液于另一離心管中，加入5 mL乙腈飽和的正己烷，渦旋2 min，在5000 rpm離心5 min，棄去正己烷層（重復(fù)3遍），乙腈層于氮?dú)饬飨麓抵两桑?加入5 mL2%甲酸溶液，渦旋混合30 s，在-10 ℃下4300 rpm離心5 min，上清液經(jīng)MCX 6cc 150 mg固相萃取柱（6 mL5%甲醇氨，6 mL甲醇，6 mL水，6 mL2%甲酸溶液依次活化）純化，先后用5 mL甲醇和5 ml5%甲醇淋洗，抽干，6 mL5%甲醇氨洗脫，洗脫液在65 ℃水浴中用氮?dú)獯蹈?，加? mL10%乙腈溶解殘?jiān)?.22 m的濾膜，過濾，作為樣品溶液。

1.2.3 儀器條件

1）色譜條件

色譜柱：a）色譜柱：waters C18柱，100×2.1 mm，粒徑1.7 ?m;b）流速：0.3 mL/min;c）柱溫：35 ℃;d）進(jìn)樣量：5 μL;e）流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸乙腈溶液，洗脫梯度：0～2.0 min，90%～40% A;2.0～4.0 min，40% A;4.0～4.5min，40%～90% A;4.5～7 min，90% A。

2）質(zhì)譜條件

質(zhì)譜條件：a）電離方式：電噴霧正離子模式;b）檢測方式：多反應(yīng)檢測（MRM）;c）霧化氣壓力：30 psi;d）離子噴霧電壓：3500 V;e）干燥氣溫度：330 ℃;f）干燥氣流速：11 L/min;g）*：定量離子。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件優(yōu)化

首先將0.5 ?g/mL的待測化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別以流動(dòng)注射的方式在正離子模式下進(jìn)行母離子全掃描，確定分子離子，然后對(duì)其子離子進(jìn)行全掃描，優(yōu)化碰撞能量等參數(shù)得到羅丹明B的最佳質(zhì)譜條件，羅丹明B檢測參數(shù)見表1。

2.2 樣品提取和凈化方式的選擇

2.2.1 樣品提取溶液的種類和體積選擇

羅丹明B為堿性物質(zhì)，易溶于水。研究了酸化甲醇-水、酸化乙腈-水體系的萃取效率，對(duì)含油脂較少的樣品，發(fā)現(xiàn)有機(jī)溶劑比例增加時(shí)，回收率沒有明顯的變化，當(dāng)樣品中油脂含量較高時(shí)，加入有機(jī)溶劑回收率明顯提高，隨著有機(jī)溶劑比例的增加，色素等物質(zhì)在萃取液中明顯減少，沉淀蛋白作用也很顯著，當(dāng)提取溶劑2%酸化乙腈時(shí)，提取溶劑只需要10 mL，調(diào)味油、炒貨和臘腸樣品的提取回收率最高，離心后，可以去除大部分的油脂和蛋白，同時(shí)，對(duì)于色素含量較高的辣椒面、辣椒醬等樣品，隨著乙腈的比例增加，色素的提取率降低，干擾較少，因此文本選擇了2%酸化乙腈，體積為10 mL作為提取溶劑。

2.2.2 除去脂肪、油脂的方法的選擇

對(duì)于調(diào)味油、臘腸和炒貨的樣品，油脂、脂肪含量較高，酸化乙腈也會(huì)提取出一部分，為了更好的延長色譜柱的使用壽命，保護(hù)好儀器，進(jìn)一步去除油脂十分必要，本文考察了乙腈飽和的正己烷和石油醚去除油脂的效率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加入5 mL乙腈飽和的正己烷，重復(fù)提取2遍后，第3遍正己烷層已經(jīng)變?yōu)闊o色，因此本方法采用5 mL乙腈飽和的正己烷萃取3遍來去除油脂和脂肪。

2.2.3 固相萃取柱的選擇

本文分別考察了HLB、MAX、C18和MCX的固相萃取小柱，提取回收率四種類型的柱子結(jié)果相差不大，但是采用MCX小柱凈化后的樣品，基質(zhì)效應(yīng)較小，因此，本文選擇了MCX小柱進(jìn)行樣品凈化。

2.2.4 樣品基質(zhì)效應(yīng)的消除

大氣壓噴霧電離離子源（ESI）容易受樣品基質(zhì)的影響?；|(zhì)是樣品中被測物以外的組分，常對(duì)被測物分析有顯著的干擾，并影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，這些干擾和影響被稱為基質(zhì)效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)表現(xiàn)為離子抑制或離子增強(qiáng)。本文所涉及的樣品較為復(fù)雜，特別是調(diào)味油、臘腸和炒貨等樣品，基質(zhì)較為復(fù)雜，隨著最終的定容體積的增加，基質(zhì)效應(yīng)不斷降低，由于羅丹明B在質(zhì)譜上靈敏度較高，因此，最終選擇定容體積為5 mL，來消除基質(zhì)效應(yīng)，必要時(shí)，復(fù)雜基質(zhì)可以采用基質(zhì)空白配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)一步消除基質(zhì)效應(yīng)。

2.3 方法的線性范圍及檢出限

用10%乙腈將羅丹明B配制成濃度為2、4、10、20和50 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照“1.2.3 儀器條件”進(jìn)行檢測，以待測物濃度為橫坐標(biāo)，待測物峰面積峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明羅丹明B在2～50 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，可滿足樣品的定量分析的需要。檢出限和定量限的配制采用基質(zhì)空白溶液，檢出限（以3倍信噪比（S/N=3）計(jì)）及定量限（以10倍信噪比（S/N=10）計(jì)）見表2。

2.4 回收率及精密度實(shí)驗(yàn)

以空白基質(zhì)為樣品，在5、10和50 ?g/kg三個(gè)水平下進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，平行測定6個(gè)樣品，計(jì)算加標(biāo)回收率。結(jié)果見表3。

2.5 實(shí)際樣品測定

應(yīng)用本法測定了10批調(diào)味油，10批火鍋底料，10批炒貨，5批臘腸，均未檢出羅丹明B。

3 結(jié)論

本文所建立的方法快速、準(zhǔn)確、簡單，可對(duì)多類食品中的羅丹明B準(zhǔn)確定量，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，能夠滿足檢測技術(shù)要求，可以為檢驗(yàn)人員提供檢測依據(jù)，同時(shí)可為監(jiān)管進(jìn)行服務(wù)。

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【作者簡介】

白旭東（1973-），男，副主任中藥師，學(xué)士，研究方向?yàn)槭称?，藥品和醫(yī)療器械的檢驗(yàn)與審評(píng)。

孫曉娟（1986-），女，學(xué)士，研究方向?yàn)楸＝∈称窓z驗(yàn)。

通訊作者：谷巖（1975-），女，碩士，研究方向?yàn)槭称窓z驗(yàn)與食品安全，E-mail：591131710@qq.com。