馬佳佳，姜宇文，單春會，趙慧君，鐘小丹，郭 壯

（1.湖北文理學(xué)院 湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北 襄陽 441053；2.石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832000；3.湖北米婆婆生物科技股份有限公司，湖北 孝感 432003）

新疆維吾爾自治區(qū)的紅棗種植面積約46.67萬km2，年產(chǎn)量在300萬t左右，種植面積和產(chǎn)量均約占全國的1/3[1]。目前新疆地區(qū)紅棗加工以干果和棗片等粗加工為主，以紅棗果汁（漿）飲料、醋和酵素加工為輔，存在深加工程度不高、加工鏈條短和附加值低等問題[2]。作為高附加值產(chǎn)品，紅棗酒是利用酵母菌將原料中的糖分轉(zhuǎn)化為酒精制成的一類發(fā)酵型果酒，具有口感清爽和香氣怡人的特點(diǎn)[3]。工業(yè)化生產(chǎn)的紅棗酒需接入活性干酵母進(jìn)行發(fā)酵，較之自然發(fā)酵的果酒其品質(zhì)更為穩(wěn)定且安全性更高[4]。然而，紅棗酒加工中使用的活性干酵母多為國外進(jìn)口，且多為葡萄酒釀造專用，具有自主知識產(chǎn)權(quán)且專門針對紅棗酒發(fā)酵的酵母菌菌株尚少。釀酒文化在我國具有幾千年的歷史，白酒[5]、黃酒[6]和米酒[7]不僅產(chǎn)品種類繁多，其酒曲[8]、酒醅[9]或窖泥[10]中亦蘊(yùn)含了寶貴的酵母菌微生物資源，因而從中分離、鑒定和篩選適合于紅棗酒加工用的酵母菌株具有較強(qiáng)的可行性和微生物資源開發(fā)保護(hù)價(jià)值。

作為中國地理標(biāo)識產(chǎn)品，孝感鳳窩酒曲真菌以淀粉霉（Amylomyces）、復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）和曲霉屬（Aspergillus）為主，其中酵母菌的含量占到了真菌總量的1/3[11]，具有較高的多樣性，為紅棗酒加工用酵母菌菌株的篩選提供了良好的素材?？勰覐?fù)膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）又稱扣囊復(fù)膜孢酵母或扣囊擬內(nèi)孢霉，在我國各類酒曲中大量存在[12]，具有高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶、淀粉酶和酸性蛋白酶等特性[13]，在紅棗酒中應(yīng)用可顯著提升酒體中乙酸乙酯的含量[14]。紅棗富含豐富的氨基酸，其不僅參與人體正常的新陳代謝，具有生物活性與功能，同時(shí)對果酒的滋味品質(zhì)具有重要的影響[15]。

本研究從湖北省孝感市采集了15個(gè)鳳窩酒曲樣品，采用純培養(yǎng)和分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的手段對其中蘊(yùn)含的酵母菌菌株進(jìn)行了分離鑒定，同時(shí)選取扣囊復(fù)膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）進(jìn)行了紅棗酒制備，并對其氨基酸種類和含量進(jìn)行了分析，以期為后續(xù)紅棗加工用酵母菌的篩選提供菌株支持和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米酒曲：市售。

M13F（-47）/M13R（-48）和NL1/NL4：均由武漢天一輝遠(yuǎn)生物有限公司合成；脫氧核糖核苷三磷酸、rTaq酶、10×聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）緩沖液和pMD18-T載體：大連寶生物技術(shù)有限公司；Axygen清潔試劑盒：康寧生命科學(xué)有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）、酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）合成培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氨基酸分析儀配套緩沖溶液1、緩沖液2、緩沖液5和緩沖液6：英國Biochrom公司。其中引物為NL1/NL4（NL1：5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'；NL4：5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）和M13F（-47）/M13R（-48）（M13F：5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'；M13R：5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3'）。

駿棗：新疆維吾爾自治區(qū)石河子市；白砂糖（食品級）：柳州市柳冰食品廠；果膠酶（5萬U/g）：和氏璧生物科技有限公司；偏重亞硫酸鉀（食品級）：意大利ESSECO集團(tuán)；酒石酸：南祥瑞食品添加有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ECLIPSSE Ci-L顯微鏡：日本NiKon公司；PTC-100PCR儀：美國ABI公司；FluorChem FC3化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)：美國ProteinSimple公司；WZS手持式折射儀：上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司；PHS-25型數(shù)顯pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；Biochrom 30+全自動(dòng)氨基酸分析儀：英國Biochrom公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的采集

于湖北省孝感市云夢縣的城北菜市場、珍珠坡菜市場以及大悟縣的三里菜市場選取無霉變、無蟲眼及無異味的米酒曲樣品，共采集15 份，其編號依次為HB1～HB15。

1.3.2 酵母菌的分離與鑒定

用生理鹽水對研碎后的米酒曲分別進(jìn)行倍比稀釋，取10-1～10-5稀釋液100 μL涂布于PDA固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)18～30 h，根據(jù)菌落形態(tài)與大小進(jìn)行單菌落挑選，純化3次后鏡檢，凍存?zhèn)溆?。按照下述方法對酵母菌基因組進(jìn)行提取和26S rDNA PCR擴(kuò)增[16]。擴(kuò)增體系：10×PCR 緩沖溶液2.5 μL、脫氧核糖核苷三磷酸2.0 μL、DNA聚合酶0.5 μL、引物NL1和NL4各0.5 μL、無菌水18.5 μL和DNA模板0.5 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用清潔試劑盒進(jìn)行純化，連接和轉(zhuǎn)化并挑陽性克隆子送武漢天一輝遠(yuǎn)生物有限公司測序。序列切除引物后，在美國國立生物技術(shù)信息中心（nationalcenter for biotechnology information，NCBI）網(wǎng)站上的GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源序列比對，進(jìn)而明確酵母菌的分類地位[17]。

1.3.3 紅棗酒的制作

取100 g去核駿棗加入500 mL蒸餾水和0.036 g偏重亞硫酸鉀后破壁打漿，棗漿靜置30 min，加入0.18 g果膠酶，45 ℃酶解2 h后，使用白砂糖將其可溶性固形物調(diào)至24°Bx并用酒石酸調(diào)pH值至3.80，68 ℃水浴殺菌1 h，備用[18]。將

1.3.2 中鑒定為釀酒酵母和扣囊復(fù)膜酵母的菌株，在YPD培養(yǎng)基中活化三代后離心收集菌體，按照5×107CFU/mL紅棗漿的比例接入菌體，發(fā)酵罐罐口4 層紗布封口后，20 ℃發(fā)酵，若發(fā)酵液的糖度在48h內(nèi)保持不變，則判定為發(fā)酵結(jié)束。紅棗酒用紗布袋過濾后4 ℃、10 000 r/min離心10 min，上清液備用。

1.3.4 紅棗酒中氨基酸含量的測定

參照GB/T 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》中約束方法對紅棗酒樣品進(jìn)行預(yù)處理。測試條件：色譜柱為磺酸型陽離子樹脂，檢測波長為440 nm和570 nm，溫度梯度為38 ℃、50 ℃和93 ℃，緩沖液1、2、5和6分別洗脫9 min、12 min、20 min和6 min，流速為35 mL/h。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析

使用PAST3.0軟件計(jì)算香農(nóng)指數(shù)和超1指數(shù)；使用MEGA 7.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，其他圖使用Origin 2017繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 孝感地區(qū)米酒曲中酵母菌的分離與鑒定

圖1 部分疑似酵母菌菌落特征及細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Colony characteristics and cell morphology of some suspected yeast strains

由圖1可知，菌株HBUAS61076的菌落偏小、呈乳白色圓形、表面濕潤光滑且中間凸起，菌體為卵形；菌株HBUAS61089的菌落亦偏小、呈乳黃色圓形、表面濕潤光滑且中間凸起，菌體為橢圓形；菌株HBUAS61093的菌落偏大、呈白色圓形、表面粗糙干燥且中間凸起，菌體為橢圓形并能形成假菌絲。

本研究采用分子生物學(xué)方法對疑似酵母菌分離株26S rDNA基因序列進(jìn)行了擴(kuò)增及測序，并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，其結(jié)果如圖2所示。

圖2 基于26S rDNA基因的部分酵母菌菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of partial yeast strains based on 26S rDNA gene

由圖2可知，HBUAS61116等15 株菌株與模式菌株Saccharomycopsis fibuligeraATCC 36309聚在一支且相似度≥99%，被鑒定為扣囊復(fù)膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）；HBUAS61081等8 株菌株與模式菌株P(guān)ichia anomalaNRRL Y-366聚在一支且相似度≥99%，被鑒定為皮希亞諾姆拉酵母（Pichia anomala）；HBUAS61079等8 株菌株與模式菌株Candida glabrataATCC 2001聚在一支且相似度≥99%，被鑒定為光滑假絲酵母（Candida glabrata）；HBUAS61080等7株菌株與模式菌株Cyberlindnera fabianiiNRRL 1871聚在一支且相似度≥99%，被鑒定為弗比恩酵母（Cyberlindnera fabianii）；HBUAS61108等3株菌株與模式菌株Saccharomyces cerevisiaeNRRL Y-12632聚在一支且相似度等于100%，被鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；HBUAS61110等2 株菌株與模式菌株Candida tropicalisATCC 750聚在一支且相似度≥99%，被鑒定為熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）；HBUAS61107菌株與模式菌株P(guān)ichia kudriavzeviiCBS5147聚在一支且相似度等于100%，被鑒定為庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）；HBUAS61120菌株與模式菌株Clavispora lusitaniaeNRRL Y-11827聚在一支且相似度等于100%，被鑒定為葡萄牙棒孢酵母（Clavispora lusitaniae）。各米酒曲樣品酵母菌分離鑒定情況如表1所示。

由表1可知，45 株酵母菌共被鑒定為8 個(gè)種，其中15 株為S.fibuligera，占分離株總數(shù)的33.33%。樣品HB2和HB5分別分離出3株和4株酵母菌，被鑒定為3個(gè)和4個(gè)物種，香農(nóng)指數(shù)分別為1.1和1.39，超1指數(shù)分別為6和10，而樣品HB1、HB6、HB8和HB15分別分離出2 株或3 株酵母菌，但均被鑒定為1個(gè)種，其香農(nóng)和超1指數(shù)均為0和1。由此可見，S.fibuligera為孝感地區(qū)米酒曲中的優(yōu)勢酵母菌，且不同米酒曲間酵母菌豐度和多樣性存在較大的差異。

表1 鳳窩酒曲樣品酵母菌分離鑒定統(tǒng)計(jì)Table 1 Isolation and identification statistics of yeast strains from Fengwo Jiuqu

2.2 紅棗酒氨基酸種類及含量分析

由表2可知，紅棗酒中共檢測到12種氨基酸，氨基酸總量為3.019 mg/mL，其中必需氨基酸有5種，累計(jì)含量為0.282 mg/mL，非必需氨基酸有7種，累計(jì)含量為2.737mg/mL。紅棗酒中含量最多的氨基酸為脯氨酸，含量為1.662 mg/mL，其次為天冬氨酸，含量為0.737 mg/mL。由此可見，紅棗酒中的氨基酸以脯氨酸和天冬氨酸等非必需氨基酸為主。黃酒中富含豐富的氨基酸，因而本研究結(jié)合參考文獻(xiàn)[17]將紅棗酒與丹陽封缸酒的氨基酸構(gòu)成進(jìn)行了比較分析。

由表2亦可知，丹陽封缸酒中氨基酸的總量為2.497mg/mL，共檢測出7 種必需氨基酸和10種非必需氨基，甘氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸和纈氨酸僅在丹陽封缸酒中檢測到。此外，紅棗酒中必需氨基酸所占的比例為9.3%，而丹陽封缸酒中這一比例高達(dá)42.4%。由此亦可知，較之丹陽封缸酒，雖然氨基酸的種類和必需氨基酸構(gòu)成均明顯偏少，但紅棗酒氨基酸總量明顯偏高。

表2 紅棗酒中氨基酸組成分析Table 2 Analysis of amino acid composition of jujube wine

本研究進(jìn)一步對紅棗酒中鮮、酸、澀、苦和甘5種呈味氨基酸的構(gòu)成進(jìn)行了分析與比較，結(jié)果見表2。由表2可知，紅棗酒中鮮味呈味氨基酸平均含量為0.132 mg/mL，占氨基酸總量的4.4%，變異系數(shù)為18.6%；酸味呈味氨基酸平均含量為0.737 mg/mL，占氨基酸總量的24.4%，變異系數(shù)為25.1%；澀味呈味氨基酸平均含量為0.057 mg/mL，占氨基酸總量的1.9%，變異系數(shù)為11.8%；苦味呈味氨基酸平均含量為0.067 mg/mL，占氨基酸總量的2.2%，變異系數(shù)為16.3%；甘味呈味氨基酸平均含量為2.026 mg/mL，占氨基酸總量的67.1%，變異系數(shù)為15.5%。由所測數(shù)據(jù)可得，紅棗酒中甘味呈味氨基酸含量最多，其次為酸味呈味氨基酸，而鮮、苦和澀味呈味氨基酸的含量均相對較少。相較之丹陽封缸酒，其甘味呈味氨基酸占總氨基酸的56.4%，為其主要呈味氨基酸，澀味和苦味呈味氨基酸的含量亦較高，分別占19.6%和14.9%，而酸味和鮮味呈味氨基酸含量較少，分別占5.4%和3.7%。由此可見，紅棗酒以甘味和酸味氨基酸為主，與丹陽封缸酒存在明顯的差異。

3 結(jié)論

S.fibuligera為孝感地區(qū)米酒曲中的優(yōu)勢酵母菌，且不同米酒曲間酵母菌豐度和多樣性存在較大的差異。以S.fibuligera和S.cerevisiae分離株進(jìn)行紅棗酒制備，結(jié)果發(fā)現(xiàn)紅棗酒中的氨基酸以脯氨酸和天冬氨酸等非必需氨基酸為主，呈味氨基酸以甘味和酸味為主。