權淑靜，胡 虹，解復紅，刁文濤，張秀江，杜志敏，陳國參

（1.河南省工業(yè)酶工程技術研究中心，河南 鄭州 450008；2.河南省科學院生物研究所有限責任公司，河南 鄭州 450008）

葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）系統(tǒng)命名為β-D-葡萄糖氧化還原酶，能利用氧分子作為電子受體催化β-D-葡萄糖氧化成為D-葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯和H2O2[1-2]。GOD是一種重要的商業(yè)用酶，廣泛應用于醫(yī)藥、紡織、食品、飼料、生物能源等多個領域[3-8]。GOD對多種病原菌如沙門氏菌（Salmonellainfantis）、金黃葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、空腸彎桿菌（Campylobacter jejuni）、單增李斯特菌（Listeria monocytogens）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）等有很好的拮抗作用[9]，可作為防腐劑和抗氧化劑，其殺菌效果比化學抑菌劑更具備安全性。

GOD廣泛存在于動植物、微生物體內(nèi)，但動植物組織中含量有限。微生物具有來源廣、生長周期短等優(yōu)點，是GOD工業(yè)化生產(chǎn)的主要方式。目前用于生產(chǎn)的菌株主要有曲霉屬（Aspergillus）和青霉屬（Penicillium）[10]真菌，此外，研究發(fā)現(xiàn)擬青霉屬、膠霉屬、帚霉屬以及一些酵母菌和細菌也具有產(chǎn)葡萄糖氧化酶的能力[11-13]。GOD目前存在著分離純化成本高、穩(wěn)定性及酶活性較差等問題[14]。黑曲霉和青霉因其產(chǎn)酶能力強，易于規(guī)?；粡V泛用于生產(chǎn)。但發(fā)酵過程中，有大量雜蛋白生成，且產(chǎn)品溫度穩(wěn)定性在20～50 ℃[15]，導致質(zhì)量和價格差異較大。因此，需要進一步篩選性能優(yōu)良菌株，來提升國內(nèi)葡萄糖氧化酶酶制劑質(zhì)量和市場競爭力[16]。

土壤中微生物資源豐富，本研究從土壤和果皮樣品中篩選產(chǎn)葡萄糖氧化酶菌株，通過形態(tài)觀察及分子生物學技術對其進行鑒定，并對其所產(chǎn)葡萄糖氧化酶酶學性質(zhì)進行初步研究，以期得到產(chǎn)胞外葡萄糖氧化酶酶活力高且熱穩(wěn)定性較好的優(yōu)良菌株，為進一步構建新型產(chǎn)葡萄糖氧化酶工程菌株提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

土壤樣品：分別采集于內(nèi)蒙古甜菜地、河南長垣黃河灘地葡萄根際、云南昆陽磷礦土壤；葡萄樣品：采自市售葡萄。采用多點混合采樣的方法[17]，土壤采集深度3～10 cm，混合均勻后將其裝入無菌袋中，0～4 ℃保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

初篩培養(yǎng)基[18]：蛋白胨3.0 g，葡萄糖80.0 g，脫氧膽酸鈉0.2 g，KH2PO40.2 g，CaCO33.5 g，（NH4）2HPO40.4 g，可溶性淀粉10.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，KI 1.7 g，瓊脂18.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH值自然。在115 ℃條件下高壓蒸汽滅菌25 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基[19]：蛋白胨3.0 g，葡萄糖80.0 g，KH2PO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KC1 0.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH值自然。在115 ℃條件下高壓蒸汽滅菌25 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potatodextroseagar，PDA）培養(yǎng)基[19]：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂18.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH值自然。在115 ℃條件下高壓蒸汽滅菌25 min。

1.1.3 主要試劑

脫氧膽酸鈉（分析純）：上海索萊寶生物科技有限公司；靛藍胭脂紅：上海源葉生物有限公司；2×EsTaqMaster Mix：北京康為世紀生物科技有限公司；真菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：美國Omega Bio-Tek公司；菌株18S rDNA基因聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增通用引物NS1、NS8：北京六合華大基因科技有限公司；DM2000 DNA Marker：北京康為世紀生物科技有限公司；蛋白胨、酵母粉（均為生化試劑）：英國Oxoid公司；瓊脂糖生化試劑：上海貝晶生物技術有限公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

Axio Image M2全電動正置熒光顯微鏡：德國zeiss公司；德國Thermo公司；DYY-6C電泳儀：北京六一生物科技有限公司；DRP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海森信實驗儀器有限公司；ChemiDoc XRS+化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司；Vortex-Genie2可調(diào)速漩渦混合器：美國SI公司；QYC-2012C恒溫搖床：上海福瑪實驗設備有限公司；Varioskan Flash全波長掃描式多功能讀數(shù)儀、Multifuge X1R離心機：美國THERMO公司；DK-8D恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設備有限公司；SX-500立式壓力蒸汽滅菌鍋：日本TOMY公司；Thermoblock梯度PCR儀：德國Biometra公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)葡萄糖氧化酶菌株的篩選

初篩：稱取10 g樣品，加入裝有8顆玻璃珠及90 mL生理鹽水的250 mL三角瓶中，30 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)30 min。采用梯度稀釋法，分別取200 μL不同梯度的樣品稀釋液涂布到初篩培養(yǎng)基，在28 ℃條件下培養(yǎng)至菌落長出，放置4 ℃冰箱，觀察顯色。挑取初篩培養(yǎng)基上呈現(xiàn)藍色的菌株在PDA培養(yǎng)基上進行分離純化，得到單菌落。

復篩：將初篩得到的菌株接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在25 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)3～7 d，取適量發(fā)酵液離心，上清即為粗酶液，采用靛藍胭脂紅褪色分光光度計法[20]測定葡萄糖氧化酶活力。

葡萄糖氧化酶活力定義：在50 ℃、pH 6.0條件下，每分鐘催化氧化產(chǎn)生1 μg過氧化氫所需要的酶量定義為一個酶活力單位（U/mL）。

1.3.2 高產(chǎn)葡萄糖氧化酶菌株的鑒定

形態(tài)觀察：將高產(chǎn)葡萄糖氧化酶的菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，在28 ℃條件下培養(yǎng)48～72 h，觀察其菌落形態(tài)、邊緣、顏色、菌絲長度等；顯微鏡下觀察孢子及菌絲形態(tài)。

分子生物學鑒定：采用Omega真菌基因組提取試劑盒提取菌株的基因組DNA，以其為模板，采取通用引物NS1（5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3'）、NS8（5'-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3'）PCR擴增18S rDNA序列。PCR擴增體系（25 μL）：EsTaqMaster Mix 12.5 μL，模板DNA 1 μL，NS1、NS8上下游引物各1 μL，超純水9.5 μL。PCR擴增條件：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。將PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，送去北京六合華大基因科技有限公司進行測序。測序結(jié)果提交至美國國立生物技術信息中心進行BLAST比對搜索，選取同源性較高的模式菌株的18S rDNA序列，利用MEGA6軟件中的鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 葡萄糖氧化酶酶學性質(zhì)研究

最適溫度及其溫度穩(wěn)定性：分別設置30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃溫度梯度，測定粗酶液在不同溫度下的酶活性，并測定粗酶液分別在不同溫度下保溫30 min后的剩余酶活力。設定最大酶活為100%，其他酶活值與之比值，計算相對酶活。確定酶的最適反應溫度及溫度穩(wěn)定性。

最適pH及pH穩(wěn)定性：配制pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的緩沖液，繪制不同pH條件下過氧化氫標準曲線。測定不同pH緩沖液稀釋粗酶液酶活力值，并且在4 ℃條件下不同pH緩沖液體系放置24 h后測定剩余酶活。計算相對酶活值。

金屬離子對酶活性的影響：在反應體系中分別加入2 μmol/mL的Na+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Mg2+、Ca2+、Co2+、Fe2+、K+、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA），測定酶活，以未加金屬離子的酶活為100%，計算相對酶活值。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)葡萄糖氧化酶菌株的篩選

通過初篩培養(yǎng)基分離篩選得到3株產(chǎn)葡萄糖氧化酶的菌株（圖1），命名為CY-12、KY-16、PT-22。

將初篩得到的3株菌株接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基進行復篩，結(jié)果見表1。由表1可知，3株菌均有產(chǎn)葡萄糖氧化酶活性，且在培養(yǎng)初期隨著培養(yǎng)時間的延長，其葡萄糖氧化酶活性升高，至發(fā)酵第3天進入產(chǎn)酶高峰期，第4天后隨著培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，產(chǎn)酶活性都有不同程度的下降。其中菌株CY-12葡萄糖氧化酶活性最高，發(fā)酵第3天達到194.69 U/mL，并且產(chǎn)酶活性較穩(wěn)定，在發(fā)酵第6天仍然保持32.14%的酶活，因此，選擇菌株CY-12為出發(fā)菌株。

圖1 產(chǎn)葡萄糖氧化酶菌株的初篩結(jié)果Fig.1 Results of preliminary screening of glucose oxidase-producing strain

表1 產(chǎn)葡萄糖氧化酶菌株的復篩Table 1 Secondary screening of glucose oxidase-producing strain

2.2 產(chǎn)葡萄糖氧化酶菌株的鑒定

2.1.1 形態(tài)觀察

圖2 高產(chǎn)葡萄糖氧化酶菌株CY-12的菌落（a）及細胞（b）形態(tài)Fig.2 Colony (a) and cell (b) morphology of high glucose oxidase producing strain CY-12

由圖2可知，產(chǎn)葡萄糖氧化酶菌株CY-12在PDA平板上菌落正面灰綠色，背面墨綠色，圓形、干燥、表面平坦，中心突起，邊緣絨毛狀，沒有分泌物。在顯微鏡下觀察菌絲少分支。分生孢子梗長，暗色，直立，頂部常形成分枝，單生或簇生。分生孢子暗色，1或2個細胞，形狀、大小不一，有些呈典型的檸檬狀。根據(jù)菌落和形態(tài)特征，初步鑒定該菌株屬于枝孢屬（Cladosporiumsp.）。

2.1.2 分子生物學鑒定

以提取的菌株CY-12的DNA為模板，以NS1、NS8為引物PCR擴增18S rDNA序列，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖3。

圖3 PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.3 Agarose gel electrophoresis results of PCR amplified products

由圖3可知，PCR擴增產(chǎn)物堿基長度為1 700 bp左右，與預期結(jié)果相符。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)過純化后委托北京六合華大基因科技有限公司進行測序，利用MEGA6軟件中的NJ法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，基于18S rDNA基因序列菌株CY-12的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4。

圖4 基于18S rDNA基因序列菌株CY-12的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain CY-12 based on 18S rDNA gene sequences

由圖4可知，菌株CY-12與CladosporiumiridisCBS138.40T聚于同一分支，相似性最高。結(jié)合形態(tài)觀察結(jié)果，確定菌株CY-12為枝孢屬（Cladosporiumsp.）。

2.3 菌株CY-2產(chǎn)葡萄糖氧化酶酶學性質(zhì)研究

2.3.1 不同溫度對葡萄糖氧化酶活性的影響

由圖5可知，隨著反應溫度的升高，酶活性呈先升高后下降的趨勢，當反應溫度為60 ℃時，酶活力最高，因此確定該酶的最適反應溫度為60 ℃。

由圖5可知，菌株CY-12所產(chǎn)的葡萄糖氧化酶在50～60 ℃保溫30 min，剩余酶活力均能保持在90%以上；70 ℃保溫30 min有85.97%的剩余酶活；80 ℃保溫30 min仍有72.93%的剩余酶活。證明該酶有較強的耐高溫性能且在30～80 ℃能保持較好的溫度穩(wěn)定性。

圖5 溫度對菌株CY-12所產(chǎn)葡萄糖氧化酶活力及穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of temperature on the activity and stability of glucose oxidase produced by strain CY-12

2.3.2 不同pH值對葡萄糖氧化酶活性的影響

圖6 pH值對菌株CY-12所產(chǎn)葡萄糖氧化酶活力及穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of pH value on the activity and stability of glucose oxidase produced by strain CY-12

由圖6可知，菌株CY-12所產(chǎn)的葡萄糖氧化酶在pH值＜5.0條件下相對酶活力低于10%，pH值＞5.0以后迅速升高，pH值為6.0時酶活力最高，隨著pH值的繼續(xù)升高酶活迅速降低，當pH值為7.0時，相對酶活僅剩31.44%。因此，確定該酶的最適反應pH值為6.0。

由圖6可知，在pH值為3.0和7.0條件下處理24 h后，相對酶活分別為26.57%、29.79%；在pH值4.0～6.0條件處理24h后，相對酶活力均能保持在75%以上；在pH值6.0條件處理24h后，相對酶活＞90%。證明該酶在中性偏酸條件下較為穩(wěn)定。

2.3.3 不同金屬離子對葡萄糖氧化酶活性的影響

圖7 金屬離子對菌株CY-12所產(chǎn)葡萄糖氧化酶活力的影響Fig.7 Effect of metal ions on the activity of glucose oxidase produced by strain CY-12

由圖7可知，Cu2+對酶活有明顯的激活作用，相對酶活達到151.13%；Co2+對酶活有明顯的抑制作用，相對酶活降至86.66%；其他離子對酶活作用不明顯。

3 結(jié)論

經(jīng)過初篩、復篩，從河南長垣黃河灘地葡萄根際土壤中篩選得到1株高產(chǎn)胞外葡萄糖氧化酶的菌株CY-12，其葡萄糖氧化酶活力最高可達194.69 U/mL。通過形態(tài)觀察和分子生物學技術鑒定，鑒定菌株CY-12為枝孢屬（Cladosporiumsp.）。該葡萄糖氧化酶酶促反應的最適反應溫度為60 ℃，在30～80 ℃范圍內(nèi)溫度穩(wěn)定性較好；最適反應pH值為6.0，在pH 4.0～6.0范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好。Cu2+對酶活有明顯的激活作用；Co2+對酶活有明顯的抑制作用。