聶 蔓，岳 軍，2△

1.電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院(成都 610072)；2.電子科技大學(xué)附屬醫(yī)院·四川省人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科(成都 610072)

卵巢癌(ovarian cancer,OC)是女性常見的五大癌癥之一，并且是導(dǎo)致女性死亡的第一大生殖系統(tǒng)癌癥[1]。研究[2]表明，約有20%～25%卵巢癌的發(fā)生發(fā)展與遺傳因素有關(guān)。癌癥基因組研究[3]顯示，96%OC腫瘤組織中都存在TP53基因突變，9%腫瘤組織中存在BRCA1基因突變，8%腫瘤組織中存在BRCA2 基因突變。OC基因組研究的突破性進(jìn)展與高通量測序技術(shù)(high throughput sequencing，HTS)發(fā)展密切相關(guān)。

高通量測序技術(shù)又稱為下一代測序技術(shù)(next generation sequencing，NGS)，能一次對幾十萬到幾百萬條 DNA 分子的序列進(jìn)行測定，比第一代測序技術(shù)成本低、速度快及測序通量高[4]。根據(jù)測序目的不同，HTS主要分為全外顯子測序、全基因組測序、靶向性區(qū)域測序、轉(zhuǎn)錄組測序等。其在腫瘤學(xué)方面的主要應(yīng)用有：通過血清中腫瘤標(biāo)志物的測定，協(xié)助腫瘤的診斷、預(yù)后判斷及療效評價；通過檢測腫瘤患者特定的基因變異情況，協(xié)助實(shí)施針對靶點(diǎn)的精準(zhǔn)治療方案；檢測正常人體中是否有腫瘤高危變異基因，對其進(jìn)行及時診斷并開展早期預(yù)防性治療[5]。腫瘤樣本中基本包含正常組織，并且單個腫瘤組織中可能存在多個攜帶不同遺傳變異類型的腫瘤亞克隆組織[6]?，F(xiàn)對4種測序技術(shù)在OC分析中的應(yīng)用情況作一綜述。

1 全外顯子測序

全外顯子組測序(whole exome sequencing，WES)是將全基因組外顯子區(qū)域DNA捕捉并富集后進(jìn)行測序的方法[7]。人類DNA外顯子組序列約有18萬個，占人類整個基因組序列的1%，約為30 Mb，但據(jù)估計85%人類致病突變均位于這1%的DNA編碼序列上[8]。因此，對患者的外顯子組進(jìn)行測序分析，所針對的是與疾病最相關(guān)的“編碼序列”區(qū)域，捕捉的是疾病的大部分致病突變信息,可用于與基因突變相關(guān)疾病的預(yù)測及診斷[9]。WES是目前針對OC基因組測序運(yùn)用最為廣泛的測序方法。

針對WES在高級別漿液性卵巢癌(high grade serous ovarian cancer,HGSOC)的研究，Dicks等[10]對3 107例HGSOC患者的DNA樣本進(jìn)行WES，確定FANCM可能為HGSOC的新型易感基因；Liu等[11]對512例HGSOC患者的DNA樣本使用WES，發(fā)現(xiàn)發(fā)生ADAMTS基因突變患者總生存期比發(fā)生BRCA1或BRCA2基因突變患者的總生存期更長；Norris等[12]對2例HGSOC患者的腫瘤樣品進(jìn)行WES，結(jié)合對神經(jīng)纖維蛋白NF1基因建模的結(jié)果發(fā)現(xiàn)由編碼神經(jīng)纖維蛋白的NF1基因突變引起的神經(jīng)纖維瘤病1型可能與HGSOC的發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性；Labidi-Galy等[13]通過對9例HGSOC患者的DNA樣本進(jìn)行WES和拷貝數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)p53印記細(xì)胞與HGSOC高度相關(guān)。

在家族性O(shè)C的研究中，Kuusisto等[14]使用WES分析來自芬蘭的13個具有高風(fēng)險遺傳性O(shè)C家族的37個個體的生殖細(xì)胞DNA，共檢測出21 530個罕見的編碼功能突變及5個剪接位點(diǎn)突變；Stafford等[15]通過WES，對48位具有高風(fēng)險遺傳性O(shè)C女性的候選基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了CHEK1，TP53I3，REC8，HMMR，RAD52，RAD1，POLK，POLQ和MCM4等與OC相關(guān)的突變基因；Jonson等[16]篩選了來自丹麥的1 228個具有遺傳性O(shè)C的家族，通過WES，在0.5%家族的DNA中都檢測到了RAD51C基因突變。

WES還可以與其他測序方法聯(lián)用進(jìn)行相互驗(yàn)證。Teer等[17]對9個非漿液性上皮性O(shè)C(包括6個卵巢子宮內(nèi)膜樣癌和3個卵巢黏液性癌)的DNA樣本進(jìn)行WES，然后將外顯子組測得的數(shù)據(jù)與靶向區(qū)域性測序測得的數(shù)據(jù)相結(jié)合，共篩選出1 321個與非漿液性上皮性O(shè)C相關(guān)的基因；Lakshminarasimhan等[18]通過全基因組和WES發(fā)現(xiàn)ARID1a基因在卵巢癌組織細(xì)胞的DNA中經(jīng)常發(fā)生突變；Kanke等[19]對22名患有OC的成年女性25～39歲進(jìn)行全外顯子組和RNA測序以確定其突變標(biāo)記和基因圖譜，發(fā)現(xiàn)發(fā)生突變的基因主要表現(xiàn)為“BRCAness”突變特征，這是BRCA1/BRCA2基因功能缺陷的一個重要指標(biāo)。

2 全基因組測序

大型癌癥研究組織主要使用WES技術(shù)研究癌癥基因，這種方法的不足之處在于，WES只允許檢測小的突變，如點(diǎn)突變和小的插入缺失，而全基因組測序(whole genome sequencing，WGS)能鑒定大規(guī)?；蚪M變異，如拷貝數(shù)變異和染色體重排。WGS是通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出片段化的DNA基因組，進(jìn)行最低限度處理后直接進(jìn)行高通量測序。這種方法雖然操作簡單卻能提供全部的DNA序列信息。與其他測序方法比較，該方法占用更多計算機(jī)資源、測序時間長、數(shù)據(jù)分析成本高。WGS能覆蓋幾乎所有的基因組區(qū)域，并捕獲包括內(nèi)含子、增強(qiáng)子、啟動子和非編碼RNA的所有基因突變。這些基因調(diào)控序列通常具有重要的生物學(xué)功能[20]。WGS可以檢測腫瘤基因組中所有類型的變異，包括染色體結(jié)構(gòu)變異、拷貝數(shù)改變、小片段缺失和插入及點(diǎn)突變等。

WGS現(xiàn)主要用于HGSOC患者DNA的染色體突變的研究。Chien等[21]對16個早期HGSOC患者的DNA進(jìn)行WGS，對早期HGSOC的發(fā)病機(jī)制提供了基因突變的證據(jù)；Vanderstichele等[22]通過WGS研究發(fā)現(xiàn)OC基因組中特定的堿基替換和染色體結(jié)構(gòu)變異特征與基因組本身的同源重組缺陷相關(guān)；Hillman等[23]對澳大利亞80個原發(fā)性HGSOC患者的臨床數(shù)據(jù)和WGS數(shù)據(jù)進(jìn)行回顧性分析，在HGSOC患者DNA中鑒定出5個基因組重排特征(Ov.RS1-5)，發(fā)現(xiàn)具有Ov.RS3基因組重排特征的患者與具有另外4個基因組重排特征的患者相比，總體存活率較差。

散發(fā)性O(shè)C WGS研究中，Xia等[24]在研究與子宮內(nèi)膜異位相關(guān)OC過程中，對64個病例的DNA樣本進(jìn)行WGS，發(fā)現(xiàn)PIK3CA、CTNNB1、ARID1A、PTEN和KRAS基因發(fā)生了突變；Itamochi等[25]對55名患有卵巢透明細(xì)胞癌(ovarian clear cell carcinoma,OCCC)的日本婦女腫瘤組織樣品和匹配的血液樣品DNA提取物進(jìn)行WGS，發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt和RTK/Ras信號通路可能是OCCC患者的潛在預(yù)后生物標(biāo)志物；Patch等[26]對92例原發(fā)難治性HGSOC患者的腫瘤細(xì)胞和生殖細(xì)胞的DNA樣本進(jìn)行WGS，發(fā)現(xiàn)DNA斷裂損傷會使原發(fā)性HGSOC患者基因中的腫瘤抑制子PTEN、RAD51B、NF1和RB1失活。

由于WGS數(shù)據(jù)量較大，所以研究者們會開發(fā)不同的算法程序來對測得的大數(shù)據(jù)進(jìn)行分析計算。Li等[27]使用一種用于定量分析結(jié)構(gòu)變異等位基因特異性拷貝數(shù)的算法Weaver，鑒定了44個OC WGS數(shù)據(jù)集中的重復(fù)發(fā)生的結(jié)構(gòu)變異模式，對OC基因組固有的復(fù)雜基因組體系結(jié)構(gòu)提供了更全面的評估；Jang等[28]開發(fā)出一個基于小波模型的算法程序來鑒定OC WGS數(shù)據(jù)中的焦點(diǎn)基因組改變，鑒定出了相關(guān)候選癌癥基因及之前已知的癌癥驅(qū)動基因的局部基因組改變； Schwarz等[29]利用MEDICC算法對來自14名接受鉑類藥物化療的HGSOC患者的135個腫瘤分離樣品的DNA進(jìn)行WGS，發(fā)現(xiàn)瘤內(nèi)異質(zhì)性的定量測量指標(biāo)可預(yù)測HGSOC患者經(jīng)鉑類藥物化療后的存活率。

3 靶向性區(qū)域測序

靶向性區(qū)域測序的目的基因片段短，測序深度高，能夠有效檢測到1%的低頻突變，所以靶向性區(qū)域測序現(xiàn)廣泛用于發(fā)生率較低的各類OC的研究。Mackenzie等[30]對69個黏液性O(shè)C病例里人類常見50個易突變基因進(jìn)行靶向性區(qū)域測序，檢測到KRAS、TP53、CDKN2A、PIK3CA、PTEN、BRAF、FGFR2、STK11、CTNNB1、SRC、SMAD4、GNA11和ERBB2基因的突變；Khattar等[31]對2例原發(fā)性卵巢淋巴癌患者的DNA樣本進(jìn)行靶向性區(qū)域測序，發(fā)現(xiàn)有4個基因在2個DNA樣本中均發(fā)生了突變，分別是：CASP8、FLT3、MAP3K1和HLA-A；Arildsen等[32]對64個OCCC病例中的60個相關(guān)基因進(jìn)行了靶向性區(qū)域測序，發(fā)現(xiàn)參與染色質(zhì)重塑的基因(ARID1A、SPOP和KMT2D)在OCCC患者中經(jīng)常發(fā)生突變；Rozenblum等[33]對1例高度非整倍體卵巢轉(zhuǎn)移性腫瘤的DNA樣本進(jìn)行靶向性區(qū)域測序，在DNA樣本中檢測到許多單核苷酸變異，還檢測到大量的焦點(diǎn)拷貝數(shù)變異。

由于大部分OC與BRCA1和BRCA2基因的突變相關(guān)，所以使用靶向性區(qū)域測序的方法對這2個基因及其附加基因的測序也成了近年來研究的熱點(diǎn)。Kluska等[34]對512名患有家族OC且僅在發(fā)病早期婦女DNA樣本的BRCA1/2基因進(jìn)行靶向性區(qū)域測序，發(fā)現(xiàn)146個單核苷酸變異和32個插入缺失；Hasmad等[35]對218名來自馬來西亞亞裔的漿液性O(shè)C患者的BRCA1/2基因進(jìn)行靶向性區(qū)域測序，分別在8%和3%患者DNA中發(fā)現(xiàn)BRCA1和BRCA2基因發(fā)生了突變；De Mattos-Arruda等[36]用1例62歲BRCA1基因突變攜帶者的乳房、附件和盆腔-腹膜區(qū)域中的同步腫瘤塊提取的DNA樣品，使用包含300個已知癌癥基因的平臺進(jìn)行靶向性區(qū)域測序，在乳房、卵巢和盆腔腹膜的DNA樣品中發(fā)現(xiàn)的體細(xì)胞遺傳性突變證實(shí)了乳腺癌和OC起源不同的說法，并且確定盆腔腹膜植入物與卵巢病變相關(guān)。

散發(fā)性O(shè)C靶向性區(qū)域測序中，Takenaka等[37]對72名日本OC患者腫瘤樣品的DNA使用靶向性區(qū)域測序，檢測到46個與OC相關(guān)基因中740個熱點(diǎn)的體細(xì)胞突變和拷貝數(shù)改變，在48.6%患者的DNA樣本中檢測到可使腫瘤對分子靶向藥物作出反應(yīng)的9個基因突變和拷貝數(shù)改變；Hirotsu等[38]對155例OC患者的DNA樣本進(jìn)行靶向區(qū)域性測序，檢測出3名患者M(jìn)alevaDNA樣本的ATM、MRE11A或MSH6基因發(fā)生致病性突變，且這些突變在DNA錯配修復(fù)和重組修復(fù)中都起著重要作用；Maleva Kostovska等[39]對273名癌癥患者和276名健康女性DNA樣本的ATAD5基因進(jìn)行靶向性區(qū)域測序，鑒定出22種罕見的錯義替換，其中14種可被歸類為致病性基因突變。

4 轉(zhuǎn)錄組測序

轉(zhuǎn)錄組測序(RNA sequencing,RNA-seq)能定量基因表達(dá)譜，檢測新的融合基因、RNA編輯及選擇性剪切變體的轉(zhuǎn)錄本，在OC新藥的研發(fā)過程中也起到重要作用。RNA-seq能檢測到DNA中相關(guān)的融合基因，并且可直接表達(dá)融合轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的精確序列。Smebye等[40]對19 例HGSOC患者的DNA樣本進(jìn)行RNA-seq，確定DPP9為HGSOC的新型融合基因候選基因；Earp等[41]對220個上皮性O(shè)C組織的DNA樣本使用RNA-seq篩選融合基因，發(fā)現(xiàn)UBAP1-TGM7基因融合在OCCC中的發(fā)生率很高，且OCCC比HGSOC具有更多融合基因類型; Kannan等[42]對60個HGSOC患者的DNA樣品使用RNA-seq結(jié)合DNA、RNA和蛋白質(zhì)水平的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，CDKN2D-WDFY2基因融合在HGSOC中的發(fā)生率為20%。

OC的RNA-seq被廣泛應(yīng)用于OC藥物的研究上。Xu等[43]對OC細(xì)胞系A(chǔ)2780和耐鉑紫杉醇OC細(xì)胞系A(chǔ)2780/PTX進(jìn)行RNA-seq，發(fā)現(xiàn)耐藥基因ABCB1、ABCB4、ABCC3和ABCG2與lncRNA上的CTD-2589M5.4基因有共表達(dá)的作用機(jī)制；Schott等[44]對使用5-FdU-Ecyd(2′-脫氧-5-氟尿嘧啶和3′-C-乙炔基胞嘧啶)處理的鉑類耐藥OC細(xì)胞系A(chǔ)2780進(jìn)行RNA-seq，發(fā)現(xiàn)5-FdU-Ecyd可抑制腫瘤細(xì)胞的克隆和球形生長；Liu等[45]使用RNA-seq證明了天然ERβ激動劑可通過促進(jìn)凋亡和抗炎癥作用顯著抑制OC細(xì)胞的生長，且天然ERβ激動劑可作為治療OC的新型藥物類型。

RNA-seq也廣泛用于HGSOC基因測序的研究。Kreuzinger等[46]對66名HGSOC患者的新鮮冷凍腫瘤組織DNA提取物進(jìn)行RNA-seq，發(fā)現(xiàn)B7-CD28基因在腫瘤組織中過表達(dá)；Sukhbaatar等[47]對1例HGSOC患者的DNA樣本使用RNA-seq鑒定了兩種功能性不同的TP53突變，發(fā)現(xiàn)兩種不同的功能性TP53突變，一種來源于輸卵管癌前病變，另一種來自卵巢病變；Bachmayr-Heyda等[48]對32名HGSOC患者的新鮮腫瘤組織和腹水中分離的腫瘤細(xì)胞的DNA樣本進(jìn)行RNA-seq，發(fā)現(xiàn)與編碼RNA相比，環(huán)狀RNA和lncRNA在腫瘤細(xì)胞中有更高表達(dá)且sRNA豐度不變。

5 其他測序技術(shù)

OC的發(fā)生除經(jīng)典遺傳因素外，表觀遺傳因素也參與其中。研究者針對OC基因組中甲基化的異常，對NGS作出改進(jìn)，開發(fā)出了亞硫酸氫鹽測序。Cui等[49]通過亞硫酸氫鹽測序在OC細(xì)胞A2780和A2780cis中發(fā)現(xiàn)了重CpG甲基化和CCDC69基因表達(dá)的恢復(fù)；Widschwendter等[50]對151例OC患者的DNA樣本進(jìn)行亞硫酸氫鹽測序，根據(jù)測序結(jié)果開發(fā)出了一種DNA甲基化血清標(biāo)志物，此標(biāo)志物可用于DNA甲基化分析，有助于OC早期發(fā)現(xiàn)和治療；H?fner等[51]通過亞硫酸氫鹽測序確認(rèn)陣列和MSP結(jié)果，發(fā)現(xiàn)RUNX3和CAMK2N1基因的高甲基化可作為上皮性O(shè)C的預(yù)后指標(biāo)。

微小RNA(microRNA，miRNA)是由19-23nt核苷酸所組成的單鏈非編碼RNA，可參與到OC發(fā)生發(fā)展的多個過程。Elias等[52]將來自179例血清樣品的miRNA測序與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析相結(jié)合，開發(fā)出了用于診斷上皮性O(shè)C的miRNA算法，表明循環(huán)miRNA測序結(jié)果有可能用于針對OC的非侵入性診斷檢驗(yàn)過程； Chang等[53]使用miRNA測序鑒定出了12個非上皮性O(shè)C患者的miRNA表達(dá)譜，觀察到有3個腫瘤組有顯著的miRNA表達(dá)變異，表明這些miRNAs可能具有作為腫瘤標(biāo)志物的潛在價值。sRNA測序(sRNA-seq)技術(shù)先對總RNA中的小RNA進(jìn)行擴(kuò)增，然后對擴(kuò)增產(chǎn)物純化后進(jìn)行測序。Singh等[54]通過sRNA測序鑒定了正常卵巢與漿液性和子宮內(nèi)膜樣OC組織中的piRNA(與Piwi蛋白相作用的RNA)轉(zhuǎn)錄組，在正常卵巢、子宮內(nèi)膜樣和漿液性O(shè)C樣品中分別檢測到219、256和234個piRNA，進(jìn)一步揭示了piRNA介導(dǎo)的影響OC發(fā)生的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的新機(jī)制。

6 小結(jié)與展望

通過查閱近幾年關(guān)于OC基因組測序的文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，OC新的基因突變類型發(fā)現(xiàn)層出不窮，且OC的突變基因的類型和頻率眾說紛紜。OC基因的突變不僅涉及單個基因突變，而且還涉及染色體突變、基因融合及表觀遺傳因素等，說明OC基因突變是一個復(fù)雜的、多因素的發(fā)生發(fā)展過程。測序過程中勢必會產(chǎn)生大量的研究數(shù)據(jù)，而單一的測序技術(shù)本身具有一定的局限性，所以各類測序技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用在今后或成為OC基因組測序領(lǐng)域的主要手段。OC發(fā)病機(jī)制存在差異，而這種差異會反映在其突變譜上。因此有必要對大量OC樣本進(jìn)行測序，以找到更多與OC相關(guān)的基因突變。