李現(xiàn)民，曹麗麗

（山東省安丘市人民醫(yī)院，山東 安丘 262100）

胃癌（GC）在中國(guó)導(dǎo)致大量癌癥誘發(fā)的死亡，盡管手術(shù)切除仍然是GC患者的有效治療方法，但由于原發(fā)性癌細(xì)胞的局部擴(kuò)散和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，在治療后仍可能出現(xiàn)癌癥的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[1]。因此，深入研究GC形成背后的精確分子機(jī)制對(duì)于開發(fā)GC的分子標(biāo)志物和治療策略很重要。本文進(jìn)一步闡明GC細(xì)胞轉(zhuǎn)移特性背后的分子機(jī)制，為優(yōu)化GC治療方案提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究背景

轉(zhuǎn)移性胃癌是一種典型的難治性疾病?？罐D(zhuǎn)移治療的進(jìn)展受到阻礙，因?yàn)檎{(diào)控GC細(xì)胞轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制沒有得到很好的闡明。

1.2 方法

1.2.1 樣本獲得

從2000年至2010年在安丘市人民醫(yī)院臨床診斷出的患者中獲得了三十對(duì)胃癌（GC）組織和相應(yīng)的正常組織。研究事先獲得患者的同意，并且得到了機(jī)構(gòu)研究的授權(quán)，經(jīng)安丘市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)通過。

四種GC細(xì)胞系（MKN45，MKN28，SGC7901和BGC823），HEK-293T細(xì)胞和人胃上皮細(xì)胞（GES-1）購(gòu)自廣州珍妮生物技術(shù)有限公司。將細(xì)胞系維持在37℃的5%CO2培養(yǎng)箱中。

1.2.2 轉(zhuǎn)染

用Lipofectamine 3000進(jìn)行載體或短發(fā)夾RNA的轉(zhuǎn)染。

1.2.3 細(xì)胞增殖測(cè)定

SGC791或BGC823細(xì)胞接種到96孔板中。將細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)，48小時(shí)或72小時(shí)后，通過MTS細(xì)胞增殖比色測(cè)定試劑盒在490nm處測(cè)定OD值[2]。

1.2.4 集落形成分析

SGC7901細(xì)胞在六孔板中培養(yǎng)，并與新鮮培養(yǎng)基孵育兩周，之后用4%甲醛固定細(xì)胞集落，并用1%結(jié)晶紫染色。

1.2.5 遷移測(cè)定

將SGC7901或BGC823細(xì)胞接種到六孔板中，使其融合過夜，使用100μl尖端制造人工傷口；后使用不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)，在0 h和24 h記錄傷口寬度的圖像[3]。

1.2.6 Transwell入侵檢測(cè)

將細(xì)胞懸浮于無血清培養(yǎng)基中，并添加到Transwell濾膜的上腔室中；在下腔室中裝滿600μl含20%FBS的培養(yǎng)基，孵育24小時(shí)后，使用4%甲醛固定侵襲的GC細(xì)胞，并在隨機(jī)選擇的五個(gè)電場(chǎng)中對(duì)侵襲的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)[4]。

使用TRI試劑收集總RNA。使用PrimeScript RT試劑盒用1 g R N A合成c D N A。使用S Y B R P r e m i x Ex Taq在Applied Biosystems中進(jìn)行qPCR13反向：CTG TGGAGGTC ACTGTAGAC T，GAPDH向前：A G G T C G G T G T G A A C G G AT T T G，G P P D H反向：GGGGGTGTTGATGGCAACA。

1.2.7 免疫印跡分析

使用RIPA裂解法從細(xì)胞或組織中收集蛋白質(zhì)。25%的蛋白質(zhì)使用8%SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；將PVDF膜與MMP13，GOLM1或GAPDH抗體）孵育過夜，或?qū)APDH抗體孵育過夜。用TBST洗滌3次后，將PVDF膜與結(jié)合了HRP的二抗一起孵育。使用ECL試劑盒檢測(cè)目標(biāo)條帶。

1.2.8 異種移植模型

將親代SC7901細(xì)胞或shGOLM1轉(zhuǎn)染的SGC7910細(xì)胞或GOLM1過表達(dá)的SGC7901細(xì)胞皮下接種到BALB / c裸鼠中。每周測(cè)量其寬度和長(zhǎng)度，并計(jì)算每組的腫瘤體積。四周后將裸鼠殺死，通過側(cè)尾靜脈將過表達(dá)的SGC7901細(xì)胞注入裸鼠，14天后，將裸鼠獻(xiàn)血并轉(zhuǎn)移灶數(shù)，在肺組織中計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均以均值SD表示，并使用SPSS 17.0軟件（IBM，Chicago，IL，USA）進(jìn)行了分析。使用學(xué)生t檢驗(yàn)對(duì)正態(tài)分布數(shù)據(jù)進(jìn)行分組比較。P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)GOLM1在氣相色譜中過度表達(dá)，敲除GOLM1可降低體外氣相色譜細(xì)胞的侵襲性表型。此外，GOLM1的下調(diào)抑制了裸鼠GC細(xì)胞的生長(zhǎng)。然而，GOLM1的上調(diào)明顯提高了GC-SGC7910細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲能力。最后，GOLM1以MMP13依賴的方式增加GC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移表型。

3 結(jié) 語

惡性胃癌（GC）是具有高轉(zhuǎn)移潛力的常見消化系統(tǒng)腫瘤，具有最高的死亡風(fēng)險(xiǎn)，因此，胃癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究對(duì)于改善胃癌的治療至關(guān)重要[5]。在本研究中，我們揭示了GOLM1在GC細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵功能，觀察到GOLM1在體外調(diào)節(jié)GC細(xì)胞的侵襲性表型（遷移和侵襲），在體內(nèi)調(diào)節(jié)GC細(xì)胞的生長(zhǎng)。另外，我們觀察到了qLC和免疫熒光染色測(cè)定法在臨床GC組織以及GC細(xì)胞系中GOLM1的過度表達(dá)，但是GOLM1到底如何調(diào)節(jié)GC的侵略性行為仍然沒有很好的探索。先前的報(bào)道證實(shí)，間充質(zhì)型癌細(xì)胞表現(xiàn)出更高水平的基因，這些基因與侵襲和遷移行為有關(guān)[6]。GOLM1對(duì)癌細(xì)胞EMT的調(diào)節(jié)功能可能通過幾種途徑來執(zhí)行，包括直接調(diào)節(jié)EMT過程所需的EMT轉(zhuǎn)錄因子或細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分，在未來的研究中有必要闡明GOLM1在GC細(xì)胞EMT過程中的確切作用。

總之，我們的研究確定GOLM1是胃癌發(fā)展過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，這表明GOLM1可能是對(duì)抗人類胃癌轉(zhuǎn)移的有希望的新治療靶標(biāo)。