楊忻宸，周全紅

(上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院麻醉科，上海 200233)

炎癥反應(yīng)是人體免疫系統(tǒng)與受損組織間的相互作用，諸如感染、創(chuàng)傷及自身免疫性疾病中的有毒代謝物等多種刺激因素均可造成組織損傷從而引發(fā)炎癥反應(yīng)。革蘭氏陰性菌是造成感染的常見病原體，其細(xì)胞壁的主要成分之一脂多糖(LPS)是重要的炎癥誘導(dǎo)因子[1-2]。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是先天免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分，并且在適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的建立中也起至關(guān)重要的作用。其中，人們最早發(fā)現(xiàn)的Toll樣受體4(TLR4)可與LPS結(jié)合并被激活，由此啟動(dòng)核因子(NF)-κB通路觸發(fā)促炎因子的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[3]并最終造成局部炎癥的產(chǎn)生，參與疾病的發(fā)病。因此，TLR4/NF-κB通路在炎癥的發(fā)生發(fā)展中起到了極其重要的作用。地塞米松作為糖皮質(zhì)激素(GC)的代表之一，被廣泛應(yīng)用于治療炎癥性疾病、自身免疫性疾病和過敏性疾病以及防止移植排異反應(yīng)[4-5]。多項(xiàng)研究[6-7]表明，地塞米松可通過下調(diào)多條炎癥通路包括NF-κB通路的表達(dá)而發(fā)揮其抗炎等作用，且早期應(yīng)用地塞米松似乎對LPS引起的膿毒癥預(yù)后有積極作用。然而，也有研究[8-9]表明，在治療全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)時(shí)大劑量或者長期應(yīng)用地塞米松將導(dǎo)致其抗炎作用減弱，甚至使急性炎癥轉(zhuǎn)為遷延不愈的慢性炎癥。因此，探索地塞米松對LPS-TLR4/NF-κB信號通路的作用及調(diào)控機(jī)制對指導(dǎo)膿毒癥等炎性疾病的臨床治療具有重要意義。

1 地塞米松藥理學(xué)特性

數(shù)十年前，地塞米松這一強(qiáng)效且廉價(jià)的人工合成糖皮質(zhì)激素被認(rèn)定為炎癥性疾病治療的金標(biāo)準(zhǔn)。然而，醫(yī)學(xué)發(fā)展至今，地塞米松的臨床應(yīng)用卻因其嚴(yán)重的副作用而受到了限制，如：胰島素抵抗、肥胖、青光眼、骨質(zhì)疏松、傷口愈合困難甚至庫欣綜合征等[10-12]。

為了盡可能發(fā)揮地塞米松等糖皮質(zhì)激素的臨床治療效用并且規(guī)避其副作用，學(xué)者們嘗試了從分子層面解讀其作用機(jī)制。最終發(fā)現(xiàn)，地塞米松通過與糖皮質(zhì)激素受體(GR)結(jié)合而發(fā)揮其抗炎、抗免疫等作用。靜息狀態(tài)下GR所位于細(xì)胞質(zhì)中，與地塞米松等結(jié)合后可發(fā)生核轉(zhuǎn)位并與DNA序列相互作用從而啟動(dòng)靶基因的轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致多條炎癥通路，包括NF-κB通路，改變炎癥甚至疾病的發(fā)展過程[6,13]。近年來，通過全基因組定位GR靶基因以及分析小鼠突變模型等，學(xué)者們正逐步揭露地塞米松及GR的分子機(jī)制并有望以此為理論基礎(chǔ)探索出更加安全、副作用更小的治療方法[14-15]。

2 LPS誘導(dǎo)的TLR4/NF-κB信號通路激活

Toll樣受體是一種跨膜模式識別受體，可識別來源于包括病原體、不同的細(xì)胞因子等的病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)[16]，使胞質(zhì)中相對應(yīng)的適配蛋白向其聚集以誘發(fā)進(jìn)一步的級聯(lián)反應(yīng)，最終激活TLR4/NF-κB通路，啟動(dòng)促炎因子等的轉(zhuǎn)錄。

迄今為止發(fā)現(xiàn)的眾多可被TLRs識別的PAMPs中，最著名的就是來自革蘭陰性菌細(xì)胞壁[17]的LPS。LPS可被TLR4識別并作為配體與之結(jié)合，再通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞[18]。隨后，通過TLR4適配蛋白髓樣分化因子88(MyD88)依賴或非依賴通路最終激活NF-κB。其中，最主要為MyD88依賴通路。LPS與TLR4復(fù)合體入胞與MyD88相結(jié)合[19]，通過一系列激酶和因子的參與可激活2條亞通路。1)經(jīng)典的NF-κB抑制蛋白激酶(IKK)通路：IKK被MyD88激活后，使靜息狀態(tài)下的NF-κB抑制蛋白(IκB)/NF-κB復(fù)合體解離，同時(shí)IκB磷酸化并降解。此后，游離的NF-κB二聚體(由p50和p65兩個(gè)蛋白亞基組成)向細(xì)胞核移位，結(jié)合至DNA中的同源位點(diǎn)并啟動(dòng)編碼白介素(IL)-6及白介素(IL)-12的基因轉(zhuǎn)錄，最終促進(jìn)主要的促炎因子釋放[20]。2)有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)通路：MyD88也可激活MAPKs從而對胞質(zhì)一些轉(zhuǎn)錄因子包括活化蛋白1(AP-1)的活性進(jìn)行調(diào)節(jié)，使其發(fā)生核轉(zhuǎn)位并啟動(dòng)下游信號傳導(dǎo)過程，最終同樣推動(dòng)促炎因子的表達(dá)[21]。

3 地塞米松對LPS-TLR4/NF-κB信號通路的影響

LPS對機(jī)體的侵犯可使細(xì)胞內(nèi)TLR4/NF-κB信號通路激活，促進(jìn)IL-6、IL-12及腫瘤壞死因子(TNF)-α等促炎因子的釋放，導(dǎo)致局部炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生甚至SIRS的爆發(fā)。地塞米松可通過與胞內(nèi)的GR結(jié)合，轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核后干擾NF-κB通路的下游轉(zhuǎn)錄過程從而調(diào)節(jié)下游的轉(zhuǎn)錄過程[22]，最終可影響炎癥因子、TLR4以及抑制蛋白IκB等NF-κB通路各組分的表達(dá)水平，改變炎癥的轉(zhuǎn)歸。

3.1 GR的基因組作用

早在上世紀(jì)末就有學(xué)者[7]發(fā)現(xiàn)，地塞米松可激活細(xì)胞質(zhì)中的某些核受體使其發(fā)生核轉(zhuǎn)位，核受體與DNA的特定位點(diǎn)結(jié)合后，可啟動(dòng)目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄過程從而對下游炎癥通路進(jìn)行調(diào)節(jié)；糖皮質(zhì)激素可增加NF-κB抑制蛋白IκB的含量，進(jìn)而推斷地塞米松是通過這一方式將NF-κB“固定”在胞質(zhì)中使其信號通路得到抑制。但是，HECK等[22]利用突變的GR進(jìn)行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)地塞米松作用后雖然IκB水平未得到提高但NF-κB的活性仍受到了抑制。這一發(fā)現(xiàn)大大推動(dòng)了人們對核受體GR的進(jìn)一步研究。

CAELLES等[23]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)對促炎信號發(fā)揮拮抗作用時(shí)，GR可直接對MAPK通路進(jìn)行干擾最終導(dǎo)致基因調(diào)控水平的抑制。此后，針對GR的作用機(jī)制人們繼續(xù)提出了數(shù)種猜想，其中大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，GR入核后是通過蛋白質(zhì)間的相互作用與AP-1或NF-κB結(jié)合以抑制下游轉(zhuǎn)錄過程，而不是直接作用于DNA[24]。也就是說，當(dāng)LPS激活TLR4/NF-κB通路后，NF-κB或AP-1入核并與DNA結(jié)合，此時(shí)GR進(jìn)入細(xì)胞核并與它們相互作用，抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。

除此之外，還有學(xué)者[25]提出GR可與其他轉(zhuǎn)錄因子共同與基因組中的復(fù)合元件結(jié)合并影響炎癥靶基因的轉(zhuǎn)錄，這一復(fù)合元件是由GR的結(jié)合位點(diǎn)和其他轉(zhuǎn)錄因子的同源序列部分重疊而形成的。例如，GR的DNA結(jié)合域(DBD)可與NF-κB同源序列中的一個(gè)新識別出的序列相結(jié)合從而抑制NF-κB所啟動(dòng)的轉(zhuǎn)錄，這一與NF-κB反應(yīng)元件相重疊的GR結(jié)合位點(diǎn)被稱為NF-κB反應(yīng)元件(κBRE)。

3.2 地塞米松對TLR4的影響

TLR4作為跨膜模式識別受體可直接與LPS結(jié)合，是整個(gè)LPS-TLR4/NF-κB信號通路的起始點(diǎn)。有研究[26]表明，地塞米松可下調(diào)TLR4的表達(dá)以達(dá)到抑制整條炎性通路的作用效果，用0.19 μmol·L-1的地塞米松和LPS共同培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞24 h后，檢測細(xì)胞株的TLR4蛋白及mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與未加地塞米松的對照組相比，試驗(yàn)組TLR4的表達(dá)大幅下調(diào)。此外，GE等[27]以地塞米松作用于被LPS刺激的角質(zhì)形成細(xì)胞也觀察到了TLR4蛋白和mRNA水平的顯著下降。

3.3 地塞米松對NF-κB核轉(zhuǎn)位過程的影響

NF-κB核轉(zhuǎn)位的成功是后續(xù)眾多炎性因子基因表達(dá)的必要條件，因此從IKK被激活后使IΚB/NF-ΚB復(fù)合體解離，到游離的NF-κB入核這一過程是LPS-TLR4/NF-κB信號通路的核心。有研究[7]發(fā)現(xiàn)，地塞米松可抑制ⅠκB的磷酸化從而使炎癥模型大鼠組織中ⅠκB水平回升至基線水平，同時(shí)降低NF-κB p65核蛋白的表達(dá)。BAYIR等[28]利用大鼠胸膜炎模型研究發(fā)現(xiàn)，小劑量地塞米松(0.5 mg·kg-1)即可明顯下調(diào)NF-κB的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)中NF-κB通路的激活。

3.4 地塞米松對炎癥因子的影響

地塞米松可通過對先天免疫系統(tǒng)中諸多細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等)的影響來發(fā)揮其抗炎及免疫抑制作用[29]。其中，巨噬細(xì)胞作為重要的炎性及免疫細(xì)胞，在受到刺激時(shí)可分泌多種炎癥因子，參與炎癥反應(yīng)的同時(shí)也以各種方式調(diào)節(jié)組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)[30]。根據(jù)其刺激源的不同，巨噬細(xì)胞可表現(xiàn)出M1和M2兩種表型[11]。M1型巨噬細(xì)胞介導(dǎo)促炎反應(yīng)；而相對的，M2型巨噬細(xì)胞主要分泌抗炎因子并介導(dǎo)抗炎反應(yīng)。前文所述TLR4/NF-κB信號通路經(jīng)LPS激活后即可使巨噬細(xì)胞向M1表型極化，最終分泌促炎因子誘發(fā)炎癥。地塞米松可刺激巨噬細(xì)胞向M2表型轉(zhuǎn)換，同時(shí)通過其基因組作用影響NF-κB的基因轉(zhuǎn)錄過程從而抑制IL-1和IL-6等多種促炎因子的基因表達(dá)，最終促進(jìn)抗炎因子IL-10的分泌[31]。IL-10作為巨噬細(xì)胞M2型刺激物又可以進(jìn)一步推動(dòng)轉(zhuǎn)換過程，使M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量增多，分泌的抗炎因子數(shù)量也就上漲?？偟膩碚f，地塞米松可通過使巨噬細(xì)胞向M2型極化達(dá)成抗炎因子增多而促炎因子減少的作用效果。

WANG等[32]亦證實(shí)了上述觀點(diǎn)，他們測定了經(jīng)LPS及地塞米松處理的小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞中M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和IL-12，以及M2型標(biāo)記物精氨酸酶1(Arg-1)和CD206的mRNA水平，最終發(fā)現(xiàn)前二者的表達(dá)有所下調(diào)而后二者恰好與之相反，這也就證明了地塞米松可使巨噬細(xì)胞發(fā)生再級化，即由M1型轉(zhuǎn)為M2型；同時(shí)，他們還發(fā)現(xiàn)經(jīng)地塞米松處理后，與未做處理的對照組相比，TNF-α及IL-1β兩大促炎因子的含量顯著減少，表明地塞米松可使促炎因子含量減少而發(fā)揮其抗炎作用。最近，GABBIA等[7]通過結(jié)扎膽管制成的膽汁淤積大鼠模型進(jìn)行了類似的體內(nèi)試驗(yàn)，他們發(fā)現(xiàn)經(jīng)低劑量(0.125 mg·kg-1)地塞米松治療的大鼠與未治療組相比，血清中TNF-α、IL-6及IL-1等促炎因子的含量出現(xiàn)了大幅度下降，再次證實(shí)地塞米松對炎癥因子含量的影響。

4 地塞米松對LPS-TLR4/NF-κB信號通路作用的影響因素

盡管已有大量研究表明應(yīng)用地塞米松可抑制被LPS激活的TLR4/NF-κB信號通路，導(dǎo)致抗炎因子的分泌增多及促炎因子減少，但其不良反應(yīng)的產(chǎn)生機(jī)制仍有爭議。目前，學(xué)者們大多認(rèn)為地塞米松的用藥劑量和給藥次數(shù)是影響其對NF-κB信號通路作用結(jié)果的重要因素。

4.1 地塞米松的劑量

有學(xué)者[33]指出，地塞米松的藥效學(xué)及藥代動(dòng)力學(xué)是劑量依賴性的。TANG等[34]發(fā)現(xiàn)，分別以1.0、2.5、5.0 μmol·L-1的地塞米松處理LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞后，得到NF-κB的活性依次降低，并且當(dāng)濃度為1.0 μmol·L-1時(shí)NF-κB活性與未經(jīng)處理的對照組相比并無差異。除此之外，他們通過測定TNF-α、IL-6及IL-1β的mRNA表達(dá)發(fā)現(xiàn)地塞米松對這些促炎因子的抑制也是呈濃度依賴性的。另一項(xiàng)針對LPS誘導(dǎo)成熟的樹突狀細(xì)胞(DC)的研究[4]也提出了相似的觀點(diǎn)，應(yīng)用10-5、10-7、10-9、10-11mol·L-1的地塞米松處理DC后得出，LPS誘導(dǎo)的IκB磷酸化受到了部分抑制，且這一作用程度似乎和地塞米松的劑量呈正相關(guān)。結(jié)合上述研究可知，在某一范圍內(nèi)地塞米松的抗炎作用將隨用藥劑量的增加而增強(qiáng)。然而也有學(xué)者[7]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)對膿毒癥小鼠模型應(yīng)用大劑量地塞米松(12 mg·kg-1)時(shí)，其對促炎因子TNF-α等的抑制作用反而弱于小劑量組(1.2 mg·kg-1)。

4.2 地塞米松的給藥次數(shù)

盡管地塞米松在抗炎及免疫抑制等方面有顯著的優(yōu)勢，但目前普遍認(rèn)為其副作用的產(chǎn)生是與治療時(shí)間成比例的。有學(xué)者[9]發(fā)現(xiàn)對山羊長期應(yīng)用小劑量地塞米松(0.2 mg·kg-1，21 d)后，地塞米松將作為慢性應(yīng)激源導(dǎo)致TLR4/NF-κB信號通路的全面激活，最終造成組織損傷，造成這一結(jié)果的原因可能是地塞米松誘導(dǎo)了DNA甲基化的改變。然而有臨床研究[35]表明，多劑量(20、10、10 mg，每24 h給藥1次)與單劑量(20 mg)的地塞米松應(yīng)用相比，可使手術(shù)后患者血清IL-6水平顯著降低，減輕術(shù)后疼痛。這也就說明，短期多次全身應(yīng)用地塞米松對人體似乎是安全且可耐受的[36]。

5 總結(jié)與展望

地塞米松是臨床常用的抗炎藥物，該藥物在治療過程中表現(xiàn)出的強(qiáng)大抗炎作用以及其可累及全身的副作用一直受到廣泛關(guān)注。目前人們已發(fā)現(xiàn)了GR的存在，并闡明地塞米松可通過與GR結(jié)合干預(yù)LPS誘導(dǎo)的NF-κB核轉(zhuǎn)錄過程、下調(diào)TLR4的表達(dá)、抑制IκB的降解從而阻止NF-κB核轉(zhuǎn)位，以及促使巨噬細(xì)胞向M2型再極化以達(dá)成抗炎因子增多而促炎因子減少的作用效果。然而，對于地塞米松的安全劑量范圍及藥物副作用的產(chǎn)生機(jī)制仍不完全清楚。因此，進(jìn)一步探究地塞米松對LPS-TLR4/NF-κB信號通路的作用機(jī)制，確定地塞米松的理想劑量及給藥次數(shù)，對全身炎癥反應(yīng)如膿毒癥以及一系列慢性炎癥性疾病的治療具有極為重要的臨床意義。