王金海 朱宏陽 李泳寧

(福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學院藥學系，福建 福州 350101)

細菌纖維素(Bacterial cellulose,BC)具有良好的生物相容性，水合度很高，韌性又強，作為抗菌敷料，有利于限制感染并能使傷口快速愈合，同時BC可以被滅菌，易于吸收滲出物并易于儲藏處理。因此，BC在治療皮膚損傷、防治傷口感染以及人工皮膚等方面具有廣泛的用途，是一種天然的創(chuàng)傷敷料[1-2]。ε-聚賴氨酸(ε-Polylysine,ε-PL)是由賴氨酸殘基通過ε-氨基和α-羧基構(gòu)成的肽鍵連接而成的高分子聚合物，是一種新型的具有較好抑菌功效的生物防腐劑[3]。由于ε-PL在人體內(nèi)可分解為人體必需的L-賴氨酸,因此ε-PL也是一種較高安全性的天然食品防腐劑,具有水溶性好、抗菌譜廣等特點,具有潛在的商業(yè)利用價值[4]。目前我國已批準ε-PL作為食品防腐劑應用于熟肉制品、焙烤制品以及果蔬汁[5-6]。從應用角度來講,ε-PL能否與其它物質(zhì)配合使用,同時提高ε-PL的抗菌活性是一個值得深入探討的問題,學界對此也進行了大量研究[7-8]。本研究在前期工作中以具有自主知識產(chǎn)權(quán)的BacillusamyloliquefaciensZF-7(保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號為：CGMCC No. 6266)為出發(fā)菌株[9]，將ε-PL均勻吸附在BC上制備獲得聚賴氨酸/細菌纖維素抗菌敷料PLBC，并通過對其細胞毒性、生物相容性及抗菌性能進行檢測，篩選出合適濃度的抗菌敷料PLBC。

1 材料與方法

1.1 主要材料

ε-聚賴氨酸由南京軒凱生物科技有限公司提供，細菌纖維素由本實驗室制備，新西蘭白兔及SPF級昆明種小鼠購自于上海斯萊克實驗動物有限公司(許可證號:SCXK(滬)2017-0005)，小鼠成纖維細胞L929和人胚肝細胞系L02細胞由中國科學院上海細胞生物學研究所提供，實驗菌株由南方醫(yī)科大學微生物研究所提供。

1.2 抗菌敷料PLBC的制備

將若干BC膜片(本實驗組制備)浸泡于100mL一定濃度(0、0.5%、1.0%)PL溶液中，并將其置于超聲清洗器中超聲震蕩，使BC與PL能充分接觸吸附均勻，總吸附時間為1h，分3次重復震蕩，間隔時間10min。將吸附后的膜片放入濃度為15%甘油中，1～2s后迅速取出，取出后瀝干表面多余液體，于60℃烘箱烘干至恒重，供測試使用。

1.3 細胞毒性檢測

1.3.1 受試樣品浸提液制備

稱重受試敷料，嚴格高壓滅菌，用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋，使各無菌試管的敷料質(zhì)量濃度為100g/L,置37℃培養(yǎng)箱浸提48h。用微孔過濾器過濾后制成PLBC浸提液，置4℃冰箱保存，備用。以二甲基亞砜為陽性對照、RPMI1640培養(yǎng)液為陰性對照。

1.3.2 SRB法檢測PLBC體外對L02細胞增殖的影響

取對數(shù)生長期的L02細胞，接種于96 孔板上，100 μL/孔，細胞數(shù)3000個/孔，靜置15 min。培養(yǎng)24 h 后，每孔加100 μL PLBC，終濃度分別為1.00、2.00、4.00、8.00mg/mL，陰性對照組加培養(yǎng)液100 μL/孔，陽性對照組加5%的二甲基亞砜100 μL/孔，每組設4個復孔。置常規(guī)培養(yǎng)條件下作用24 h后，電子顯微鏡下觀察細胞生長狀況，SRB染色液染色，用酶標儀測量吸光度，計算細胞增殖抑制率。

1.3.3 CCK-8法檢測PLBC體外對L929細胞活性的影響

在24孔細胞培養(yǎng)板中接種濃度為2×105/mL的L929細胞懸浮液，種植15個孔，每組5個孔。培養(yǎng)24h后換液，分別在終濃度分別為1.00、2.00、4.00、8.00mg/mL PLBC組細胞培養(yǎng)，液液面滴1μL相對應的浸提液，待浸提液凝固后形成的混合液中調(diào)整浸提液濃度為1%。作用24h后換液，接著每孔中加入100μL CCK-8試劑，用酶標儀測量OD值，通過公式計算出細胞生長活性。

1.4 急性全身毒性實驗

取SPF級昆明種小鼠30只，體重約20g，雌雄各半，將小鼠隨機分為實驗組、陰性對照組、陽性對照組，每組10只。無菌條件下，按1mL/20g劑量標準將PLBC浸提液注入實驗組腹腔內(nèi)，陽性對照組注入等量苯酚，陰性對照組注入等量生理鹽水。連續(xù)觀察14天，記錄小鼠注射后1d、7d、14d呼吸、進食、毒性反應、體重變化或死亡。

1.5 溶血度測定

耳緣靜脈抽兔血4mL，制成新鮮的抗凝稀釋兔血。取5mL實驗組敷料浸提液置于離心管中，并用去離子水和生理鹽水設置陽性與陰性對照組，每組6只管，置于恒溫水浴箱中0.5h。將制作好的兔血0.1mL滴入各組中，混勻，靜置恒溫水浴箱1h，離心5min，觀察各管顏色及溶血現(xiàn)象。分別取200μL各管中的上清液添加到96孔板中。酶標儀測定各樣本OD值后計算出溶血度。

1.6 抗菌性能檢測

選用臨床常見三種菌株：大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)作為實驗用菌，采用抑菌圈法，將菌液均勻涂板后，在各板上貼附四種濃度PLBC敷料剪成直徑為10 mm 的小圓片，放置于細菌培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h 后，計算抑菌圈大小。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 SRB法檢測PLBC體外對L02細胞增殖的影響

培養(yǎng) 24 h 后，各濃度PLBC敷料組的細胞，貼壁生長好，細胞呈長梭形，可見核分裂細胞。陽性對照組細胞核固縮，細胞密度下降，死亡細胞多，少數(shù)貼壁細胞聚集成團。SRB法檢測結(jié)果顯示，不同濃度的PLBC(1.00、2.00、4.00、8.00mg/mL)作用于L02細胞24h的抑制率分別為95.67%±0.26%、94.34%±0.15%、94.92%±0.23%、92.19%±0.34%，P<0.01(表1)，根據(jù)國際醫(yī)療器械生物學評價細胞活性必須高于70%的標準，PLBC的細胞毒性符合國際標準。

表1 各組敷料作用于L02細胞的細胞相對增殖率及毒性評價

2.2 CCK-8法檢測PLBC體外對L929細胞活性的影響

實驗結(jié)果顯示，兩種不同敷料對細胞的生長均有抑制作用，其中BC組細胞活性為78.23%±5.18%，PLBC組為81.95%±3.57%，兩組敷料對細胞生長活性影響差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，詳見表2。因加入細胞培養(yǎng)液中任何非細胞培養(yǎng)所必需的物質(zhì)均會對細胞有不同程度的毒性作用，根據(jù)國際醫(yī)療器械生物學評價細胞活性必須高于70%的標準，PLBC的細胞毒性符合國際標準。

表2 CCK-8法檢測PLBC間接接觸L929

2.3 急性全身毒性實驗

各組小鼠體重增長見表3，比較三組間實驗動物的體重變化，結(jié)果顯示，實驗組PLBC對小鼠生長基本無影響，差異無統(tǒng)計學意義，而陽性組小鼠體重增長明顯減少。實驗結(jié)果顯示，陰性組各小鼠未見任何不良反應，體重呈增加趨勢，無死亡；實驗組各鼠活動正常，未發(fā)現(xiàn)呼吸抑制、步態(tài)不穩(wěn)、驚厥等毒性反應，無一死亡，體重呈增加趨勢。陽性組第一天死亡3只，其他小鼠出現(xiàn)震顫、潮式呼吸，活動下降，體重無明顯增加。

2.4 溶血實驗

實驗組PLBC浸提液離心管和陰性對照管離心后，上清液均為無色透明液體，紅細胞沉積管底，無明顯溶血現(xiàn)象。陽性對照組液體則呈艷粉色，底部未見明顯沉積，可見紅細胞破裂溶解。采用單因素方差分析比較三組間的吸光度值，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，兩兩比較提示各組間均有差異(P<0.01)，如表4所示。

表3 急性全身毒性實驗小鼠的體重變化 單位:g

表4 各組材料OD值及溶血率

2.5 抗菌性能檢測

抑菌圈提示，4組不同濃度的PLBC敷料其抑菌圈大小呈濃度依賴性，而BC組敷料在三個菌株中均未見明顯抑菌圈。在對三個菌株的抑菌圈中，不同濃度(1.00、2.00、4.00、8.00mg/mL)的PLBC所產(chǎn)生的抑菌圈大小分別為10.7～12.2mm、12.9～13.6mm、13.8～14.5mm、14.7～16.1mm)(圖1)。

圖1 五組敷料對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌的抑菌圈柱形圖比較

抑菌圈檢測法反映了PLBC與微生物直接接觸后的抑制性能，真正發(fā)揮抗菌作用的是吸附在纖維上的聚賴氨酸，其抗菌能力隨聚賴氨酸濃度升高而增加，而細菌纖維素作為敷料載體，本身并不具有抗菌性能。

3 討論

促進創(chuàng)面愈合是外科領域研究的熱點課題，如何有效防止創(chuàng)面感染是其重點研究方向。保護創(chuàng)面、防止并治療創(chuàng)面感染及加快創(chuàng)面愈合，已成為促創(chuàng)面愈合的研究熱點[10-11]。治療創(chuàng)面的常規(guī)方法是用可覆蓋創(chuàng)面并能殺滅病菌及促進傷口愈合的敷料覆蓋，不僅能為促進傷口愈合提供良好的微環(huán)境，還能有效防止感染、減少并發(fā)癥。近幾十年來，醫(yī)用抗菌敷料研究發(fā)生了突破性的發(fā)展，尤其是生物基醫(yī)用抗菌敷料獲得突飛猛進的進展[12-13]?，F(xiàn)如今生物基醫(yī)用抗菌敷料是在創(chuàng)傷修復“濕潤愈合”理論基礎上發(fā)展起來的新型材料，與傳統(tǒng)敷料相比，其具有加速創(chuàng)面愈合、提高創(chuàng)面愈合質(zhì)量、降低感染、避免創(chuàng)面粘連、減輕患者痛苦及方便使用等特點[14]。

BC因其具有超細纖維、高結(jié)晶度、高純度、高持水性、良好的機械性能、良好的生物相容性及生物可降解性，在醫(yī)學領域得到廣泛的應用，已成為極具潛力的新材料[15]。ε-PL在人體內(nèi)可分解為人體必需的賴氨酸，是一種營養(yǎng)型抑菌劑，其安全性優(yōu)于其他化學抑菌劑[16]。本研究將ε-PL吸附在BC中制備獲得聚賴氨酸/細菌纖維素抗菌敷料PLBC，評價材料的細胞毒性的實驗方法有很多種，其中CCK-8具有簡便、靈敏、快速等特點，結(jié)果客觀性強、重復性好，是目前體外評價生物材料增殖活性的最常用方法[17]。SRB法具備MTT法操作簡便、敏感的特點,同時測量結(jié)果不受時間影響,尤其適用于大規(guī)模藥物篩選及毒性評價[18]。L02細胞是人胚肝細胞，是細胞毒性實驗中的標準細胞之一[19-20]。 本研究通過采用SRB法和CCK-8法檢測抗菌敷料PLBC，根據(jù)國際醫(yī)療器械生物學評價之體外細胞毒性試驗細胞活性必須高于70%的標準，PLBC的細胞毒性在標準范圍內(nèi)，其細胞毒性符合國際標準。醫(yī)用生物敷料的溶血實驗是評價材料體外溶血活性、鑒定生物相容性的最基本實驗之一。本研究采用溶血實驗及全身毒性實驗檢測PLBC，發(fā)現(xiàn)其不引起溶血反應，無急性全身毒性反應，具有良好的生物相容性。微生物檢定法中測定藥物效價常用抑菌圈法，通過抑菌圈的大小來直觀展示藥物效價[21]。本研究通過抑菌圈法測定不同濃度的PLBC及空白組對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌三種菌株的抑菌性能，實驗結(jié)果顯示，BC本身不具備抗菌性能，PLBC的抑菌性能由吸附于BC的PL發(fā)揮，且抑菌性能隨PL濃度升高而增加。

本實驗制備的聚賴氨酸/細菌纖維素抗菌敷料PLBC體外無明顯細胞毒性，體內(nèi)不引起溶血反應，無急性全身毒性反應，具有良好的生物相容性及抗菌性能，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌等臨床常見菌株均有明顯的抑制作用且呈濃度依賴性，因此是一種理想的抗菌敷料。