孟 粉,秦求思,董 燁,毛海萍,戴志遠,2,3,*

(1.浙江工商大學海洋食品研究院,浙江杭州 310012;2.浙江省水產(chǎn)品加工技術研究聯(lián)合重點實驗室,浙江杭州 310012;3.海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,大連工業(yè)大學,遼寧大連 116034)

超聲波技術作為一種高效節(jié)能的加工技術,在食品加工中被廣泛應用。與傳統(tǒng)加工方式相比,超聲波加工具有能耗低、可控制性強、營養(yǎng)成分損失小等特點[1]。近年來超聲波技術在食品加工中主要用于改善或評估食品品質(zhì)、超聲提取、超聲清潔等方面[2]。周建偉等[3]從感官品質(zhì)、蛋白質(zhì)性質(zhì)、營養(yǎng)與安全性三個角度,研究發(fā)現(xiàn)超聲波技術與其他加工技術結(jié)合可用于改善牛肉及其制品的色澤、風味、營養(yǎng)、安全性。Wang等[4]研究發(fā)現(xiàn)超聲波處理可以調(diào)節(jié)蛋白酶活度和蛋白質(zhì)降解來改善牛肉的嫩度。Yeung等[5]研究發(fā)現(xiàn)超聲波可以通過降低肌肉纖維的剪切力來提高牛肉的嫩度。Annamaria等[6]研究發(fā)現(xiàn)超聲波可以增強魚糜制品的凝膠強度。李長樂[7]研究發(fā)現(xiàn)在一定的超聲時間范圍內(nèi),超聲波處理會提高鰹魚肌原纖維蛋白的溶解度與乳化性。

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(transglutaminase,TGase,EC.2.3.2.13)是一種生物類催化劑,被廣泛運用于食品加工中,沒有副產(chǎn)物生成,且不會使營養(yǎng)成分損失[8-9]。TGase可以催化蛋白質(zhì)上的ε-氨基與谷氨酸的γ-羥酰胺形成蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間交聯(lián),以增強蛋白質(zhì)三維網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)的形成[10]。婁忠緯[11]通過研究酶促交聯(lián)技術在重組魚肉開發(fā)中的應用,發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)分子在TGase作用下,高級結(jié)構(gòu)首先會被打開,子鏈之間發(fā)生相互交聯(lián),從而提高重組魚肉的凝膠強度;陳海華等[12]通過研究TGase對竹莢魚魚糜蛋白凝膠特性的影響,發(fā)現(xiàn)TGase能夠促進魚糜凝膠形成更加致密、均勻的凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu);孫京新等[13]通過研究TGase對帶魚魚糜制品質(zhì)構(gòu)特性的影響,發(fā)現(xiàn)可以通過適量添加TGase而達到要求的凝膠強度,且可有效改善低值魚魚糜制品特性;陳秋妹等[14]通過研究新型重組魚排及其低溫凝膠化作用,發(fā)現(xiàn)TGase可催化蛋白質(zhì)交聯(lián),生成超大蛋白分子,從而改善重組魚肉的凝膠強度。

目前國內(nèi)外學者對超聲波技術在魚糜制品中的研究較多,且TGase在魚糜加工中應用研究更為成熟,但兩者在草魚重組過程中的共同作用少見報道。本研究通過測定不同處理方式下重組魚肉分子間作用力、巰基含量、濁度、溶解率等,分析重組過程中超聲波和TGase對重組草魚肉理化性質(zhì)的影響,以了解超聲波和TGase在重組草魚肉過程中的作用機制,以期為草魚肉產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)提供一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮草魚(每條約2000 g,500 mm×100 mm) 購于杭州教工路物美超市;氯化鈉 食品級,購于杭州教工路物美超市;谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(TGase-B型) 食品級,江蘇一鳴生物有限公司;考馬斯亮藍R250 電泳級,上海如吉生物科技有限公司;考馬斯亮藍G250 分析純,碧云天生物科技有限公司;2-硝基苯甲酸、溴酚藍 分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

BSA124S-CW電子天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;恒溫水浴鍋(JOANLAB) 寧波市群安實驗儀器有限公司;美的多功能電磁爐 美的集團有限公司;紫外可見分光光度計 賽默飛世爾科技(中國)有限公司;BIO-RAD垂直電泳儀 伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品(上海)有限公司;FJ200-S均質(zhì)機 上海力辰科技有限公司;SPECTRA MAX190酶標儀 美國Molecular Devices美國分子儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備

1.2.1.1 魚肉前處理 鮮魚宰殺,去頭、去皮、去尾、去內(nèi)臟然后進行人工采肉。4 ℃冰水進行漂洗三次,再用0.15%鹽水漂洗1次,以促進魚肉脫水。吸干水分放入聚乙烯包裝袋中存于-18 ℃冰箱,一周內(nèi)使用。

1.2.1.2 制備重組魚肉 對照組:向100 g草魚碎肉中加入2 g NaCl(少量蒸餾水溶解);攪拌機混勻5 min,入模(4 cm×4 cm×2 cm),40 ℃下分別加熱0、30、60、90、120、150、180 min,下同。NaCl+TGase組:向100 g草魚碎肉中加入2 g NaCl和0.4 g TGase酶,混勻,入模,加熱;NaCl+超聲組:向100 g草魚碎肉中加入2 g NaCl,混勻,300 W下冰水超聲15 min,入模,加熱;NaCl+TGase+超聲組:向100 g草魚碎肉中加入2 g NaCl和0.4 g TGase,混勻,300 W下冰水超聲15 min,入模,加熱。

1.2.2 分子間作用力測定 參照Tan、張洪超等[15-16]方法,稍作修改,步驟一:取重組魚肉1 g加入20 mL的0.6 mol/L NaCl溶液,4 ℃靜置1 h,8000 r/min離心10 min,分離出上清液;步驟二:向步驟一沉淀中加入20 mL的0.6 mol/L NaCl(含1.5 mol·L-1尿素)溶液,同樣的方法靜置、離心、取上清液;步驟三:向步驟二沉淀中加入20 mL的0.6 mol/L NaCl(含8 mol/L尿素)溶液,同樣的方法靜置、離心、取上清液;步驟四:向步驟三沉淀中加入20 mL的0.6 mol/L NaCl(含8 mol/L尿素和0.5 mol/Lβ-巰基乙醇)溶液,同樣的方法靜置、離心、取上清液;步驟五:向步驟四沉淀中加入20 mL的0.5 mol/L NaOH溶液溶解;最后用考馬斯亮藍法測定所有上清液蛋白質(zhì)濃度,依次代表離子鍵、氫鍵、疏水相互作用、二硫鍵、非二硫鍵。每個樣品平行三次。

1.2.3 肌原纖維蛋白提取 參照周逸等[17]方法,稍作修改,稱取2 g重組魚肉,加入20 mL蒸餾水(4 ℃)均質(zhì)2 min并離心(8000 r/min、5 min),取沉淀加入20 mL 50 mmol/L KCl均質(zhì)1 min并離心(8000 r/min、5 min),取沉淀加入20 mL 0.6 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-馬來酸(pH7.0),勻漿后于4 ℃靜置1 h,離心(8000 r/min、10 min)取上清液。每個樣品平行三次。

1.2.4 巰基和活性巰基測定 參照曹淑敏、儀淑敏等[18-19]方法,稍作修改,提取出的肌原纖維蛋白溶液用0.6 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-馬來酸(pH7.0)稀釋至5 mg/mL?？値€基的測定:取此溶液1 mL,加入9 mL 0.2 mol/L的尿素緩沖溶液(pH6.8),混勻后加入0.1 mL 0.1%的2-硝基苯甲酸溶液,在40 ℃反應30 min后用紫外-可見分光光度計于412 nm波長處測定吸光度,用0.6 mol/L KCl溶液做空白?；钚詭€基的測定在不添加尿素的情況下進行。總巰基含量和活性巰基以蛋白質(zhì)計,單位mol/g,其中分子消光系數(shù)取13600 L/mol·cm。計算公式如下,每個樣品平行三次。

式中:A為412 nm處的吸光值;c為吸光系數(shù),其值為13600 L/mol·cm;11為稀釋倍數(shù);M為肌原纖維蛋白含量,mg/mL。

1.2.5 表面疏水性測定 參照張洪超[20]、Chelh[21]等方法,稍作修改,表面疏水性可用溴酚藍含量來表示。向1 mL肌原纖維蛋白液中加入200 μL 0.1%的溴酚藍,對照組用1 mL磷酸鹽緩沖液代替進行測定。25 ℃下反應10 min,然后4 ℃ 8000 r/min離心15 min。取500 μL上清液,用0.6 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-馬來酸(pH7.0)稀釋10倍后,595 nm波長處測定吸光值。溴酚藍在蛋白質(zhì)中的含量(μg)按以下公式計算,每個樣品平行三次。

1.2.6 濁度的測定 參照楊青[22]方法,用0.6 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-馬來酸(pH7.0)緩沖液將肌原纖維蛋白濃度調(diào)成2 mg/mL,然后在350 nm下測定吸光值,即為肌原纖維蛋白溶液的濁度,每個樣品平行三次。

1.2.7 蛋白質(zhì)溶解性測定 參照Benjakul等[23]的方法,取20 mL的 20 mmol/L的Tris-HCl緩沖液(含8 mol/L尿素、1%(W/V)SDS以及2%(V/V)β-巰基乙醇,pH8.0)加入1.2.1.2的樣品1 g,8000 r/min均質(zhì)2 min,均質(zhì)后的樣品沸水浴2 min,待冷卻至室溫后攪拌4 h,離心8000 r/min離心20 min。加入50%(W/V)的三氯乙酸(TCA)至10 mL上清液中,直至混合溶液濃度達到10%,4 ℃靜置18 h后8000 r/min離心20 min,用10% TCA(W/V)溶液多次沖洗沉淀物,待沉淀風干后,用30 mL 0.5 mol/L的NaOH溶液溶解沉淀,然后用考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量?？偟鞍缀渴侵亟M魚肉直接溶于30 mL 0.5 mol/L NaOH溶液中的蛋白質(zhì)含量,溶解度為溶解于混合溶劑中的蛋白占總蛋白的百分含量。每個樣品平行三次。

1.2.8 SDS-PAGE電泳 參照Lin[24]方法進行蛋白質(zhì)電泳,稱取3 g左右的重組魚肉樣品及消化后樣品,加入27 mL 5%(W/V)SDS和27 μL的β-巰基還原劑,均質(zhì)2 min,在80 ℃水浴條件下作用1.5 h,8000 r/min離心20 min取上清液,進行SDS-PAGE電泳。選用10%分離膠和4%濃縮膠,上樣量為10 μL,前30 min電壓為70 V,之后調(diào)為110 V至電泳結(jié)束,用考馬斯亮藍R250染色30 min,回收染色液,加入適量脫色液,脫色40 min后,更換脫色液,繼續(xù)脫色過夜。

1.3 數(shù)據(jù)分析

作圖采用Oringin 8.0軟件,平均值、標準差和顯著性水平均采用SPSS 21.0和Excel 2013軟件計算,顯著性分析的置信區(qū)間為95%。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組草魚肉形成過程中分子間作用力的變化

離子鍵是由兩個相反電荷的氨基酸殘基之間的靜電力,在蛋白質(zhì)聚集過程中通常表現(xiàn)為相互的排斥力[25]。由圖1可知,四組實驗離子鍵均隨著加熱時間的延續(xù)逐漸減小,這說明離子鍵不是重組魚肉形成過程的主要作用力,這與劉海梅等[26]研究結(jié)果一致;加入TGase樣品溶解蛋白質(zhì)值均小于不添加樣品組,這可能是因為TGase與蛋白質(zhì)殘基之間相互作用所引起的;經(jīng)過超聲后樣品溶解蛋白質(zhì)值小于不經(jīng)過超聲的樣品,可能是因為超聲波的空化作用和機械效應使蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間相互連接更緊密,與此同時超聲波也能加快TGase的擴散,促進蛋白質(zhì)殘基與TGase的交聯(lián)[27]。可見超聲波和TGase均可以減弱蛋白質(zhì)之間的排斥力,促進蛋白質(zhì)聚集,有利于重組草魚肉的形成,且兩者共同作用時效果更優(yōu)。

圖1 重組草魚肉形成過程中離子鍵的變化

氫鍵是蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間的相互作用力,也是維護蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的作用力。由圖2可知,在四種不同方式處理過程中溶解蛋白質(zhì)含量均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢,這說明在熱誘導后期氫鍵開始發(fā)生斷裂,同樣氫鍵也不是重組草魚肉形成的主要作用力,這與楊青[22]研究結(jié)果一致。

圖2 重組草魚肉形成過程中氫鍵的變化

疏水相互作用是指蛋白質(zhì)在水溶液中由水誘導的非極性基團之間的相互作用。目前普遍認為疏水作用力是蛋白凝膠形成過程中最主要的作用力之一[28]。由圖3可知,隨著加熱時間的延長，蛋白質(zhì)的疏水相互作用力逐漸增強,這可能因為熱誘導使包埋在蛋白質(zhì)里面的多肽鏈暴露在表面,從而促進蛋白質(zhì)的交聯(lián)作用,這與Takeda等[29]研究結(jié)果一致。加入TGase會影響蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)或脫酰胺作用,從而導致其分子結(jié)構(gòu)的變化,改變蛋白質(zhì)的疏水性,增強其疏水相互作用。加入TGase且超聲處理的樣品增加趨勢最顯著,可能是因為超聲波振動促進蛋白質(zhì)分子和TGase的交聯(lián)作用[26],因此超聲波和TGase均能增強疏水作用,即能促進重組草魚肉的形成,且兩者共同作用時效果更優(yōu)。

圖3 重組草魚肉形成過程中疏水相互作用的變化

二硫鍵主要由巰基基團氧化形成,是蛋白質(zhì)經(jīng)過熱誘導形成凝膠的最主要的共價鍵[30]。由圖4可知,隨著加熱時間的延長二硫鍵逐漸增多,可能是因為加熱使蛋白分子逐漸展開,內(nèi)部巰基逐漸暴露出來,并促進蛋白分子內(nèi)部的巰基形成二硫鍵[31]。且經(jīng)過超聲和加入TGase的樣品溶解蛋白質(zhì)含量更高,二硫鍵含量更高,這說明超聲波和TGase可以促進分子間或分子內(nèi)交聯(lián),故在重組草魚肉形成過程中均可起到積極作用。

圖4 重組草魚肉形成過程中二硫鍵的變化

非二硫鍵主要是由TGase與賴氨酸殘基形成ε-(γ-Glu)-Lys共價鍵[32]。由圖5可知,隨著加熱時間的延長,非二硫鍵逐漸增強,加入TGase且經(jīng)超聲處理后的樣品中溶解蛋白質(zhì)的含量比其它樣品高,這可能是因為超聲波促進蛋白質(zhì)分子展開,原來包埋在內(nèi)部的疏水性氨基酸殘基暴露在分子表面[25],從而促進TGase和賴氨酸殘基發(fā)生分子內(nèi)或分子間的交聯(lián)[33]。故超聲波和TGase兩者均可促進重組魚肉的形成,且兩者同時存在時效果最佳。

圖5 重組草魚肉形成過程中非二硫鍵的變化

綜上所述,超聲波和TGase均會對重組草魚肉分子間作用力產(chǎn)生影響,且這兩者都能促進重組草魚肉蛋白質(zhì)三維網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)的形成,從而促進草魚肉的重組,當兩者同時存在時,促進效果更明顯。

圖6 重組魚肉形成過程中肌原纖維蛋白總巰基的變化

2.2 重組草魚肉形成過程中巰基的變化

由圖6、圖7可知,隨著熱誘導時間的延續(xù),四種不同的處理方式樣品的總巰基和活性巰基均呈現(xiàn)下降趨勢,這可能是因為熱誘導促進更多巰基的暴露,且能使分子表面的巰基氧化形成二硫鍵[34]。經(jīng)過超聲后的樣品總巰基和活性巰基降低,可能是因為超聲波可以促進蛋白質(zhì)分子展開,巰基暴露,且超聲波產(chǎn)生的空化效應使水分解為高活性的羥自由基和氫原子,其中羥自由基會使蛋白質(zhì)的巰基減少[35],這與冷利萍[36]研究結(jié)果一致。巰基氧化形成的二硫鍵可以促進蛋白質(zhì)三維網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)的形成,進而促進草魚肉重組的形成。

圖7 重組魚肉形成過程中肌原纖維蛋白活性巰基的變化

2.3 重組草魚肉形成過程中表面疏水性的變化

表面疏水性可以反映疏水基團和極性環(huán)境的結(jié)合情況,即可以通過表面疏水性的變化來了解蛋白質(zhì)與其他分子間的相互作用情況及蛋白質(zhì)分子自身構(gòu)象的變化[37]。由圖8可知,隨著熱誘導時間的延續(xù),被結(jié)合的溴酚藍(BPB)的量略微增加,但整體變化不大,可能是因為加熱使部分肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)和構(gòu)象發(fā)生改變,從而使疏水性基團暴露,進而促進肌原纖維蛋白與BPB的結(jié)合[38]。NaCl+TGase+超聲的樣品結(jié)合BPB的能力更強,這可能是因為超聲波產(chǎn)生的空穴作用和機械作用可以促進蛋白質(zhì)分子展開及TGase分子的運動,使分子內(nèi)部更多的疏水性氨基酸殘基暴露出來,促進與BPB的結(jié)合[39]。故超聲波和TGase結(jié)合可以增加重組魚肉形成過程中肌原纖維蛋白表面疏水性,以促進重組草魚肉的形成。

圖8 重組魚肉形成過程中肌原纖維蛋白表面疏水性的變化

2.4 重組草魚肉形成過程中濁度的變化

在加熱過程中由于肌原纖維蛋白發(fā)生聚合,當生成足夠大的聚合物時引起光散射,從而使吸光值增加[40]。由圖9可知,隨著熱誘導時間的延續(xù),濁度呈現(xiàn)上升的趨勢,這可能是因為肌原纖維蛋白發(fā)生聚集,粒徑逐漸增加,從而導致光散射的增強,吸光值增加,這與陳雪珂[41]研究結(jié)果一致。由圖還可知,經(jīng)過超聲處理后的樣品濁度均高于對照組,這可能因為超聲波促進了蛋白質(zhì)分子間的相互交聯(lián),同時TGase在超聲波的作用下更能催化蛋白質(zhì)殘基間的結(jié)合[42]。故超聲波和TGase可以促進蛋白質(zhì)分子間或分子內(nèi)的聚集,從而促進重組魚肉的形成。

圖9 重組魚肉形成過程中肌原纖維蛋白濁度的變化

2.5 重組草魚肉形成過程中蛋白質(zhì)溶解率的變化

β-巰基乙醇、SDS和尿素的混合溶液可以使重組魚肉中除非二硫共價鍵(尤其是ε-(γ-Glu)-Lys共價鍵)外的所有化學鍵斷裂[43]。因此,該混合試劑測得的溶解率可以反映ε-(γ-Glu)-Lys共價鍵的多少。由圖10可知,隨著熱誘導的延續(xù)，蛋白質(zhì)溶解率均呈現(xiàn)下降趨勢,這說明重組魚肉在熱誘導過程中形成了非二硫共價鍵[30],這與前面測得非二硫共價鍵增加的結(jié)果一致,這些共價鍵可以產(chǎn)生高分子量聚合物,改變蛋白質(zhì)表面疏水性,從而影響其溶解率。NaCl+TGase+超聲樣品的溶解率明顯比另兩組樣品低,這可能是因為超聲波處理和TGase加入促進蛋白質(zhì)分子間和分子內(nèi)的交聯(lián),從而呈現(xiàn)出高的濁度和低的溶解率[44]。

圖10 重組魚肉形成過程中溶解率的變化

2.6 SDS-PAGE電泳

圖11 重組魚肉形成過程中SDS-PAGE電泳圖譜的變化

由圖11可知,只加入NaCl的樣品(A)隨著熱誘導的延續(xù)在200 kDa的肌原纖維蛋白重鏈(MHC)上的條帶有所變淡,經(jīng)超聲波處理后的樣品(B)變化更為明顯;這說明重組魚肉中蛋白質(zhì)的聚集反應主要發(fā)生在200 kDa的肌原纖維蛋白重鏈上,且超聲波在重組魚肉形成過程中起著積極的作用。比較A/C和B/D可知加入TGase的樣品隨著熱誘導的延續(xù)在MHC條帶顯著變淡,甚至消失,且經(jīng)超聲波處理后的樣品變化更為顯著;這說明大部分的TGase反應發(fā)生在肌球蛋白重鏈上即分子量為200 kDa,少量反應發(fā)生在副肌球蛋白鏈(PM)上即分子量為116.6 kDa,這與馬靜蓉等[45]研究結(jié)果一致;TGase催化肌球蛋白重鏈上谷氨酸的γ-羥酰胺基和賴氨酸的氨基形成共價鍵,在分子內(nèi)和分子間產(chǎn)生大量的共價交聯(lián)[46],形成大量的聚合物,不能輕易透過SDS-PAGE電泳凝膠,因此會導致MHC帶的降低甚至消失,這與Nakahara等[47]研究結(jié)果一致。故從電泳圖譜可看出超聲波和TGase均能促進蛋白質(zhì)分子的交聯(lián),且兩者同時存在時交聯(lián)效果更明顯,這也驗證了前面的實驗結(jié)果。

3 結(jié)論

四種處理方式均會對草魚肉重組過程中理化性質(zhì)產(chǎn)生影響,其中加入TGase并且超聲的樣品在形成過程中分子間作用力和表面疏水性最強、巰基含量最低、濁度最高、蛋白質(zhì)溶解率最低、SDS-PAGE電泳圖譜中肌原纖維蛋白重鏈上的條帶變化最明顯,這些指標的變化都表明該組樣品在重組過程中由于超聲作用和TGase的存在蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間發(fā)生了更多的交聯(lián),使其具有相對更優(yōu)的理化性質(zhì),因此重組草魚肉可以形成更穩(wěn)定的三維網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)。由此可知超聲波和TGase均能在重組草魚肉形成過程中起到積極的作用,且兩者共同作用時效果更優(yōu),對指導重組草魚肉產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)具有一定的參考價值。