何坤明,陳蘭轉(zhuǎn),孫光友,譚旺橋,白新鵬,*

(1.海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,熱帶多糖資源利用教育部工程研究中心,海南海口 570228;2.海南雅葆天維實(shí)業(yè)股份有限公司,海南海口 570000;3.海南大白康健醫(yī)藥股份有限公司,海南?？?570000)

山茱萸(CornusofficinalisSieb.et Zucc.)屬于山茱萸科山茱萸屬植物,產(chǎn)于河北、河南等地。山茱萸果肉中含有山萸甙、沒食子酸、皂甙、熊果酸等活性成分,維生素、氨基酸和礦物質(zhì)種類也十分豐富,應(yīng)用于六味地黃丸的研制[1]。山茱萸籽是山茱萸果剝?nèi)ド杰镙枪馐Ｏ碌墓?其栲膠、油脂、蛋白、糖類物質(zhì)含量相當(dāng)豐富[2-4]。

近年來植物多糖已成為實(shí)驗(yàn)研究的熱點(diǎn),多糖提取、純化[5-6]及抗氧化、抗腫瘤[7]等研究較多。山茱萸籽中的糖類物質(zhì)相當(dāng)豐富,大量的山茱萸籽中的糖類物質(zhì)未得到合理的利用,造成植物多糖資源的浪費(fèi)；廢物資源再利用一方面可以獲得多糖等副產(chǎn)品,一方面促進(jìn)種植戶增收。故本實(shí)驗(yàn)對(duì)山茱萸籽多糖進(jìn)行提取,并對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行研究。

多糖提取是基于相似相溶原理將多糖從生物體里分離出來的過程。常用的多糖提取方法有水提取法[8]、超聲波輔助提取法[9]、酸堿提取法等。水提取法提取率低、耗時(shí)長,酸堿提取法則易破壞多糖的空間結(jié)構(gòu)及其生物活性[10]。而亞臨界水提取法則具有綠色環(huán)保、得率高、省時(shí)、產(chǎn)物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。

亞臨界水是指溫度在沸點(diǎn)和臨界溫度之間,維持在適當(dāng)壓力狀態(tài)的水[11]。亞臨界水提取技術(shù)作為一種新型綠色提取技術(shù),目前在多糖、多酚、黃酮和花青素等天然產(chǎn)物提取得到廣泛應(yīng)用[12]。杜曉靜等[13]利用亞臨界水降解脫脂椰蓉制備可溶性膳食纖維發(fā)現(xiàn),與酶-化學(xué)法、超聲-化學(xué)法對(duì)比,亞臨界水提取具有較高的得率。李振梅等[14]利用亞臨界水同步提取茶籽油及茶皂素的工藝,通過氣相色譜-質(zhì)譜法分析發(fā)現(xiàn),與索氏提取法相比,實(shí)驗(yàn)提取的茶籽油不飽和脂肪酸含量更高,表明亞臨界水法提取的茶籽油品質(zhì)更優(yōu)，進(jìn)一步證實(shí)了亞臨界水提取裝置的高效性。馬若影等[15]利用亞臨界水提取紅心火龍果莖多糖發(fā)現(xiàn),對(duì)比超聲輔助法提取紅心火龍果莖多糖,亞臨界水提取多糖具有得率高、省時(shí)等優(yōu)點(diǎn)。

本研究以山茱萸籽粕為原料,建立山茱萸籽粕亞臨界水降解動(dòng)力學(xué)模型,得到降解動(dòng)力學(xué)參數(shù),通過亞臨界水提取,進(jìn)一步分離得山茱萸籽多糖,對(duì)其理化性質(zhì)、形態(tài)、結(jié)構(gòu)組成、抗氧化活性等方面進(jìn)行了初步研究,為山茱萸籽的綜合開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山茱萸籽 購于河南南陽(西峽縣山茱萸種植基地,2018年10月);無水乙醇、葡萄糖、碳酸鈉、石油醚 西隴科學(xué)股份公司;沒食子酸、濃硫酸、苯酚 廣州化學(xué)試劑廠;福林酚試劑 北京索萊寶科技有限公司；以上試劑均為分析純。

HT-250FC型亞臨界水設(shè)備 上?；敉?shí)驗(yàn)儀器有限公司;GL-20G-11型高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;752N型紫外可見分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司;FDU-2100型冷凍干燥機(jī) 埃朗科技國際貿(mào)易(上海)有限公司;Agilent1100高效液相色譜儀,配DAD檢測(cè)器 安捷倫科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 山茱萸籽粕成分測(cè)定 山茱萸籽80 ℃烘干、粉碎過60目篩,索氏提取脫脂得山茱萸籽粕,干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

水分測(cè)定:GB 5009.3-2010,灰分測(cè)定:GB 5009.4-2016,纖維素、半纖維素、木質(zhì)素測(cè)定:范式Van Soest分析法[16]。

1.2.2 亞臨界水降解山茱萸籽粕實(shí)驗(yàn)研究 精確稱取山茱萸籽粕5.0 g,量取200 mL蒸餾水,放入亞臨界反應(yīng)釜中,按照設(shè)定的降解溫度、降解時(shí)間,對(duì)山茱萸籽粕進(jìn)行亞臨界水降解,降解結(jié)束,迅速用冰塊冷卻至常溫,抽濾得殘?jiān)鸵簯B(tài)產(chǎn)物,殘?jiān)娓筛稍锲鞅４鎮(zhèn)溆?液態(tài)產(chǎn)物于棕色試劑瓶保存?zhèn)溆谩?/p>

考察不同降解溫度(100、120、140、160、180、200 ℃)和不同降解時(shí)間(5、10、20、30、40、50 min)的條件下,固定單因素條件為160 ℃、降解時(shí)間20 min,對(duì)山茱萸籽粕亞臨界水降解還原糖產(chǎn)率進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.3 液態(tài)產(chǎn)物中還原糖產(chǎn)率測(cè)定 采用3,5-二硝基水楊酸法[17]測(cè)定液態(tài)產(chǎn)物中還原糖濃度,以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品,在波長540 nm處測(cè)定液態(tài)產(chǎn)物的吸光度值,標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=11.014x+0.0373(決定系數(shù)R2=0.9948,線性范圍在0～0.10 μg/mL)。其還原糖產(chǎn)率計(jì)算公式如下:

式(1)

式中:C為還原糖濃度(g/L);m0為山茱萸籽粕中半纖維素含量(g);V為液態(tài)產(chǎn)物總體積(mL);n為稀釋倍數(shù)。

1.2.4 動(dòng)力學(xué)模型建立 目前,國內(nèi)外研究學(xué)者采用Saeman模型對(duì)木質(zhì)纖維素類進(jìn)行亞臨界水降解實(shí)驗(yàn)研究[18-20],主要反應(yīng)過程如下:

半纖維素→低聚糖→單糖→降解物

本實(shí)驗(yàn)探究山茱萸籽粕在亞臨界水中其纖維素、半纖維素類物質(zhì)降解為小分子還原糖,最終得到降解產(chǎn)物。在動(dòng)力學(xué)方程中,還原糖的量為水解糖的總量,建立一級(jí)連串均相反應(yīng)模型。

山茱萸籽粕(h)→還原糖(s)→降解物(d)

式(2)

式(3)

式中:k1為山茱萸籽粕降解為還原糖的反應(yīng)速率常數(shù)(min-1);k2為還原糖分解的反應(yīng)速率常數(shù)(min-1);Ch為山茱萸籽粕半纖維素濃度(g/L);Cs為山茱萸籽粕還原糖濃度(g/L)。設(shè)t=0時(shí),Cs為0,對(duì)式(2)和(3)進(jìn)行積分得:

Ch=Ch0exp(-k1t)

式(4)

式(5)

1.2.5 動(dòng)力學(xué)參數(shù)的確定 將山茱萸籽粕降解實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)Ch、Cs、Cd代入式(6),通過曲線擬合求解得出100、120、140、160、180、200 ℃的速率常數(shù)k1和k2,將k1和k2數(shù)值代入Arrhenius方程[21]:

式(6)

式中,Ch0代表山茱萸籽粕降解前的半纖維素濃度(g/L)。

式(7)

式中:Ki0為指前因子(min-1);T為降解溫度(K);R為氣體常數(shù);Eai為反應(yīng)活化能(kJ/mol)。

式(7)取對(duì)數(shù)得:lnki=lnki0-Eai/(RT),可以看出lnki與T-1是線性關(guān)系,對(duì)lnki與T-1作一條擬合的直線,得到擬合直線方程,方程的截距為Ki0,斜率為Eai。

1.2.6 山茱萸籽粕殘?jiān)螒B(tài)、轉(zhuǎn)化率及液態(tài)產(chǎn)物pH變化 為進(jìn)一步分析判斷山茱萸籽粕亞臨界水降解程度,對(duì)山茱萸籽粕殘?jiān)螒B(tài)、轉(zhuǎn)化率及液態(tài)產(chǎn)物pH變化進(jìn)行觀察、測(cè)定。采用電鏡掃描觀察在降解溫度100、120、140、160、180、200 ℃及降解時(shí)間5、10、20、30、40、50 min降解后殘?jiān)螒B(tài)的變化,并計(jì)算其轉(zhuǎn)化率。液態(tài)產(chǎn)物pH測(cè)定采用pH計(jì)。

式(8)

式中:m為降解后殘?jiān)|(zhì)量(g);M為原料質(zhì)量(g)

1.2.7 液態(tài)產(chǎn)物山茱萸籽多糖單糖組成分析 取液態(tài)產(chǎn)物濃縮至原體積1/5左右,加入4倍體積的無水乙醇,4 ℃放置12 h,6000 r/min離心5 min,沉淀冷凍干燥得到山茱萸籽多糖[22]。

稱取10 mg多糖樣品于20 mL的鉗口瓶中,加入5 mL的2 mol/L TFA,充N2封管(10 L/min,1 min),100 ℃烘箱中水解2 h;冷卻后打開蓋,取1 mL水解液加入1 mL甲醇后,70 ℃水浴下用N2吹干,如此重復(fù)加甲醇并用N2吹干2次,以去除TFA;加入1 mL NaOH(0.3 mol/L)充分溶解殘?jiān)?為多糖水解液,稀釋后衍生測(cè)定。

游離單糖的提取:稱取多糖干樣0.4 g、多糖濕樣1.5 g于具塞刻度管中,加入10 mL 80%乙醇,70 ℃下超聲提取30 min;10000 r/min離心,取上清液用80%乙醇定容至10 mL,然后取2 mL加入試管N2吹干,之后加入1 mL NaOH(0.3 mol/L)溶解殘?jiān)?/p>

單糖衍生化:分別取400 μL的混合單糖標(biāo)準(zhǔn)液或多糖水解液于5 mL的具塞試管中,加400 μL PMP甲醇溶液,于70 ℃水浴2 h;取出放置至常溫;加400 μL HCl(0.3 mol/L)于混合液,至pH6～7;加蒸餾水1200 μL,再加等體積的氯仿溶液,渦旋混勻振搖,靜置,分離水相,重復(fù)2次以上。采用0.45 μm微孔膜(水系)過濾水相,然后供HPLC進(jìn)樣分析。

色譜條件:色譜柱C18柱,250 mm×4.6 mm,粒度5 μm;流動(dòng)相A:100 mmol/L 磷酸鈉緩沖液(pH=6.4);流動(dòng)相B:乙腈;進(jìn)樣量20 μL;檢測(cè)波長:250 nm;柱溫30 ℃;流速1 mL/min。

1.2.8 傅里葉紅外光譜分析 將山茱萸籽多糖和KBr按比例1∶40混合研磨,壓片機(jī)壓片。樣品測(cè)試前進(jìn)行背景掃描去除干擾,500～4000 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行空白掃描。

1.2.9 掃描電鏡分析 取1 mg山茱萸籽多糖,粘在掃描電鏡樣品盤上,用吹塵球吹掉多余樣品,噴金,觀察樣品表觀結(jié)構(gòu)。

1.2.10 抗氧化活性分析

1.2.10.1 DPPH自由基清除率測(cè)定 參考Vilma等[23]的方法,將3 mL乙醇溶解的DPPH(0.1 mmol/L)溶液加入到不同質(zhì)量濃度(0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL)的2 mL多糖樣品溶液中。將溶液搖勻,避光水浴30 min,在517 nm處測(cè)定吸光值。

式(9)

式中,A1為樣品或VC+3 mL DPPH溶液的吸光值;A2為待測(cè)溶液+3 mL無水乙醇后的吸光值;A0為空白對(duì)照,2 mL的蒸餾水+3 mL DPPH溶液的吸光值。

1.2.10.2 羥自由基清除率測(cè)定 參考王新等[24]的方法,分別在2 mL不同質(zhì)量濃度(0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL)多糖樣品溶液中加入1 mL FeSO4(6 mmol/L)溶液和1 mL H2O2(6 mmol/L),靜置10 min,然后加入1 mL無水乙醇(6 mmol/L)溶解的水楊酸,靜置反應(yīng)30 min,在510 nm處測(cè)定吸光值。

式(10)

式中,A1為樣品或者VC溶液反應(yīng)后的吸光值;A2為待測(cè)溶液+2 mL蒸餾水+1 mL無水乙醇后的吸光值;A0為空白對(duì)照,即2 mL的待測(cè)溶液換為2 mL的蒸餾水后的吸光值。

1.2.10.3 ABTS自由基清除率測(cè)定 參考管瑛等[25-26]的方法,稱取0.384 g ABTS和0.066 g過硫酸鉀,蒸餾水溶解定容至100 mL,然后在室溫下避光靜置12 h。將10 mL ABTS溶液用0.01 mol/L pH7.4 PBS緩沖液稀釋50倍,使其在734 nm處的吸光度值約為0.7。將1 mL不同濃度的樣品溶液轉(zhuǎn)移到1 mL蒸餾水和2 mL稀釋的ABTS溶液中,搖勻,置于室溫黑暗中靜置6 min,然后在734 nm處測(cè)量吸收值。

表1 原料及殘?jiān)闹饕煞?%)

式(11)

式中:A1為樣品或者VC溶液與ABTS溶液反應(yīng)后的吸光值;A2為待測(cè)溶液+3 mL蒸餾水的吸光值;A0為空白對(duì)照,即1 mL的待測(cè)溶液換為1 mL的蒸餾水后的吸光值。

圖1 不同降解溫度下的還原糖產(chǎn)率

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理,所有數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。采用Origin軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料及降解殘?jiān)饕煞址治?/h3>

利用范式分析法及國標(biāo)測(cè)定原料(山茱萸籽粕)和160 ℃、20 min降解條件下的殘?jiān)饕煞?結(jié)果如表1所示,由表1可知,本實(shí)驗(yàn)降解的主要成分是半纖維素,原因是在亞臨界水條件下(160 ℃、20 min)引起山茱萸籽粕中半纖維素降解為還原糖。纖維素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由20.34%升至45.10%,原因可能是山茱萸籽粕在亞臨界水降解下,植物細(xì)胞壁等結(jié)構(gòu)受到破壞,導(dǎo)致更多的纖維素裸露。

2.2 亞臨界水動(dòng)力學(xué)參數(shù)的確定

不同降解溫度、降解時(shí)間下,實(shí)驗(yàn)值(Exp)與模型計(jì)算值(Cal)見圖1,對(duì)于本實(shí)驗(yàn)探究的降解溫度,實(shí)驗(yàn)值與模型計(jì)算值較為接近,說明Saeman模型能很好解釋山茱萸籽粕亞臨界水降解過程,其半纖維素降解遵循一級(jí)連串降解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型。在100、120、140 ℃降解溫度時(shí),隨著時(shí)間延長,還原糖產(chǎn)率逐漸增大,當(dāng)溫度在160 ℃以上時(shí),還原糖產(chǎn)率隨著時(shí)間延長呈現(xiàn)先增大后降低趨勢(shì)。可能是在高溫狀態(tài)下,山茱萸籽粕中的半纖維素在短時(shí)間內(nèi)大部分降解完畢,而還原糖產(chǎn)量下降可能是山茱萸籽粕中的半纖維素基本降解完全,此時(shí)的溫度又不足以打斷纖維素的糖苷鍵,因此還原糖生成量低于其降解量[27]。

由圖1可知,180和200 ℃溫度下,還原糖產(chǎn)率達(dá)到最大值時(shí),時(shí)間太短,然后急劇下降。在100～160 ℃溫度中,相同時(shí)間內(nèi),160 ℃下還原糖產(chǎn)率較高,故選取降解溫度為160 ℃、降解時(shí)間為20 min。

將山茱萸籽粕降解的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)代入式(6),通過擬合得到100～200 ℃下的k1和k2。結(jié)果如表2所示,其中R2為曲線擬合決定系數(shù)。

表2 山茱萸籽粕在不同溫度下亞臨界水降解的k1和k2值

圖2 山茱萸籽粕亞臨界水降解lnk與1/T的關(guān)系

取擬合直線方程的截距和斜率分別用于求Ki0和Eai,結(jié)果如表3所示:

表3 山茱萸籽粕亞臨界水降解的指前因子和反應(yīng)活化能

2.3 山茱萸籽粕殘?jiān)螒B(tài)變化

原料和在降解時(shí)間20 min條件下,不同降解溫度下的殘?jiān)鼟呙桦婄R變化如圖3可知,山茱萸籽粕原料堆疊呈無規(guī)則顆粒狀,粒徑大小不一的球狀結(jié)構(gòu)物。經(jīng)100 ℃降解后,結(jié)構(gòu)表面呈多孔狀,覆蓋在表面的球狀物發(fā)生脫落,早期骨架形成。120 ℃降解后,殘?jiān)Y(jié)構(gòu)出現(xiàn)片狀結(jié)構(gòu)物,覆蓋在結(jié)構(gòu)表面的球狀物完全脫落。140 ℃降解后,殘?jiān)Y(jié)構(gòu)呈現(xiàn)多孔狀,但骨架較為緊湊。160～180 ℃降解后,殘?jiān)Y(jié)構(gòu)開始出現(xiàn)疏松多孔狀,骨架也出現(xiàn)了斷裂,無規(guī)則狀。200 ℃降解后,殘?jiān)Y(jié)構(gòu)連接物斷裂,呈稀碎、無規(guī)則堆積狀[28]。

圖3 原料和不同降解溫度下的殘?jiān)鼟呙桦婄R圖(2000×)

在降解溫度160 ℃、料液比為1∶40條件下,原料和不同降解時(shí)間下的殘?jiān)鼟呙桦婄R變化如圖4可知,與原料相比,不同降解時(shí)間,殘?jiān)Y(jié)構(gòu)表觀各不相同,5 min時(shí)初步生成片狀物,球狀物出現(xiàn)脫落。10 min時(shí)骨架基本形成,架構(gòu)較為緊密。20 min時(shí)球狀物基本完全脫落,呈現(xiàn)多孔狀,但骨架較為緊湊。30～50 min時(shí)骨架基本斷裂,呈稀碎、無規(guī)則堆積狀。

圖4 原料和不同降解時(shí)間下的殘?jiān)鼟呙桦婄R圖(2000×)

2.4 山茱萸籽粕轉(zhuǎn)化率的變化

為進(jìn)一步分析判斷山茱萸籽粕亞臨界水降解程度,對(duì)其不同溫度、不同時(shí)間條件下的轉(zhuǎn)化率進(jìn)行測(cè)定。由圖5可知,降解溫度、降解時(shí)間對(duì)山茱萸籽粕亞臨界水降解有著顯著的影響,不同溫度下的轉(zhuǎn)化率在剛開始時(shí)差異顯著的原因是在短時(shí)間內(nèi),隨著降解溫度升高,山茱萸籽粕亞臨界水降解程度增大,山茱萸籽粕結(jié)構(gòu)被破壞程度增大,多糖、蛋白質(zhì)等大分子發(fā)生更大程度溶出。當(dāng)降解時(shí)間為5 min時(shí),降解溫度由100 ℃提高到200 ℃,轉(zhuǎn)化率由35.20%提高到65.21%,轉(zhuǎn)化率提高了46.02%。當(dāng)降解時(shí)間為50 min時(shí),降解溫度由100 ℃提高到200 ℃,轉(zhuǎn)化率由44.90%提高到67.10%,轉(zhuǎn)化率提高了33.08%。原因可能是隨著降解溫度升高和降解時(shí)間延長,山茱萸籽粕空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,由原來堆疊緊密變?yōu)槭杷啥嗫谞?其表面的球狀物多糖、蛋白質(zhì)等分子溶出。

圖5 降解溫度和時(shí)間對(duì)山茱萸籽粕轉(zhuǎn)化率的影響

2.5 液態(tài)產(chǎn)物pH的變化

液態(tài)產(chǎn)物pH測(cè)定能進(jìn)一步判斷山茱萸籽粕亞臨界水降解程度大小。由圖6可知,隨著降解時(shí)間的增長,液態(tài)產(chǎn)物pH逐漸下降,在前20 min內(nèi)下降趨勢(shì)較顯著,20 min后下降趨勢(shì)較為平緩,甚至保持不變。降解溫度越高,pH下降趨勢(shì)越顯著,原因可能是在亞臨界水降解下,溫度越高,水分直接相互作用越強(qiáng)烈,從而加速催化降解速率,山茱萸籽粕結(jié)構(gòu)被破壞程度增大,對(duì)應(yīng)還原糖產(chǎn)率略微升高,半纖維素分解速率略微增大。pH下降原因與山茱萸籽粕的半纖維素中含有乙酰基團(tuán),反應(yīng)初期水解產(chǎn)生大量乙酸有關(guān)[29-31]。

圖6 液態(tài)產(chǎn)物pH的變化

2.6 山茱萸籽多糖單糖組成

單糖組成的分析在植物多糖的結(jié)構(gòu)與功效、中藥材的檢測(cè)與鑒定等方面有著十分重要的作用[32],為了進(jìn)一步探究山茱萸籽多糖的結(jié)構(gòu)與功效,對(duì)其多糖組成進(jìn)行進(jìn)一步分析。多糖標(biāo)品的高效液相色譜圖見圖7。由表4和圖8可知,山茱萸籽多糖單糖組成中葡萄糖含量最高,含量達(dá)33.58%,其次是木糖,含量16.75%,半乳糖含量14.54%。

表4 山茱萸籽多糖的單糖組成

圖7 多糖標(biāo)品的高效液相色譜圖

圖8 山茱萸籽多糖的單糖組成

2.7 傅里葉紅外光譜分析

從圖9可以看出,山茱萸多糖在4000～500 cm-1區(qū)域具有多糖吸收的一般特征。在3424 cm-1處,由于多糖間羥基的O-H伸縮振動(dòng),導(dǎo)致吸收峰寬而強(qiáng)。1618.29 cm-1處的弱吸收峰為結(jié)合水的多糖水化振動(dòng)吸收峰。1341.04 cm-1處的弱吸收峰為烷基的C-H變角度振動(dòng)吸收峰。1150～1050 cm-1的前緣為吡喃糖苷環(huán)骨架的C-O可變角度振動(dòng)吸收峰,說明分子中存在C-O-H和C-O-C結(jié)構(gòu)[33]。757.90 cm-1處出現(xiàn)一個(gè)微弱的吸收峰,推測(cè)其含有吡喃糖環(huán)結(jié)構(gòu)[34],且由單糖組成分析可知,其含有葡萄糖、半乳糖等具有吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)的糖苷鍵。

圖9 山茱萸籽多糖的紅外吸收光譜圖

圖10 山茱萸籽多糖掃描電鏡圖(左700×、右2000×)

2.8 掃描電鏡分析

山茱萸籽多糖的微觀結(jié)構(gòu)見圖10,山茱萸籽多糖結(jié)構(gòu)呈表面光滑,無規(guī)則顆粒狀,粒徑大小不一的球狀結(jié)構(gòu)物,在山茱萸籽粕掃描電鏡圖中得到證實(shí)。其球狀結(jié)構(gòu)物相互堆疊,相互緊靠。掃描電鏡圖表明在亞臨界水降解溫度160 ℃、降解時(shí)間20 min情況下,山茱萸籽多糖結(jié)構(gòu)完整。

2.9 抗氧化活性分析

2.9.1 DPPH自由基的清除率測(cè)定 如圖11所示,在質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL時(shí),自由基清除率為75.63%,在0.2～1.0 mg/mL范圍內(nèi)增長較為緩慢,1.0 mg/mL時(shí),清除率達(dá)到最大值85.61%。而標(biāo)準(zhǔn)品VC對(duì)DPPH自由基的清除率高達(dá)96.60%。

圖11 山茱萸籽多糖清除DPPH自由基的能力

2.9.2 羥自由基的清除率測(cè)定 如圖12所示,山茱萸籽多糖對(duì)羥自由基清除率隨著質(zhì)量濃度的增加呈快速增長趨勢(shì),在濃度達(dá)到0.8 mg/mL后,增長趨勢(shì)較為平緩,在1 mg/mL時(shí)清除率達(dá)到最大值63.40%。而標(biāo)準(zhǔn)品VC對(duì)羥自由基自由基的清除率高達(dá)90.21%。

圖12 山茱萸籽多糖清除羥自由基的能力

2.9.3 ABTS自由基清除率測(cè)定 如圖13所示,在質(zhì)量濃度0～1.0 mg/mL范圍內(nèi),山茱萸籽多糖對(duì)ABTS自由基清除率逐漸增大,在1 mg/mL時(shí)達(dá)到最大值76.20%。標(biāo)準(zhǔn)品VC對(duì)羥基自由基的清除率達(dá)97.80%。

圖13 山茱萸籽多糖清除ABTS自由基的能力

3 結(jié)論

經(jīng)過實(shí)驗(yàn)研究,Saeman模型能較好地反映亞臨界水降解山茱萸籽粕的過程,降解溫度和降解時(shí)間是還原糖產(chǎn)率的主要影響因素,在降解溫度160 ℃、降解時(shí)間20 min條件下,能得到產(chǎn)量較高的還原糖。單糖組成分析結(jié)果表明,主要由、葡萄糖、木糖、半乳糖等組成;結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明,山茱萸籽多糖結(jié)構(gòu)呈表面光滑,無規(guī)則,粒徑大小不一的球狀結(jié)構(gòu)物,為吡喃型糖苷環(huán)骨架,多糖結(jié)構(gòu)完整;抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,山茱萸籽多糖具有一定的抗氧化活性,隨著多糖濃度的增加,其抗氧化活性逐漸增強(qiáng)。試驗(yàn)結(jié)果為山茱萸籽多糖的進(jìn)一步分離純化和理化特性、形態(tài)結(jié)構(gòu)的分析提供了參考。