劉勝先,杜文靜,崔寶程,黃 姣,郭 祎,王 黎

(大連理工大學生命科學與藥學學院,遼寧盤錦 124221)

酰胺類物質(zhì)是重要的精細化工原料和醫(yī)藥中間體。腈水合酶(Nitrile Hydratase,NHase,EC 4.2.1.84)是一種能夠催化腈類化合物水合成酰胺類化合物的金屬酶,具有很高的工業(yè)應用價值[1-2]。NHase廣泛存在于微生物群體中,如紅球菌(Rhodococcussp.)、假單胞菌(Pseudomonassp.)、假諾卡氏菌(Pseudonocardiasp.)、農(nóng)桿菌(Agrobacteriumsp.)、芽孢桿菌(Bacillussp.)、棒桿菌(Corynebacteriumsp.)及短桿菌(Brevibacteriumsp.)等微生物中[3-4]。與傳統(tǒng)的化學合成法相比,采用腈水合酶生物催化法生產(chǎn)酰胺類化合物具有反應條件溫和,專一性強,催化效率高的優(yōu)勢,同時反應在常溫常壓下進行,污染少,相對設備投資低,克服了很多化學生產(chǎn)的不足[5-6]。目前,在發(fā)達國家如美國、日本等,利用腈水合酶生產(chǎn)酰胺類物質(zhì)這項生物技術正在逐步取代傳統(tǒng)的化學法[7-8]。

目前,采用腈水合酶生物法生產(chǎn)酰胺化合物有一部分是采用野生菌細胞,但是用從自然界土壤取樣分離篩選獲得野生產(chǎn)酶菌株的方式獲得高產(chǎn)酶菌株具有偶然性很大、成功率極低、酶活力差等局限性[9],且大多數(shù)野生腈水合酶產(chǎn)生菌也會產(chǎn)酰胺酶,酰胺酶會使腈水合酶催化的產(chǎn)物酰胺轉(zhuǎn)化為相應的酸,從而在一定程度上降低酰胺的產(chǎn)量[10-11]。因此通過基因克隆手段獲得高效表達腈水合酶的基因工程菌具有很多野生菌不可替代的優(yōu)點,基因工程菌中腈水合酶基因可單獨克隆,不會相互干擾,不會因產(chǎn)酸降低了發(fā)酵液的pH而抑制酶的活性,基因工程菌背景清晰,利于對基因表達調(diào)控機理進行深入研究,同時它的適應性強、發(fā)酵周期短、易于實現(xiàn)大規(guī)模培養(yǎng)和工業(yè)化生產(chǎn),有著更廣闊的應用前景[3,12]。

丙烯酰胺和己二酰二胺是重要的精細化工原料和醫(yī)藥中間體,在化工生產(chǎn)中是一種非常重要的原料,其需求量大且用途廣[13-15]。用生物法生產(chǎn)丙烯酰胺和己二酰二胺符合綠色化工中經(jīng)濟環(huán)保理念,是一種必然的趨勢,但野生型菌株普遍存在穩(wěn)定性低活性低的問題,工業(yè)化應用仍十分有限[16-19]。在我國,腈水合酶生成酰胺的生物技術雖然起步較晚但發(fā)展很快,但隨著市場的不斷拓展,對酰胺的需求仍在不斷增長,仍需要大量的進口。因此急需拓展高效產(chǎn)腈水合酶菌來彌補國內(nèi)行業(yè)不足和空缺[20]。

睪丸酮叢毛單胞菌Comamonastestosteroni5-MGAM-4D被發(fā)現(xiàn)具有腈水合酶基因[21-22],但野生型菌株對腈類物質(zhì)的催化活性遠低于發(fā)達國家已工業(yè)化應用的R.rhodochrousJ1以及Pseudomonasputida來源的腈水合酶[23-24]。本研究以野生菌Comamonastestosteroni5-MGAM-4D來源的腈水合酶基因為研究對象,通過基因工程手段構建高效表達腈水合酶的基因重組菌CtNHase,探討基因重組菌CtNHase對腈類化學物的生物轉(zhuǎn)化活性,以期為工業(yè)化應用的發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

CtNHase基因序列 GenBank AY743666.1;PCR引物、載體pET-24a(+) 常州基宇生物技術有限公司合成;大腸桿菌 本實驗室保藏;丙烯腈 色譜純,上海生工生物工程有限公司;己二腈、丙烯酰胺、己二酰二胺、乙酰胺 分析純,上海麥克林生化科技有限公司;甲醇 色譜純,上海麥克林生化科技有限公司;胰蛋白胨、酵母提取物 美國Thermo Fisher Scientific公司;IPTG、卡那霉素 上海生工生物工程有限公司;瓊脂糖凝膠DNA柱式回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒 日本TaKaRa公司;電泳相關試劑 均為國產(chǎn);LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L(固體培養(yǎng)基再加入瓊脂粉20 g/L),高壓滅菌后需加入終濃度為50 μg/mL的卡那霉素再使用。

PCR儀 日本TaKaRa公司;分析天平 德國Sartorius集團;恒溫搖床 上海智城分析儀器制造有限公司;超凈工作臺 上海尚道儀器制造有限公司;電泳系統(tǒng) 北京六一儀器廠;低溫冷凍離心機、超低溫冰箱 美國Thermo Fisher Scientific公司;pH計 上海雷磁儀器廠;S6000高效液相色譜儀 華譜科儀科技有限公司;氣相色譜儀 大連中匯達科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 質(zhì)粒CtNHase的構建

1.2.1.1 目的基因擴增PCR引物 Forward:TTGTTT AACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGGGCAATCAC ACACGCATGACCACCATCG;引物Reverse:AGCCGG ATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCACAA GCCCCAGCGACGCCACCA(5′-3′);PCR反應過程為:在98 ℃預變性3 min后開始循環(huán),98 ℃變性10 s,55 ℃退火15 s,72 ℃延伸60 s,共30個循環(huán);于72 ℃下終延伸10 min。最后采用瓊脂糖凝膠電泳驗證擴增結果并對產(chǎn)物進行回收。

1.2.1.2 鏈接載體 采用限制性內(nèi)切酶 NdeI和XhoI使載體pET-24a線性化;利用無縫克隆技術將載體與擴增后目的基因片段鏈接。

1.2.1.3 轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞 通過低溫和鈣離子刺激制備E.coliTOP 10感受態(tài)細胞,取一支感受態(tài)細胞于冰上,待溶解后加入10 μL連接液,輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物,在冰中放置30 min;將離心管放到預加溫到42 ℃的恒溫水浴鍋中熱激90 s,然后快速將離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中,使細胞冷卻2～3 min;每管加900 μL LB培養(yǎng)液,將其轉(zhuǎn)移到37 ℃搖床上,溫育1 h使細菌復蘇;取恰當量的轉(zhuǎn)化菌液按不同濃度梯度涂布于固體LB平板上,倒置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)16 h。

1.2.1.4 菌落PCR鑒定轉(zhuǎn)化子 挑取平板上長出的轉(zhuǎn)化子重懸于10 μL LB液體培養(yǎng)基中,從中取1 μL做模板進行菌落PCR鑒定。引物Forward:TTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGGGC AATCACACACGCATGACCACCATCG;引物Reverse:TGGTGGCGTCGCTGGGGCTTGTGACTCGAGCACCAC CACCACCACCACTGAGATCCGGCT(5′-3′)。PCR反應過程為:在94 ℃預變性5 min后開始循環(huán),94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,共30個循環(huán);于72 ℃下終延伸10 min。最后采用瓊脂糖凝膠電泳驗證擴增結果并對產(chǎn)物進行回收。

1.2.1.5 陽性克隆酶切驗證 將陽性克隆擴增培養(yǎng)通過質(zhì)粒小提試劑盒進行回收,采用限制性內(nèi)切酶XhoI和MluI對重組質(zhì)粒進行酶切,并采用瓊脂糖凝膠電泳驗證結果。

1.2.2 重組菌誘導培養(yǎng)及表達驗證 選擇常規(guī)表達菌種E.coliBL21(DE3)和低溫誘導表達菌E.coli Arctic Expression(DE3)同時進行重組質(zhì)粒的表達驗證,具體步驟如下。

1.2.2.1 菌體培養(yǎng) 將質(zhì)粒1 μL分別加入100 μL BL21(DE3)和Arctic Expression(DE3)感受態(tài)細菌中,置于冰上20 min;42 ℃熱激90 s,迅速置于冰中，3 min后加入600 μL LB培養(yǎng)液;37 ℃,220 r/min振搖培養(yǎng)1 h,取200 μL菌液涂布于含50 μg/mL Kan的LB固體平板,37 ℃倒置培養(yǎng)過夜;次日挑取2個BL21(DE3)和1個Arctic Expression(DE3)的單克隆分別接種于含50 μg/mL Kan的4 mL LB液體培養(yǎng)基的搖菌管中,37 ℃ 220 r/min振搖培養(yǎng)8 h左右,后轉(zhuǎn)移至含100 mL錐形瓶中擴增培養(yǎng)至OD值約0.6～0.8;分別加入Co2+使其終濃度0.05 g/L,BL21(DE3)一管不加IPTG做陰性對照,一管加IPTG至終濃度為1 mmol/L,37 ℃誘導3 h。Arctic Expression(DE3)的單管加IPTG至終濃度0.1 mmol/L,16 ℃誘導過夜;次日,4000×g,10 min離心去上清收集菌體。

1.2.2.2 菌體破碎 將離心后的菌體重懸于20 mmol/L PBS(pH7.4)緩沖液中,冰浴超聲破碎。設置條件為300 W功率,破碎2 s,間隔5 s,共50個循環(huán)。完成后18000×g離心20 min分別收集上清液和沉淀。

1.2.2.3 SDS-PAGE分析 選用12%分離膠及5%濃縮膠,將樣品與上樣緩沖液混合后每孔上樣15 μL,電泳條件為先80 V運行20 min后160 V運行100 min。電泳結束后取出膠,用考馬斯亮藍溶液進行染色1 h,后選用脫色液過夜脫色,分析實驗結果。

1.2.3 催化性能探究

1.2.3.1 菌懸液制備 將一定量培養(yǎng)好的重組菌發(fā)酵液4000×g離心處理10 min,去上清后用磷酸緩沖液重復洗滌菌體2次,最終用原發(fā)酵液1/20體積的磷酸緩沖液將菌體重懸,得靜息細胞懸液,測定菌體濃度后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 催化丙烯腈 反應體系包含0.5 mL純丙烯腈、0.2 g乙酰胺、菌液(終濃度3 mg(dcw)/mL)及去離子水共15 mL。30 ℃振蕩反應,取樣加入等體積HCl以終止反應,18000×g離心5 min,取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾,送樣進行氣相色譜檢測。

1.2.3.3 催化己二腈 反應體系包含50 μL 500 mmol/L己二腈、菌液(終濃度3 mg(dcw)/mL)及磷酸緩沖液共500 μL。振蕩反應,控制反應溫度和時間,加入等體積甲醇以終止反應,18000×g離心5 min,取上清液稀釋適當倍數(shù)后經(jīng)0.22 μm濾膜過濾,送樣進行液相色譜檢測。

1.2.3.4 影響因素 以己二腈為底物探究重組菌反應最適pH:反應體系中分別選用pH為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.4、8.0、8.5、9.0的磷酸緩沖液,30 ℃、220 r/min振蕩反應3 min。pH穩(wěn)定性:反應前將菌體分別重懸于pH為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.4、8.0、8.5、9.0的磷酸緩沖液孵育1 h,30 ℃、220 r/min振蕩反應3 min。探究反應最適溫度:反應時選用pH=7.4的磷酸緩沖液,分別在20、25、30、35、40、45、50 ℃條件下,220 r/min振蕩反應3 min。熱穩(wěn)定性:反應前將菌體分別在20、25、30、35、40、45、50 ℃條件下孵育1 h,30 ℃、220 r/min 振蕩反應3 min。通過產(chǎn)物己二酰二胺的生成量進行定量酶活計算,并設置每組最高酶活為參照(100%),以相對活性表示不同因素的影響情況。

1.2.4 重組腈水合酶(CtNHase)酶活測定 重組腈水合酶(CtNHase)進行催化時的一個酶活力單位(IU)定義為:在30 ℃,pH=7.4的條件下,每min生成1 μmol產(chǎn)物所需要的酶量。

丙烯腈及其催化產(chǎn)物檢測采用氣相色譜:FFAP GC柱(30 m×0.32 mm×0.5 μm);進樣口260 ℃,FID檢測器260 ℃,升溫程序為柱溫190 ℃,以10 ℃/min升至240 ℃,載氣(He)流速1.0 mL/min,壓力2.3 kPa,進樣量0.2 μL;分流比10∶1。采用內(nèi)標法,以乙酰胺為內(nèi)標物,繪制產(chǎn)物丙烯酰胺和乙酰胺兩者間質(zhì)量比與氣相峰面積間關系曲線,進行定量計算。

己二腈及其催化產(chǎn)物檢測采用高效液相色譜:Ultimate LP-C18柱(5 μm,4.6×250 mm);流動相為25 mmol/L磷酸水溶液和甲醇(89∶11,V∶V),檢測波長200 nm,柱溫30 ℃,流速1 mL/min。采用外標法,繪制產(chǎn)物己二酰二胺濃度與液相峰面積間關系曲線,進行定量計算。

1.3 數(shù)據(jù)處理

氣液相數(shù)據(jù)經(jīng)原始數(shù)據(jù)記錄軟件導出后經(jīng)Excel軟件計算處理,標準曲線和反應影響因素探究圖像由Origin軟件繪制得到。標曲每點數(shù)據(jù)由6組平行實驗去掉最大最小值后取平均值得到,其他數(shù)據(jù)均為3組平行實驗得到。

2 結果與分析

2.1 重組質(zhì)粒CtNHase構建與表達

來源于睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonastestosteroni5-MGAM-4D)的腈水合酶的核苷酸序列含有1576個核苷酸,經(jīng)PCR擴增基因片段,電泳驗證如圖1a所示,選擇pET-24a(+)為表達載體,選擇NdeI(CATATG)和XhoI(CTCGAG)作為酶切位點插入CtNHase基因片段,選用lacI啟動子,加入卡那霉素KanR抗性基因片段,選用T7終止子,轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10,圖1b所示為菌落PCR電泳驗證結果,得到陽性克隆。

圖1 PCR電泳圖

根據(jù)質(zhì)粒圖譜(圖2),重組質(zhì)粒經(jīng)XhoI/MluI雙酶切,得到兩條帶分別約為2397、4404 bp,與圖3a Lane 2相對應,證實質(zhì)粒的成功構建。

圖2 質(zhì)粒CtNHase譜圖

將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)中,得到重組菌CtNHase,通過SDS-PAGE驗證重組蛋白能否表達。由于工業(yè)用野生型菌均具有培養(yǎng)時間長,蛋白表達量低等問題,而大腸桿菌過表達系統(tǒng)具有明顯的菌體生長速度快、蛋白表達量高等優(yōu)勢[12,25],如圖3b所示,通過箭頭可以看到,腈水合酶在兩種菌的上清中均有大量表達,其中低溫誘導的Arctic Expression(DE3)產(chǎn)生的蛋白包涵體更少,上清中腈水合酶表達更高,因此后續(xù)實驗選用該重組菌進行催化活性探究。

圖3 質(zhì)粒雙酶切(a)與重組質(zhì)粒(b)的蛋白表達電泳圖

2.2 基因重組菌CtNHase的催化活性

2.2.1 催化丙烯腈 采用內(nèi)標法對丙烯腈及丙烯酰胺進行氣相色譜檢測,選取乙酰胺作為內(nèi)標物,稱取不同質(zhì)量比的標樣及內(nèi)標物,溶于15 mL水中模擬反應體系,在1.2.4所述檢測方法下進樣0.20 μL,重復6次,取得各樣品的峰面積,分析結果見表1。

表1 線性范圍測定表

圖4a所示為反應4 h時的氣相色譜圖,可見丙烯腈出峰時間1.66 min,乙酰胺出峰時間2.47 min,丙烯酰胺出峰時間2.97 min。如圖4b所示,以標樣產(chǎn)物峰面積與內(nèi)標峰面積比為縱坐標,標樣產(chǎn)物質(zhì)量與內(nèi)標質(zhì)量之比為橫坐標作內(nèi)標校正曲線圖,將數(shù)據(jù)作線性回歸處理,得到方程Y=1.6456x,R2=0.9964。通過此方法計算可以準確的對丙烯酰胺產(chǎn)量進行定量研究。采用靜息細胞反應,重組菌CtNHase可在5 h內(nèi)完全轉(zhuǎn)化終濃度500 mmol/L的丙烯腈生成丙烯酰胺。

圖4 催化丙烯腈反應4 h氣相色譜圖和內(nèi)標校正曲線

2.2.2 催化己二腈 液相譜圖如圖5a所示,己二酰二胺出峰時間4.34 min,己二腈出峰時間15.5 min(由于濃度過低，己二腈峰面積極小，故圖5無顯示)。采用外標法對己二酰二胺含量進行高效液相色譜檢測,如圖5b所示,選取己二酰二胺濃度為2～12 mmol/L,重復進樣6次,計算峰面積平均值,并進行線性回歸,得到標曲方程Y=1268.1238x,R2=0.99967。采用靜息細胞反應,重組菌CtNHase在5 min內(nèi)即可將終濃度50 mmol/L的己二腈完全轉(zhuǎn)化成己二酰二胺,酶活可達5567 U/g(dcw),高于目前文獻報道[26]。

圖5 催化己二腈反應5 min液相色譜圖和產(chǎn)物標準曲線

圖6 不同因素對基因重組菌CtNHase催化活性影響

2.3 溫度和pH對基因重組菌CtNHase催化活性的影響

如圖6a所示以最高酶活為參照,反應的最適溫度為30、35 ℃時仍有較高的相對活性,溫度持續(xù)升高后酶活下降;如圖6b所示為重組菌關于溫度穩(wěn)定性的曲線,可以看出低溫時菌體的穩(wěn)定性較好,30 ℃時菌種活性最高,溫度高于35 ℃后酶活迅速下降,證明該重組菌非嗜熱型菌種,高溫下易失活。

如圖6c所示為重組菌關于反應時緩沖液pH影響的曲線,在中性環(huán)境下pH=7.4時酶活最高,為最佳反應條件;以最高酶活做參照,如圖6d所示得到重組菌關于pH穩(wěn)定性的曲線,可以看出緩沖液pH對酶活影響不大,pH在5～9范圍內(nèi)酶活均在80%以上,說明該菌具有良好的pH穩(wěn)定性。

以上結果表明基因重組菌CtNHase對己二腈的最佳催化反應條件為30 ℃,pH7.4。

3 結論

本研究成功構建了野生菌Comamonastestosteroni5-MGAM-4D來源的腈水合酶基因重組菌CtNHase,發(fā)現(xiàn)在pH=7.4,30 ℃的最佳反應條件下,基因重組菌CtNHase可在5 min和5 h內(nèi)分別完全轉(zhuǎn)化50 mmol/L己二腈和500 mmol/L丙烯腈生成己二酰二胺和丙烯腈。本實驗結果說明基因重組菌CtNHase可高效轉(zhuǎn)化腈類化合物為酰胺類化合物。鑒于酰胺類化合物具有極高的工業(yè)應用價值,因此本研究下一步會深入對酶的固定化操作進行探究,進一步提升催化效率,以期為真正的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù),為綠色化學的發(fā)展添磚加瓦。