張 旭,盧 娜,李兆杰,薛 勇,袁詩(shī)涵,薛長(zhǎng)湖,唐慶娟

(中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266000)

姜黃素光動(dòng)力是一種新型廣譜殺菌技術(shù),在貝類(lèi)加工中有著廣泛的應(yīng)用前景。前期研究表明,姜黃素光動(dòng)力能夠減緩牡蠣脂質(zhì)氧化水解的進(jìn)程[1]。酶是導(dǎo)致牡蠣脂質(zhì)氧化水解的主要原因。

脂質(zhì)的酶促氧化主要是由脂肪氧合酶(LOX)引起的,脂肪氧合酶是含非血紅素鐵的氧化還原酶,可以催化多不飽和脂肪酸(PUFA)發(fā)生的過(guò)氧化反應(yīng)[2]。脂肪氧合酶可以作用在多不飽和脂肪酸的特定位點(diǎn),通過(guò)分子內(nèi)加氧,生成具有共軛雙鍵的氫過(guò)氧化物,這些氫過(guò)氧化物又會(huì)分解為短鏈的醛、醇和碳?xì)浠衔?產(chǎn)生不良?xì)馕禰2]。Yarnpakdee等對(duì)羅非魚(yú)在冷藏過(guò)程中的脂肪氧合酶活性進(jìn)行了檢測(cè),研究表明脂肪氧合酶在羅非魚(yú)脂質(zhì)的氧化過(guò)程中起到了重要的作用[3]。Zhou等檢測(cè)了脂肪氧合酶在貽貝冷藏過(guò)程中的活性變化,結(jié)果表明脂肪氧合酶與貽貝的脂質(zhì)氧化密切相關(guān)[4]。

脂質(zhì)的水解是脂肪酶及磷脂酶引起的,在冷藏過(guò)程中,這些酶仍保持著一定的活力[5]。脂肪酶是一類(lèi)能夠催化長(zhǎng)鏈酰基甘油酯鍵水解的酶。磷脂酶有磷脂酶A1(PLA1)、磷脂酶A2(PLA2)、磷脂酶C(PLC)、磷脂酶D(PLD)四種類(lèi)型,分別作用于磷脂不同位點(diǎn)[6]。牡蠣中甘油酯、磷脂會(huì)在脂肪水解酶和磷脂酶的作用下降解,產(chǎn)生大量游離脂肪酸。游離脂肪酸一方面繼續(xù)分解產(chǎn)生小分子的醛和醇;另一方面,游離脂肪酸比甘油酯、磷脂更容易氧化,產(chǎn)生酸敗氣味[7]。Liu等研究證明,在低溫冷藏過(guò)程中,脂肪酶對(duì)甘油三酯的水解起著重要的作用[8]。王昕岑對(duì)牡蠣中脂肪水解酶的活性進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)在冷藏過(guò)程中脂肪酶和磷脂酶依然保持著一定的活性,且與磷脂的水解密切相關(guān)[6]。

因此,檢測(cè)姜黃素光動(dòng)力對(duì)脂肪氧合酶、脂肪酶和磷脂酶的影響,對(duì)探究姜黃素光動(dòng)力延緩牡蠣的脂質(zhì)劣化具有較為重要的意義。這些引起脂質(zhì)水解和氧化的酶,大部分是分布在牡蠣肌肉和內(nèi)臟器官中的內(nèi)源酶,還有一部分來(lái)自于牡蠣冷藏過(guò)程中由腐敗菌產(chǎn)生的外源酶[9-11]。在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中,牡蠣的內(nèi)源酶和外源酶難以區(qū)別。為避免腐敗菌產(chǎn)生的外源酶的影響,使牡蠣的體外酶活可以近似等于內(nèi)源酶活性,本文提取了新鮮牡蠣中的脂肪氧化水解酶檢測(cè)了內(nèi)源酶的活性,并通過(guò)篩選產(chǎn)酶菌株、統(tǒng)計(jì)產(chǎn)酶菌株數(shù)量,確定姜黃素光動(dòng)力對(duì)外源酶數(shù)量的影響,創(chuàng)新性地檢測(cè)了牡蠣內(nèi)源酶的活性,并從微生態(tài)影響外源酶的角度探究了姜黃素光動(dòng)力對(duì)酶的影響,以期從酶的角度闡明姜黃素光動(dòng)力減緩牡蠣脂質(zhì)氧化水解的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牡蠣 青島團(tuán)島農(nóng)貿(mào)市場(chǎng),選購(gòu)大小均勻,每個(gè)質(zhì)量(250±10) g,30 min內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室;姜黃素(食品添加劑級(jí)) 陜西慈緣生物科技有限公司;食品級(jí)乙醇(≥95%) 廣西海盈酒精有限責(zé)任公司;海水素 廣州益爾生物工程有限公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司;其他化學(xué)試劑 均為國(guó)產(chǎn)AR級(jí)普通試劑。

多功能光源儀 青島建亮科技有限公司;JYL-C50T料理機(jī) 九陽(yáng)股份有限公司;精密電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司;Model 680 型酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Rad 公司;電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;超純水系統(tǒng) 美國(guó)Millipore 公司;Anke臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牡蠣分組及處理 根據(jù)牡蠣在10 μmol/L姜黃素的人工海水暫養(yǎng)3 h后,海水吸光值的變化得出每克牡蠣肉(包含內(nèi)臟)的姜黃素添加量為0.0556 mg。將在未添加姜黃素的人工海水暫養(yǎng)3 h后的新鮮牡蠣在無(wú)菌條件下開(kāi)殼,提取粗酶液進(jìn)行如下分組處理:空白組:直接檢測(cè)酶活;光動(dòng)力組:向粗酶液中添加0.0556 mg/g牡蠣肉的姜黃素,置于420 nm光源下,能量密度7.2 J/cm2照射2 min,檢測(cè)酶活。

1.2.2 脂肪氧化水解酶粗酶液提取

1.2.2.1 脂肪氧合酶粗酶液提取 按照參考文獻(xiàn)[4]中方法進(jìn)行,5 g牡蠣肉,加入15 mL 50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0,含1 mmol/L二硫蘇糖醇和1 mmol/L乙二胺四乙酸)勻漿:25000 r/min均質(zhì)4次,每次10 s,勻漿后在冰盒上攪拌30 min,4 ℃下15000×g離心1 h,上清液通過(guò)四層紗布過(guò)濾,收集濾液。

1.2.2.2 脂肪水解酶粗酶液提取 按照參考文獻(xiàn)[5]中方法進(jìn)行,2 g牡蠣肉,加入10 mL Tris-HCl(20 mmol/L Tris-HCl pH8,150 mmol/L NaCl pH8.5)緩沖液渦旋,5000 r/min均質(zhì)2次,每次30 s,磁力振蕩攪拌30 min,10000 r/min離心5 min,收集上清液。其中,脂肪酶,磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶C、磷脂酶D均屬于脂肪水解酶。

1.2.3 脂肪氧化水解酶活性檢測(cè)

1.2.3.1 脂肪氧合酶活性測(cè)定 按照參考文獻(xiàn)[12]中方法檢測(cè)脂肪氧合酶活性,0.1 mL脂肪氧合酶粗酶提取液,加入2.9 mL 50 mmol/L檸檬酸緩沖液、預(yù)熱的0.2 mL底物(140 mg亞油酸于5 mL含180 μL吐溫20的去離子水中,調(diào)pH至9.0,定容至50 mL)。在30 ℃起始反應(yīng),準(zhǔn)確計(jì)時(shí),反應(yīng)2 min后立即加入4 mol/L HCl至pH3.0,酸性條件下酶失去活性,反應(yīng)終止,取適量體積的反應(yīng)液于234 nm下測(cè)定吸光度。酶活定義:在此條件下每分鐘增加0.001吸光度值定義為1 U。

1.2.3.2 脂肪酶活性測(cè)定 按照參考文獻(xiàn)[6]中方法檢測(cè)脂肪酶活性。底物溶液(3 mg/mL棕櫚酸對(duì)硝基苯酚酯)與緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0))以體積比1∶9 (V/V)混合均勻,取1.5 mL上述混合液與0.5 mL粗酶提取液混合,渦旋后置于37 ℃反應(yīng)10 min,加入2 mL 0.5 mol/L三氯乙酸溶液,使酶失活,反應(yīng)終止,再加入2 mL 0.5 mol/L 碳酸鈉溶液顯色,振蕩后,在410 nm處測(cè)定吸光度值。脂肪酶水解對(duì)硝基苯酚酯產(chǎn)生對(duì)硝基苯酚,不同濃度的對(duì)硝基苯酚吸光度值不同,配制不同濃度的對(duì)硝基苯酚溶液,以濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)注曲線(xiàn)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算得到反應(yīng)液中對(duì)硝基苯酚的濃度,酶活定義為在一定條件下,1 min內(nèi)生成1 μmol對(duì)硝基苯酚所需的脂肪酶的量為1 U。

1.2.3.3 磷脂酶A1活性測(cè)定 按照參考文獻(xiàn)[6]中方法進(jìn)行檢測(cè)磷脂酶A1活性。2.0 mL卵磷脂底物溶液(8%,用pH6.0的磷酸鹽緩沖液配制)、2.5 mL Tris-HCl(10 mmol/L,pH8.5)和0.5 mL粗酶提取液混勻。于37 ℃反應(yīng)15 min,加入1 mL 95%乙醇溶液,使酶失活,終止反應(yīng),混勻后加入3 mL異辛烷振蕩。65 ℃靜置分層,冷卻至室溫后,取上層溶液加入異辛烷,混勻后加入1 mL吡啶-銅鹽顯色劑(5%,pH6.1),渦旋后靜置澄清,取上層有機(jī)相在714 nm處測(cè)定吸光度值。磷脂酶A1水解底物生成棕櫚酸,不同濃度的棕櫚酸與異辛烷和吡啶-銅鹽混勻后吸光度值也不同。配制不同濃度的棕櫚酸異辛烷溶液,加入吡啶-銅鹽顯色劑,以濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)注曲線(xiàn)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算得到反應(yīng)液中棕櫚酸的濃度,酶活力定義為在一定條件下,1 min內(nèi)生成1 μmol棕櫚酸所需的磷脂酶A1的量為1 U。

1.2.3.4 磷脂酶A2活性測(cè)定 按照參考文獻(xiàn)[6]中方法進(jìn)行檢測(cè)磷脂酶活性。50 mmol/L Tris-HCl溶液(pH8.0,含有100 mmol/L NaCl,5 μg/mL牛血清白蛋白,5 mmol/L CaCl2,10 μmol/L 8-苯胺基-1-萘磺酸)170 μL和20 μL底物溶液(200 μmol/L的DMPC)混勻,26 ℃保溫5 min后,加入10 μL粗酶提取液開(kāi)始反應(yīng),熒光發(fā)射15 min觀(guān)測(cè)其動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)。吸收和發(fā)射波長(zhǎng)分別為377和470 nm。磷脂酶A2的酶活力定義為在一定條件下,1 min內(nèi)熒光強(qiáng)度改變1個(gè)單位定義為1 U。

1.2.3.5 磷脂酶C活性測(cè)定 按照參考文獻(xiàn)[6]中方法進(jìn)行檢測(cè)磷脂酶C活性。2 mL的反應(yīng)體系(0.25 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.2),60%山梨糖醇,10 mmol/L的底物對(duì)硝基磷酸膽堿)和100 μL的粗酶提取液混勻,于37 ℃水浴鍋內(nèi)反應(yīng)30 min,加入1 mL 95%乙醇溶液,使酶失活,反應(yīng)終止,測(cè)定溶液在410 nm處的吸光度值。磷脂酶C水解對(duì)硝基磷酸膽堿產(chǎn)生對(duì)硝基苯酚,不同濃度的對(duì)硝基苯酚吸光度值不同,配制不同濃度的對(duì)硝基苯酚溶液,以濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)注曲線(xiàn)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算得到反應(yīng)液中對(duì)硝基苯酚的濃度,酶活定義為在一定條件下,1 min內(nèi)生成1 μmol對(duì)硝基苯酚所需的磷脂酶C的量為1 U。

1.2.3.6 磷脂酶D活性測(cè)定 按照參考文獻(xiàn)[6]中方法進(jìn)行檢測(cè)磷脂酶D活性。0.4 mL反應(yīng)液與0.1 mL卵磷脂底物溶液(0.1 g 95% PC溶1 mL的乙醚,加入9 mL超純水,超聲得乳濁液)混勻,加入0.1 mL粗酶提取液,于37 ℃恒溫水浴20 min,加入0.2 mL 50 mmol/L EDTA溶液,沸水浴5 min,使酶失活,反應(yīng)終止,恢復(fù)至室溫后,加入0.2 mL顯色液,37 ℃下顯色30 min,于500 nm下測(cè)其吸光值。磷脂酶D能夠?qū)⒙蚜字獬赡憠A,不同濃度的膽堿呈現(xiàn)出不同的吸光度值,配制不同濃度的膽堿溶液,以濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)注曲線(xiàn)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算得到反應(yīng)液中膽堿的濃度,酶活定義為在此條件下,1 min產(chǎn)生1 μmol膽堿所需要的酶量定義為1 U。

1.2.4 產(chǎn)外源酶菌株的篩選及菌種鑒定

1.2.4.1 菌株篩選 新鮮牡蠣肉1 g和9 mL無(wú)菌生理鹽水在食品勻漿機(jī)中均質(zhì)。將勻漿液按照1∶100、1∶1000、1∶10000比例梯度稀釋后接種于不同的篩選培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)48 h后,查看平板陽(yáng)性結(jié)果。篩選培養(yǎng)基配方如下:

產(chǎn)脂肪氧合酶菌株篩選培養(yǎng)基[13]:含有0.5%亞油酸和0.5%β-胡蘿卜素的LB瓊脂培養(yǎng)基。

產(chǎn)脂肪酶菌株篩選培養(yǎng)基[14]:橄欖油乳化液12 mL,中性紅0.001 g,酵母膏0.1 g,瓊脂1.5 g,海水100 mL(pH=7.2)。

產(chǎn)磷脂酶A1菌株篩選培養(yǎng)基[15]:卵磷脂2%,胰蛋白胨1%,NaCl 1%,酵母粉0.5%,溴甲酚紫3%,25 mol/L CaCl2(pH=7.0)。

產(chǎn)磷脂酶A2菌株篩選培養(yǎng)基[16-17]:含有2%卵磷脂的LB瓊脂培養(yǎng)基(pH=7.8)。

產(chǎn)磷脂酶C菌株篩選培養(yǎng)基[18]:蛋白胨1%,NaCl 0.5%,牛肉膏0.3%,瓊脂 2%,卵黃液2%(pH=7.2～7.4)。

產(chǎn)磷脂酶D菌株篩選培養(yǎng)基[19-20]:磷脂酰膽堿5.0 g/L,KNO35.0 g/L,K2HPO40.25 g/L,FeSO4·7H2O 0.005 g/L,瓊脂20 g/L(pH=7.0～7.4)。

1.2.4.2 菌種鑒定 挑取平板上呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果的單菌落,按天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取牡蠣體內(nèi)細(xì)菌的DNA。以提取的DNA為模板,采用細(xì)菌通用引物27F-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG和1492R-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T擴(kuò)增16S rDNA的全序列。PCR擴(kuò)增體系(50 μL)為:Taq DNA聚合酶2.5 U,引物200 nmol/L,dNTP 200 nmol/L,60 mmol/L Tris-SO4,18 mmol/L(NH4)2SO4,2.0 mmol/L MgSO4,1%甘油,100 ng/μL牛血清蛋白,模板DNA 10 ng,補(bǔ)ddH2O至50 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃變性30 s、60 ℃復(fù)性30 s、72 ℃延伸6 s、20個(gè)循環(huán)。委托生工生物工程(上海)股份有限公司對(duì)擴(kuò)增后的序列進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 菌株數(shù)量檢測(cè)

1.2.5.1 牡蠣處理方式 牡蠣分為空白對(duì)照組和光動(dòng)力組(每組5只),處理方式如下:

空白對(duì)照組(L-S-):人工海水中暫養(yǎng)3 h,貝水比為1∶4,無(wú)菌條件下開(kāi)殼。

光動(dòng)力組(L+S+):于姜黃素終濃度為10 μmol/L的人工海水中暫養(yǎng)3 h,貝水比為1∶4。無(wú)菌條件下開(kāi)殼,420 nm光源照射(能量密度為7.2 J/cm2,照射2 min)。

每只牡蠣取1 g進(jìn)行高通量測(cè)序、1 g進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)統(tǒng)計(jì)菌落總數(shù)。

1.2.5.2 Illumina MiSeq高通量測(cè)序 1 g牡蠣加入無(wú)菌生理鹽水勻漿,按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取牡蠣體內(nèi)細(xì)菌的DNA。以提取的DNA為模板,采用細(xì)菌16S PCR引物341/357F-NNNNCCT ACGGGNGGCWGCAG和805/785R-GACTACHV GGGTATCTAATCC擴(kuò)增16S rRNA的V1～V3高變區(qū)序列。擴(kuò)增體系同1.2.4.2。

擴(kuò)增后的產(chǎn)物委托北京奧維森基因科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建,構(gòu)建好的文庫(kù)用BioAnalyzer High-sensitivity DNA chip kit定量,文庫(kù)合格后,使用Illumina Miseq對(duì)牡蠣微生物的V3～V4區(qū)進(jìn)行上機(jī)測(cè)序,QIIMEv1.8.0用來(lái)分析16S rRNA基因序列,Mothurv.1.34.4用來(lái)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.5.3 菌落總數(shù)統(tǒng)計(jì) 1 g牡蠣肉和9 mL無(wú)菌生理鹽水在食品勻漿機(jī)中均質(zhì)。將勻漿液按照1∶100、1∶1000、1∶10000比例梯度稀釋后接種于LB瓊脂培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)48 h后,計(jì)數(shù)菌落形成單位。結(jié)果以lg(cfu/g)表示。

1.2.5.4 計(jì)算菌的數(shù)量 菌的數(shù)量=菌的相對(duì)豐度(%)×菌落總數(shù)(lg(cfu/g)),菌的相對(duì)豐度由1.2.5.2高通量測(cè)序結(jié)果分析得來(lái),菌落總數(shù)由1.2.5.3中檢測(cè)得來(lái)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)做5個(gè)平行,運(yùn)用Excel 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與處理,采用SPSS 18.0軟件中ANOVA分析進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與作圖,數(shù)據(jù)以mean±SD表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 姜黃素光動(dòng)力對(duì)牡蠣內(nèi)源性脂質(zhì)酶活性的影響

空白組和光動(dòng)力組的牡蠣脂質(zhì)氧化水解酶的內(nèi)源酶活性如圖1所示?？梢钥闯鲈谀迪狊w內(nèi),脂肪氧合酶的活性最高,其次是磷脂酶A2、磷脂酶A1、磷脂酶D、脂肪酶和磷脂酶C,這與王昕岑[6]的研究結(jié)果是相似的。

圖1 姜黃素光動(dòng)力對(duì)牡蠣內(nèi)源脂質(zhì)氧化水解酶活性的影響

從圖1A中可以看出,光動(dòng)力組的脂肪氧合酶活性低于空白組,且其脂肪氧合酶的活性降低10%,說(shuō)明姜黃素光動(dòng)力可以在一定程度上降低內(nèi)源性脂肪氧合酶的活性。姜黃素光動(dòng)力能夠使脂肪酶的活性從(0.04±0.01) U/g降低至(0.03±0.00)U/g,其脂肪酶活性極顯著低于空白組(P<0.01),說(shuō)明姜黃素光動(dòng)力能夠降低內(nèi)源性脂肪酶的活性(圖1B)。圖1C中,姜黃素光動(dòng)力處理能夠使磷脂酶A1的活性降低約10%,其磷脂酶A1活性呈現(xiàn)出低于空白組的趨勢(shì)(圖1C),說(shuō)明姜黃素光動(dòng)力能夠在一定程度上降低內(nèi)源性磷脂酶A1的活性。光動(dòng)力組的磷脂酶A2活性低于空白組約29%(圖1D),說(shuō)明姜黃素光動(dòng)力處理能夠在一定程度上降低內(nèi)源性磷脂酶A2的活性。圖1F顯示,光動(dòng)力組的磷脂酶D活性低于空白組約11%,說(shuō)明姜黃素光動(dòng)力處理在一定程度上能夠降低內(nèi)源性磷脂酶D的活性。

從圖1E中磷脂酶C的活性變化可以看出,姜黃素光動(dòng)力使磷脂酶C的活性略有升高,從(0.0039±0.003) U/g升高至(0.0046±0.005) U/g,這可能是因?yàn)榻S素光動(dòng)力處理后,磷脂酶C處于更加適宜的環(huán)境條件,使磷脂酶C的活性有小幅升高。王昕岑的研究表明,磷脂的水解主要與磷脂酶A2密切相關(guān)密切相關(guān),而與其他磷脂水解酶的相關(guān)性較小[6],且在本文中,磷脂酶C活性最低,因此內(nèi)源性磷脂酶C活性的小幅度提高對(duì)脂質(zhì)水解影響較小。

表1 產(chǎn)脂肪酶菌株的測(cè)序及序列比對(duì)結(jié)果

綜上所述,姜黃素光動(dòng)力可以降低內(nèi)源性脂肪酶、脂肪氧合酶、磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶D酶的活性,延緩牡蠣脂質(zhì)的氧化和水解。

2.2 姜黃素光動(dòng)力對(duì)牡蠣中產(chǎn)脂質(zhì)酶菌株的影響

在篩選能夠產(chǎn)生脂質(zhì)氧化水解酶的菌株時(shí),選擇了新鮮牡蠣作為樣品,發(fā)現(xiàn)僅在脂肪酶和磷脂酶C的篩選培養(yǎng)基上出現(xiàn)了陽(yáng)性結(jié)果,沒(méi)有篩選到能夠產(chǎn)生脂肪氧合酶、磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶D的菌株,這說(shuō)明在新鮮的牡蠣體內(nèi)可能不存在產(chǎn)生脂肪氧合酶、磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶D的菌株。

2.2.1 產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選及其在姜黃素光動(dòng)力下的數(shù)量變化 在篩選產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基中含有中性紅,中性紅在中性環(huán)境下成黃色,酸性環(huán)境下成紅色,菌株產(chǎn)生的脂肪酶可以將橄欖油水解為脂肪酸,使中性紅呈現(xiàn)紅色,因此,在產(chǎn)脂肪酶的菌株周?chē)鷷?huì)產(chǎn)生紅色的水解圈。在篩選牡蠣體內(nèi)產(chǎn)脂肪酶菌株的過(guò)程中,篩選出了兩株產(chǎn)脂肪酶的菌株(圖2)。兩株菌株在菌落形態(tài)上所不同,Lipase-1為白色菌落,菌落較小且凸起,邊緣光滑,Lipase-2為白色菌落,菌落小且較為扁平,邊緣光滑,經(jīng)16S rRNA測(cè)序并在NCBI 序列比對(duì)鑒定,兩株菌株均為假單胞菌(Pseudomonas)。

圖2 產(chǎn)脂肪酶的菌株篩選結(jié)果

假單胞菌廣泛存在于土壤和海水中,是一種無(wú)芽孢、有鞭毛、能運(yùn)動(dòng)的革蘭氏陰性菌。假單胞菌是貝類(lèi)腐敗過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌,這是因?yàn)樗梢援a(chǎn)生脂肪酶、蛋白酶等多種酶[21-22]。對(duì)假單胞菌產(chǎn)生脂肪酶的研究較為廣泛,查代明等認(rèn)為在所有微生物來(lái)源的脂肪酶中,假單胞菌產(chǎn)生的脂肪酶具有最好的性能[23],羅偉認(rèn)為在低溫條件下,假單胞菌更易產(chǎn)生脂肪酶[24],這與本文中的測(cè)序結(jié)果是吻合的。

根據(jù)16S rDNA測(cè)序數(shù)據(jù)分析,將假單胞菌的數(shù)量變化進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)(圖3),發(fā)現(xiàn)姜黃素光動(dòng)力處理極顯著降低了假單胞菌的數(shù)量(P<0.01)。因此推測(cè),姜黃素光動(dòng)力一方面通過(guò)直接作用于牡蠣的內(nèi)源性脂肪酶,并降低其活性,另一方面也可以減少分泌脂肪酶的菌數(shù)量,從而減少外源脂肪酶的量。

圖3 姜黃素光動(dòng)力對(duì)假單胞菌數(shù)量的影響

2.2.2 產(chǎn)磷脂酶C(PLC)菌株的篩選及其在姜黃素光動(dòng)力下的數(shù)量變化 在篩選產(chǎn)磷脂酶C的培養(yǎng)基中,在產(chǎn)磷脂酶C的菌株周?chē)鷷?huì)產(chǎn)生透明的水解圈。水解圈的形成是因?yàn)榫戤a(chǎn)生的磷脂酶C會(huì)分解卵黃液中的卵磷脂。在篩選牡蠣體內(nèi)產(chǎn)磷脂酶C菌株的過(guò)程中,篩選出了兩株產(chǎn)磷脂酶C的菌株(圖4)。兩株菌株在菌落形態(tài)上所不同,PLC-1為白色菌落,菌落較大,中間凸起,邊緣光滑,PLC-2為淡黃色菌落,圓形,邊緣光滑,菌落中間隆起,經(jīng)16S rRNA鑒定后,PLC-1為腸桿菌(Enterobacteriaceae),PLC-2為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas)。

圖4 產(chǎn)磷脂酶C的菌株篩選結(jié)果

嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌是一種在養(yǎng)殖水體中普遍存在的菌類(lèi),是革蘭氏陰性桿菌,兩端鈍圓,無(wú)莢膜,無(wú)芽孢[25-26]。腸桿菌是一類(lèi)革蘭氏陰性菌。Fox等從牛奶中分離產(chǎn)生磷脂酶C的菌株,發(fā)現(xiàn)有三株屬于腸桿菌,這說(shuō)明腸桿菌中的確存在可以產(chǎn)生磷脂酶C的菌株[27]。

根據(jù)16S rDNA測(cè)序數(shù)據(jù)分析,將腸桿菌和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的數(shù)量變化進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)(圖5),結(jié)果表明,姜黃素光動(dòng)力極顯著降低了這兩種菌的數(shù)量(P<0.01)。因此,姜黃素光動(dòng)力可以減少分泌磷脂酶C的菌數(shù)量,減少產(chǎn)酶量。

表2 產(chǎn)磷脂酶C菌株的測(cè)序及序列比對(duì)結(jié)果

圖5 姜黃素光動(dòng)力對(duì)腸桿菌(A)和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(B)數(shù)量的影響

綜上所述,姜黃素光動(dòng)力通過(guò)減少產(chǎn)酶菌株的數(shù)量,減少外源性脂肪酶和磷脂酶C的數(shù)量,延緩牡蠣脂質(zhì)的劣化。

3 結(jié)論

姜黃素光動(dòng)力能夠通過(guò)降低牡蠣內(nèi)源性脂肪氧合酶、脂肪酶、磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶D的活性延緩脂質(zhì)劣化,也可以通過(guò)減少分泌脂肪酶的菌(假單胞菌)、分泌磷脂酶C的菌(腸桿菌和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌)數(shù)量,減少外源脂質(zhì)酶的數(shù)量,來(lái)延緩牡蠣脂質(zhì)的劣化。

本研究從酶的角度闡明了姜黃素光動(dòng)力延緩牡蠣脂質(zhì)氧化水解的機(jī)理,但脂質(zhì)的水解和氧化可能并不僅僅是由于酶引起的,在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中可以通過(guò)分析微生物組成,解析微生物與脂質(zhì)劣化的關(guān)系,從多個(gè)角度闡明姜黃素光動(dòng)力延緩脂質(zhì)劣化的機(jī)理,為該技術(shù)在貝類(lèi)保鮮中推廣應(yīng)用提供更加全面的理論依據(jù)。