馬天曉,尹震花,張翠利,劉會利,張金香,郭瑋瑋,陳 林,*

(1.黃河科技學(xué)院,鄭州市天然產(chǎn)物合成生物學(xué)重點實驗室,河南省小分子新藥研發(fā)國際聯(lián)合實驗室,河南鄭州 450063;2.黃河科技學(xué)院附屬醫(yī)院藥學(xué)部,河南鄭州 450063)

多糖(Polysaccharide)是由10個以上的單糖通過糖苷鍵連接而成的。在自然界中,許多天然藥物中的多糖具有較強的生物活性,如抗氧化活性[1]、抗血栓[2]、抗免疫活性[3]、抗糖化活性[4]、抗腫瘤活性[5]、改善便秘[6]等活性。

流蘇子為木犀科(Oleaceae)流蘇樹屬(Chionanthus)植物,產(chǎn)于甘肅、陜西、山西、河北、河南以南至云南、四川、廣東、福建、臺灣。生長于海拔100～1450 m處的山地或丘陵的林中或灌叢中。朝鮮、日本也有分布[7]。目前對流蘇的研究主要在栽培技術(shù)和園林綠化上[8],對于流蘇的藥用價值和化學(xué)成分研究主要集中在流蘇花及其根皮部。化學(xué)成分主要含有黃酮類、木脂素、三萜類、甾醇類等成分[9-13]。目前還未見對流蘇子多糖的研究,其藥理活性成分尚不明確。

本實驗采用水提醇沉法從流蘇子中提取粗多糖,再經(jīng)Sevage法除蛋白和DEAE-52纖維、Sephadex G-100凝膠進行分離純化,凍干得到精制多糖CRp-1,采用化學(xué)和儀器分析方法研究其理化性質(zhì),并通過體外實驗研究其對α-葡萄糖苷酶的抑制活性,為其進一步研究開發(fā)利用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

流蘇種子 于2016年8月～9月采集于太行山區(qū),由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院劉震教授鑒定為木犀科流蘇樹屬流蘇樹(Chionanthusretusus)的種子,標本存于黃河科技學(xué)院;石油醚、無水乙醇 天津市津東天正精細化學(xué)試劑廠;濃硫酸 開封方晶化工廠;苯酚 天津凱通化學(xué)試劑有限公司;D(+)-葡萄糖(Glc)、D(+)-木糖(Xyl)、L(+)-阿拉伯糖(Ara)、L(+)-鼠李糖(Rha)、D(+)-甘露糖(Man)、D-半乳糖(Gal) 德國Dr Ehrenstorfer GmbH公司;DEAE-52纖維素 賽譜銳思(北京)科技有限公司;Sephadex G-100 瑞典GE Healthcare Bio-Science AB公司;α-葡萄糖苷酶 Sigma-aldrich有限公司;對硝基苯-α-葡萄糖吡喃苷、三氟乙酸、硼氫化鈉 阿拉丁試劑(上海)有限公司;超純水 實驗室自制。

日立U-4100型紫外可見分光光度計 Thermo公司;LL-1500型冷凍干燥儀器、TRACE 1310氣相色譜儀 美國Thermo公司;Waters 2698高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)儀 沃特世科技(上海)有限公司;Thermo Scientific Nicolet iS5傅里葉變換紅外光譜儀 美國Nicolet公司;EnVision多標記微孔板檢測系統(tǒng) 美國PerKinElmer公司;SQP分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;FEI Quanta 250 FEG場發(fā)射掃描電子顯微鏡 美國FEI Quanta 250 FEG公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 流蘇子多糖的提取和純化 取流蘇種子2000 g粉碎,用石油醚浸泡脫脂2次,每次2 d,提取2次,回收石油醚,殘渣揮發(fā)至無醚味,用70%乙醇浸泡2次,每次2 d,回收乙醇,殘渣揮發(fā)干至無醇味,以純水為提取溶劑,80 ℃加熱提取2次,每次4 h,合并濾液,濃縮至一定體積后,加入無水乙醇調(diào)至乙醇濃度為70%±2%,4 ℃靜置過夜,4 000 r/min離心10 min,收集沉淀,沉淀復(fù)溶,冷凍干燥,得到流蘇子粗多糖。

采用Sevage法除蛋白[14],重復(fù)5次除蛋白,蛋白基本上除完;除蛋白后的多糖經(jīng)DEAE-52纖維素柱色譜(60 cm×2.5 cm)分離,分別用0.00、0.05、0.15、0.25 mol/L的NaCl溶液進行梯度洗脫,采用苯酚-硫酸法[15]檢測洗脫液中的含糖量,在490 nm處測定洗脫液的吸光度(A),繪制洗脫曲線,同一洗脫峰合并,濃縮,透析袋透析48 h除去小分子雜質(zhì);再經(jīng)Sephadex G-100柱色譜(100 cm×1.5 cm),超純水洗脫,同樣采用苯酚-硫酸法檢測洗,490 nm處測定A值,合并、濃縮,凍干得到精制多糖。

1.2.2 流蘇子多糖的理化性質(zhì)

1.2.2.1 流蘇子多糖的一般理化性質(zhì) 以葡萄糖為標準品,采用苯酚-濃硫酸法測定多糖CRp-1的總糖含量[15];采用考馬斯亮藍染色法測定蛋白質(zhì)含量[16];測定多糖CRp-1在水中以及乙醇、正丁醇、丙酮、氯仿、石油醚等有機溶劑中的溶解度,觀察溶解性;進行斐林試劑反應(yīng)、三氯化鐵反應(yīng)、碘-碘化鉀反應(yīng)[17]。

彩色鉛筆的筆芯和普通鉛筆是不一樣的，它沒有使用黏土制作，而是將能涂出顏色的顏料、能使書寫更順滑的滑石粉或蠟、起凝固作用的黏合劑等和水一起充分混合，最后制造出五顏六色的彩色鉛筆芯。由于沒有經(jīng)過普通鉛筆芯的高溫?zé)具^程，彩色鉛筆芯更加柔軟。

1.2.2.2 紫外全波長掃描 取適量精制多糖配制成0.3 mg/mL溶液,在190～760 nm波長下進行紫外全波長掃描。

1.2.2.3 相對分子量測定 采用高效凝膠排阻色譜法[18]測定相對分子質(zhì)量、分子半徑及分散系數(shù)(Mw/Mn),檢測器為示差折光檢測器,色譜柱為The Shodex OHpak SB-806M HQ(300 mm×8.0 mm,i.d.),流動相為0.9% NaCl,體積流量0.5 mL/min,柱溫30 ℃,進樣量100 μL。

1.2.2.4 單糖組成分析 參考文獻[19]報道的方法,略作修改,進行單糖組成分分析。多糖10 mg在110 ℃下用3 mL 4 mol/L三氟乙酸水解3 h,得到水解產(chǎn)物,水解產(chǎn)物與10 mg鹽酸羥胺和0.5 mL吡啶在90 ℃反應(yīng)30 min,再用0.4 mL乙酸酐在90 ℃乙?；?0 min得到乙?；a(chǎn)物。采用氣相色譜法進行單糖檢測。標準單糖也用同樣的方法衍生得到乙?；a(chǎn)物。

1.2.2.5 紅外光譜分析 取適量精制多糖加入瑪瑙研缽中,加入適量溴化鉀,混合研磨均勻后壓制成透明薄片,使用紅外光譜掃描儀從4000～400 cm-1進行掃描,記錄掃描圖譜,繪制紅外光譜圖像[20]。

1.2.2.6 剛果紅實驗 采用剛果紅法測定多糖CRp-1的構(gòu)象結(jié)構(gòu)[21]。多糖CRp-1用超純水配制成1 mg/mL的溶液。取CRp-1溶液1 mL,加入等體積的100 μmol/L剛果紅試劑,通過加入1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)混合物的不同NaOH濃度(0～0.5 mol/L)。用紫外在300～600 nm波長范圍內(nèi)進行掃描,測定了混合物在不同NaOH濃度下的最大吸收波長。

1.2.2.7 微觀結(jié)構(gòu)分析 將多糖CRp-1固定在銅根上,去掉一些沒有固定到銅根上的多余樣品,噴金。在15 kV加速電壓下用掃描電子顯微鏡對多糖進行表面形貌觀察,分析其微觀結(jié)構(gòu)[19]。

1.2.3 體外α-葡萄糖苷酶抑制活性篩選 依據(jù)參考文獻[22]報道的方法,提高樣品的溶液濃度,稍作修改,于405 nm波長下測吸光度,進行多糖CRp-1抑制α-葡萄糖苷酶活性篩選。阿卡波糖為陽性對照,樣品初篩濃度為8 mg/mL,陽性對照初篩濃度為2 mg/mL。每個樣品平行測定3次,取均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 流蘇子多糖的提取分離

流蘇子經(jīng)石油醚脫脂,70%乙醇除去小分子極性成分,熱水提取乙醇沉淀,除蛋白等處理后,得到除蛋白質(zhì)后流蘇子粗多糖,得率為0.21%。

流蘇子粗多糖經(jīng)DEAE-52色譜柱,超純水和不同濃度的NaCl溶液洗脫,得到2個含量高的主峰,洗脫曲線見圖1,分別合并命名為CR-1和CR-2。CR-1和CR-2經(jīng)Sephadex G-100凝膠色譜柱進一步純化,洗脫曲線見圖2,CR-1純化后得到1個主峰,且含量高,濃縮、透析、凍干得到白色粉末,命名為CRp-1;CR-2純化也得到1個主峰,但其含糖量低,在此不做研究。

圖1 流蘇子粗多糖經(jīng)DEAE-52纖維素柱色譜洗脫曲線

圖2 CR-1經(jīng)Sephadex G-100凝膠柱色譜洗脫曲線

2.2 多糖CRp-1理化性質(zhì)

2.2.1 多糖CRp-1的一般理化性質(zhì) 多糖CRp-1的理化性質(zhì)如表1所示。CRp-1為白色粉末,易溶于水,不溶于甲醇、乙醇、正丁醇、丙酮等有機溶劑。CRp-1的總糖含量為97.12%,蛋白質(zhì)含量為1.65%。Fehling試劑反應(yīng)和三氯化鐵反應(yīng)均為陰性,表明CRp-1不含單糖和多酚;I-KI反應(yīng)為陰性,說明CRp-1不是淀粉多糖。

表1 多糖CRp-1的一般理化性質(zhì)

2.2.2 多糖CRp-1的紫外全波長掃描 多糖CRp-1的紫外可見全波長掃描光譜如圖3所示。從圖3可以看出,在190～200 nm顯示多糖的特征吸收,在260和280 nm處均無明顯吸收,表明多糖CRp-1中的核酸和蛋白質(zhì)基本已除盡[19]。

圖3 CRp-1紫外全波長掃描圖

2.2.3 多糖CRp-1的相對分子量 采用高效凝膠排阻色譜法對多糖CRp-1進行分子量測定,結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出,CRp-1其峰形基本對稱,CRP-1的相對分子量(Mw)為223200 g/mol,分布系數(shù)(Mw/Mn)為1.774。

表2 CRp-1的單糖組成成分

圖4 CRp-1高效凝膠排阻色譜洗脫曲線

2.2.4 多糖CRp-1的單糖組成成分分析 CRp-1經(jīng)酸水解、乙酰化后得到乙?；苌?進行GC分析,與標準混合單糖乙?；蟮腉C圖譜進行對比,結(jié)果如圖5和表2所示,從CRp-1中鑒定出6 種單糖,鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖,其摩爾比為1∶5.381∶1.146∶10.804∶6.953∶11.908。

圖5 標準混合單糖(A)和CRp-1(B)衍生化后的氣相色譜圖

2.2.5 多糖CRp-1的紅外光譜分析 CRp-1的FT-IR圖如圖6所示,主要吸收峰歸屬如下[23-24]:在3385.20 cm-1附近的峰主要是多糖O-H的伸縮振動峰,2933.60 cm-1為C-H的伸縮振動峰,1646.72 cm-1為C-OH的彎曲振動，1417.11 cm-1為 C-O伸縮振動，1062.71 cm-1附近有兩個峰，表明含有呋喃糖苷，峰873.22和814.37 cm-1提示含有甘露糖，這與單糖組成成分一致。

圖6 CRp-1的紅外光譜圖

2.2.6 多糖CRp-1的三空間構(gòu)象 剛果紅在不同的堿性溶液中與三螺旋多糖反應(yīng),可使最大吸收向長波方向移動。CRp-1在不同NaOH濃度(0～0.5 mol/L)下的螺旋-線圈躍遷分析如圖7所示。剛果紅試劑的最大吸收波長隨著NaOH濃度的不斷增加而減少,而CRp-1溶液的最大吸收波長由474 nm移至483 nm,并在0.35 mol/L NaOH溶液中出現(xiàn)最大吸收波長,以上表明多糖CRp-1已與剛果紅形成了三螺旋絡(luò)合物,可見,多糖CRp-1具有三股螺旋結(jié)構(gòu)。

圖7 剛果紅-CRp-1絡(luò)合物最大吸收波長變化

2.2.7 多糖CRp-1的微觀結(jié)構(gòu) 多糖CRp-1的掃描電鏡圖像如圖8所示。可以看出,多糖CRp-1具有三維多孔結(jié)構(gòu),帶有一定的圓形顆粒。來源不同、純化工藝不同會導(dǎo)致多糖的表面結(jié)構(gòu)不同,如從巴楚蘑菇中分離得到的兩個多糖HLP1-1和HLP2-1,HLP1-1為細孔膠束結(jié)構(gòu),HLP2-1為集體塊狀結(jié)構(gòu)[17];如從補骨脂中分離得到的兩個多糖PCp-I和PCp-II,均經(jīng)過冷凍干燥處理,但是PCp-I具有不規(guī)則的多孔結(jié)構(gòu),PCp-II呈片狀、不規(guī)則彎曲[25],其結(jié)構(gòu)的差異可能與純化工藝、電負性等有關(guān)。

圖8 CRp-1的掃描電鏡圖

2.3 體外α-葡萄糖苷酶抑制活性

多糖CRp-1對α-葡萄糖苷酶的抑制活性結(jié)果如圖9所示。在實驗濃度范圍內(nèi)(0～8 mg/mL),CRp-1表現(xiàn)出一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性,具有濃度依賴性。與陽性對照阿卡波糖(IC50=0.72±0.08 mg/mL)相比,CRp-1(IC50=6.93±0.13 mg/mL)對α-葡萄糖苷酶抑制活性相對低。先前的文獻報道表明多糖具有抑制α-葡萄糖苷酶的活性,多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制活性主要與分子量、單糖組成、構(gòu)型等有關(guān)[26-28]。陳慶等[29]發(fā)現(xiàn)從刺梨中得到的兩個多糖RSPs-40和RSPs-60均具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用,分子量大小分別為228.298和124.144 kDa,RSPs-40主要由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、果糖和半乳糖醛酸組成,而RSPs-60主要由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和半乳糖醛酸組成;蓮霧多糖也具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用,分子量為49.9 kDa,主要由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖,分子量為49.9 kDa[30]?？梢?多糖CRp-1對α-葡萄糖苷酶的抑制作用可能與其單糖組成和分子量等有關(guān)。

圖9 不同質(zhì)量濃度的CRp-1對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

3 結(jié)論

以流蘇子為原料,通過水提醇沉法提取多糖,Sevage法除蛋白,DEAE-52纖維和Sephadex G-100凝膠柱色譜進行分離純化,得到多糖CRp-1。分析表明,多糖CRp-1外觀為白色粉末,三股螺旋結(jié)構(gòu),且表面為三維多孔結(jié)構(gòu),并帶有一定的圓形顆粒。不含單糖和多酚,不屬于淀粉多糖,具有多糖的溶解性,溶于水,不溶于有機溶劑。總糖含量為97.12%,蛋白質(zhì)含量為1.65%,主要由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖,其摩爾比為1∶5.381∶1.146∶10.804∶6.953∶11.908,相對分子質(zhì)量分別為223200 g/mol;結(jié)構(gòu)中含有糖醛酸和β-吡喃糖。體外活性顯示,CRp-1可濃度依賴性的抑制α-葡萄糖苷酶活性。