胡 誠,逄曉陽,呂加平,劉 騫,蘆 晶,張書文,依勝男,郝莉雨,許曉曦,*,冷友斌

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,北京 100193;3.黑龍江飛鶴乳業(yè)有限公司,北京 100015)

輪枝鐮孢菌是一種常見的鐮孢霉菌,在生長過程中可產(chǎn)生多種毒素,常常污染糧食、蔬菜和飼料,人畜食用了被這些毒素污染的食物會出現(xiàn)惡心、嘔吐的中毒反應(yīng),嚴(yán)重的甚至?xí)?dǎo)致人畜死亡[1-3]。為了防止農(nóng)作物被霉菌污染引起腐爛,目前常采用的方法是化學(xué)防腐,其不僅安全性無法保證,還會導(dǎo)致耐藥菌株的大量出現(xiàn)[4-5]。此外也有采用物理防腐的方法,但物理防腐通常存在殺菌不徹底的問題,無法保證農(nóng)作物的儲藏期有效延長[6-7]。在中國已經(jīng)進(jìn)入營養(yǎng)健康的大時代背景下,亟待開發(fā)綠色安全的新型防霉保鮮劑[8]。

國內(nèi)外學(xué)者很早就開始了綠色防霉保鮮劑的開發(fā)工作,先后從傳統(tǒng)發(fā)酵食品、泡菜、麥芽、小麥儲糧、面團(tuán)等材料中分離了許多有一定防腐抗霉功能的乳酸菌株。如Matei等[8]從腌菜中分離出3株能夠顯著抑制黃曲霉和黑曲霉菌絲生長和孢子形成的乳酸菌株。Tropcheva等[9]從保加利亞的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品“katak”中分離出四株具有抗曲霉、鐮刀菌、青霉、木霉的短乳桿菌。Lynch等[10]報道了將食淀粉乳桿菌DSM 19280用于切達(dá)奶酪防腐,可有效延遲霉菌變質(zhì)發(fā)生的時間6～9 d。Belkacem-Hanfi等[11]從小麥儲糧中分離出54株乳酸菌,經(jīng)過抗霉菌活性篩選,發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌、草乳桿菌具有顯著抑制赭曲霉毒素(OTA)產(chǎn)生及菌株生長繁殖的活性。Ahlberg等[12]分離的乳酸菌可以顯著減輕食品或飼料中黃曲霉毒素。在國內(nèi),張柏林等[13]首次報道了有關(guān)乳酸菌抗真菌活性及其抑制真菌毒素的研究。王海寬等[14]、呂欣等[15]從中國傳統(tǒng)發(fā)酵制品中篩選出對霉菌有明顯拮抗作用的乳酸菌,分別為植物乳桿菌和干酪乳桿菌。李紅娟等[16]從傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中選育得到一株具有優(yōu)良抗青霉特性的干酪乳桿菌AST18,并應(yīng)用于乳制品中,取得非常好的抗青霉效果。

目前少有針對輪枝鐮孢菌的綠色防霉保鮮劑的相關(guān)研究,因此篩選具有良好抑制輪枝鐮孢菌性能的乳酸菌并將其應(yīng)用到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和儲藏中,有重要的實際應(yīng)用價值[17]。本研究從132種乳酸菌菌株中篩選到1株具有明顯抑制輪枝鐮孢菌生長的菌株,并對該菌的抑菌物質(zhì)及特性進(jìn)行了初步研究,以期將其應(yīng)用于玉米防霉中,為開發(fā)抗輪枝鐮孢菌的綠色安全防腐劑奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

132株乳酸菌 由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所乳品實驗室保藏;輪枝鐮孢菌JF-5-1(Fusariumverticillium) 由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所植物病理學(xué)實驗室保藏;MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、PDB培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司;溶菌酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等 美國Sigma公司;TransFast? Taq DNA Polymerase 北京全式金生物技術(shù)有限公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技有限公司;擴(kuò)增引物 北京Invitrogen 公司合成;Tween-80 國產(chǎn)分析純。

LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;SK15離心機(jī) 美國Sigma公司;SPARK 20M多功能酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀 日本Takara公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌的培養(yǎng)及上清液的提取 取凍存的132株乳酸菌菌株進(jìn)行活化傳代培養(yǎng)。按2%的接種量,將已活化至生長對數(shù)期的乳酸菌接種于MRS液體培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)48 h,經(jīng)離心(8000 r/min,15 min)收集上清液。將上清液用0.22 μm無菌濾膜過濾[18]。

1.2.2 輪枝鐮孢菌JF-5-1孢子懸浮液的制備 按6%的接種量移取FusariumoxysporumJF-5-1種子液至裝有100 mL PDB培養(yǎng)基錐形瓶中,在200 r/min、30 ℃條件下的搖床中振蕩培養(yǎng)3 d。吸取培養(yǎng)在PDB培養(yǎng)基中FusariumoxysporumJF-5-1菌株200 μL涂布在PDA固體培養(yǎng)基平皿,30 ℃恒溫培養(yǎng)3 d左右至長滿整個培養(yǎng)皿,用含有0.05%(V/V)吐溫80的滅菌水沖洗FusariumverticilliumJF-5-1固體培養(yǎng)皿,采用400目無菌紗布過濾除去菌絲,過濾后的孢子懸浮液使用血球計數(shù)板調(diào)節(jié)孢子濃度至106mL-1[19-20]。

1.2.3 抑制輪枝鐮孢菌的乳酸菌篩選

1.2.3.1 乳酸菌的初篩實驗 使用雙層平板拮抗法篩選對FusariumverticilliumJF-5-1具有拮抗作用的乳酸菌。乳酸菌在下層MRS瓊脂培養(yǎng)基劃線,37 ℃培養(yǎng)48 h后,上層傾倒15 mL PDA培養(yǎng)基,并吸取200 μL提前制備好的FusariumverticilliumJF-5-1孢子懸浮液于PDA培養(yǎng)基上涂布。30 ℃培養(yǎng)48 h,觀察抑菌情況[21]。

1.2.3.2 16S rDNA鑒定 對初篩的乳酸菌進(jìn)行分析,選取后續(xù)實驗需要的菌株進(jìn)行16S rDNA鑒定。具體操作步驟為:乳酸菌DNA的提取→DNA電泳檢測→PCR擴(kuò)增→PCR產(chǎn)物電泳檢測→測序→同源性分析[22-23]。

1.2.3.3 抗輪枝鐮孢菌的乳酸菌復(fù)篩實驗 為了更加全面精確的分析出初篩的乳酸菌菌株的抑菌能力,分別采用瓊脂柱法和微量稀釋法對抑菌活性進(jìn)行檢測。

復(fù)篩方法1:瓊脂柱法[24]:取10%上清發(fā)酵液加入PDA培養(yǎng)基,以純PDA培養(yǎng)基為對照。用直徑6 mm的FusariumverticilliumJF-5-1菌餅置入培養(yǎng)基中心,30 ℃恒溫培養(yǎng)并觀察,采用十字交叉法測量菌體的直徑,當(dāng)對照組菌體完全鋪滿時,計算所有培養(yǎng)皿中菌體面積,求出各菌抑菌率。此方法抑菌率計算公式如下:

圖1 不同條件對抑菌活性影響的實驗設(shè)計圖

抑菌率(%)=(1-樣品組菌餅面積/空白組菌餅面積)×100

式(1)

復(fù)篩方法2:微量稀釋法。參照Gerez等[25]、Zhao等[26]及馬歡歡等[27]方法并稍加改進(jìn)。取80 μL孢子懸浮液,100 μL PDB培養(yǎng)基和20 μL不同乳酸菌的上清液添加到孔板中30 ℃恒溫培養(yǎng),以20 μL MRS肉湯培養(yǎng)基代替乳酸菌的上清液作為對照組。觀察每個孔板里孢子的生長情況,并在48 h及以后每隔12 h測量一次抑菌率。此方法抑菌率計算公式如下:

抑菌率(%)=(1-ODLAB/ODMRS)×100

式(2)

式中:ODLAB表示實驗組培養(yǎng)時的OD580 nm;ODMRS表示MRS肉湯作為對照培養(yǎng)時的OD580 nm。

結(jié)合兩種抑菌方法,分析各乳酸菌的抑菌能力,選取最佳菌株及其對比菌株進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.4 目標(biāo)菌株生長曲線、pH及抑菌效果變化分析 取目標(biāo)菌株按照2%的接種量37 ℃培養(yǎng),每間隔6 h測定其上清液OD600、pH及抑菌率。抑菌率測定方法采用1.2.3.3的復(fù)篩方法1瓊脂柱法。

1.2.5 乳酸菌抑菌成分特性分析 菌株培養(yǎng)液分別經(jīng)過過氧化氫酶、蛋白酶、不同溫度及pH處理后采用微量稀釋法[28],分析目標(biāo)菌株的抑菌物質(zhì)類別及其對pH和溫度的敏感性。外圈每孔加入200 μL無菌蒸餾水封邊,以保護(hù)內(nèi)部樣品減少誤差。具體操作如圖1所示。

1.2.5.1 過氧化氫酶處理 在菌株上清液中加入過氧化氫酶,使其終濃度達(dá)1 mg/mL,37 ℃水浴24 h。以MRS肉湯培養(yǎng)基和原乳酸菌上清液作為對照。

1.2.5.2 蛋白酶處理 在菌株上清液中分別加入木瓜蛋白酶、胰蛋白酶(1 mg/mL)在最適pH(6.0,8.0)最適溫度(55、37 ℃)2 h水浴處理,80 ℃,10 min水浴滅活,處理后將pH調(diào)回起點值。以MRS肉湯培養(yǎng)基和原乳酸菌上清液作為對照。

1.2.5.4 pH敏感性實驗 將上清液調(diào)節(jié)pH至2.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10.0。用pH=3.5的乳酸和乙酸調(diào)節(jié)MRS肉湯培養(yǎng)基,以及MRS肉湯培養(yǎng)基和原乳酸菌上清液作為對照。

1.2.6 目標(biāo)菌株的最小抑菌濃度(MIC)測定 采用兩倍稀釋肉湯法測定乳酸菌菌株培養(yǎng)液對FusariumverticilliumJF-5-1的MIC[28]。將菌株上清液真空冷凍干燥,用PDB液體培養(yǎng)基將粉末稀釋定容至5 mL,終濃度為32.0、16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25 mg/mL,以PDB培養(yǎng)基不加粉末為對照組。分別加入100 μL、106CFU/mL的FusariumverticilliumJF-5-1孢子懸浮液,30 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h后肉眼觀察試管無混濁現(xiàn)象的最低濃度為菌株的MIC。

1.2.7 目標(biāo)菌株在玉米防霉中的應(yīng)用 在100 mL錐形瓶中放入10 g新鮮玉米粒,再分別加入5 mLFusariumverticilliumJF-5-1孢子懸浮液+5 mL滅菌水(a)、10 mL滅菌水(b)、5 mLFusariumverticilliumJF-5-1孢子懸浮液+5 mL乳酸調(diào)節(jié)pH=3.5的MRS(d)、5 mL滅菌水+5 mL乳酸調(diào)節(jié)pH=3.5的MRS(d)、5 mLFusariumverticilliumJF-5-1孢子懸浮液+5 mL菌株48 h發(fā)酵上清液(e)以及5 mL菌株48 h發(fā)酵上清液+5 mL滅菌水(f)浸泡玉米粒30 ℃,24 h后倒出水分,將玉米粒放入平皿中,每日分別使用滅菌水、pH=3.5的MRS和上清液噴玉米粒表面,觀察霉菌生長情況并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 18.5和Microsoft Excel 2016軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理與作圖分析。各實驗均平行重復(fù)3次,試驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗輪枝鐮孢菌的乳酸菌初篩分析

將雙層平板拮抗法得到的結(jié)果通過對抑菌區(qū)域大小分為“+++”、“++”、“+”、“-”四個等級。具體劃分依據(jù)如下:+++:抑菌面積占培養(yǎng)皿面積大于50%;++:抑菌面積占培養(yǎng)皿面積25%～50%;+:抑菌面積占培養(yǎng)皿面積小于25%;-:無抑菌區(qū)域。初篩結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖2),抑菌能力為“+++”的共有17株(13%),抑菌能力為“++”的共有58株(44%),抑菌能力為“+”的共有46株(35%),抑菌能力為“-”的共有11株(8%)。

表1 待測菌株測序結(jié)果

圖2 不同抑菌能力的抑菌效果對比

2.2 初篩乳酸菌的16S rDNA序列同源性鑒定

對初篩抑菌能力為“+++”和“-”的乳酸菌提取基因組DNA,PCR擴(kuò)增其16S rDNA序列。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序后,通過BLAST程序與NCBI數(shù)據(jù)庫中已報道的菌株序列進(jìn)行比對分析。其鑒定分析結(jié)果如下:

相對于其他施工技術(shù)，帷幕灌漿技術(shù)操作較為方便。在開展帷幕灌漿技術(shù)的過程中，必須充分結(jié)合施工方案，在合理的位置進(jìn)行鉆探和灌漿。隨著時間的延續(xù)，水泥會完成凝固，凝固的水泥和周圍的泥土形成堅硬的保護(hù)物，也就是形成了效果較好的帷幕防滲系統(tǒng)。帷幕灌漿技術(shù)具有以下特點：適用范圍廣、施工成本低、施工成果佳。

通過分析發(fā)現(xiàn)抑菌效果優(yōu)異的菌株中主要以鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌為主。而抑菌能力為“-”的菌株則種屬各異,但未發(fā)現(xiàn)有植物乳桿菌無抑菌性。考慮到后期計劃用組學(xué)技術(shù)找到親緣關(guān)系極相近的兩種乳酸菌進(jìn)行差異代謝物分析,經(jīng)過預(yù)實驗,選用鼠李糖乳桿菌進(jìn)行后續(xù)復(fù)篩實驗。

2.3 抗輪枝鐮孢菌的乳酸菌復(fù)篩實驗

通過對鼠李糖乳桿菌2、30、53、61、89、91、92、100和103號菌株進(jìn)行復(fù)篩,選取最終目標(biāo)菌株。

2.3.1 瓊脂柱法測定 其抑菌率利用瓊脂柱法進(jìn)行抑菌能力測定,通過十字交叉法測量其直徑,并通過公式計算抑菌率,結(jié)果見表2。

表2 瓊脂柱法測定不同菌株抑菌效果

通過表2分析91號菌株抑菌率最高,為72.82%。89號菌株抑菌率最低,無明顯抑菌性,抑菌率僅為6.74%。

2.3.2 微量稀釋法測定其抑菌率 通過微量稀釋法加入不同上清液后觀察微孔內(nèi)的孢子生長情況,在24 h時對照組已經(jīng)渾濁,89號觀察到有霉菌零星長出,48 h時,2、53、61和89號均有霉菌長出,其中89號的霉菌數(shù)量最多,但因其附著于底且并未鋪滿,所以并沒有直觀反映在吸光度上。在72 h時89號菌霉菌已鋪滿底部,孔內(nèi)較為渾濁。84 h時,僅有2、91和100號菌株未有霉菌出現(xiàn),其他孔內(nèi)均有霉菌出現(xiàn),部分孔內(nèi)白色菌絲長于液體表面。將所有數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總,如表3所示。

通過表3可看出在48 h時,抑菌率均在78%～84%之間,在72 h時89抑菌率降為66.83%,96 h時僅有2、91以及100號三株菌抑菌率仍在80%以上。故此方法表明2、91和100號展現(xiàn)出了更加良好的抑菌性。

根據(jù)兩種方法復(fù)篩,綜合觀察分析,91號菌株抑菌效果最為顯著(P<0.05)并且效果穩(wěn)定,重復(fù)性較好,故選用91號菌株進(jìn)行后續(xù)實驗。

表3 不同菌株上清液的抑菌率

2.4 91號菌株生長曲線及不同時間抑菌率的變化

通過對91號菌株不同發(fā)酵時間OD值和pH的測定繪制其生長和pH變化曲線如圖3所示。

圖3 91號菌株的生長和pH變化曲線

由圖3可以看出,91號菌株在培養(yǎng)6 h后進(jìn)入對數(shù)生長期,OD600迅速增加,pH迅速減小，至18 h逐漸進(jìn)入穩(wěn)定期,最終pH降至3.59并趨于穩(wěn)定,OD600值趨于1.71。

對不同發(fā)酵時間點的抑菌率進(jìn)行測定結(jié)果如圖4所示,在6 h時抑菌能力微弱,12和18 h隨著乳酸菌進(jìn)入對數(shù)生長期,分泌大量代謝物,抑菌率升至52.0%和55.2%。在第30～66 h時間段,抑菌率變化在70.4%～74.4%之間。在第72～108 h之間,抑菌率變化在76.8%～82.1%之間。

圖4 91號菌株不同發(fā)酵時間抑菌能力變化情況

2.5 91號乳酸菌抑制輪枝鐮孢菌的抑菌成分初步分析

對乳酸菌上清液分別進(jìn)行過氧化氫酶處理、蛋白酶處理、溫度調(diào)節(jié)及調(diào)節(jié)pH,對上清液里的抑菌成分及特性進(jìn)行初步分析。圖5、圖6和圖7為不同處理下48 h時的OD580值。

圖5 91號上清液的不同酶處理對抑菌效果的影響

圖6 91號上清液的不同熱處理對抑菌效果的影響

圖7 91號上清液的不同pH處理對抑菌效果的影響

由圖5經(jīng)分析數(shù)據(jù)可知,91號菌株上清液的抑菌率為85.9%。而添加過氧化氫酶對抑菌率無影響(與上清液相比),證明上清液中抑制輪枝鐮孢菌的物質(zhì)并不是過氧化氫。分別用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶處理后觀察上清液抑菌活性，發(fā)現(xiàn)蛋白酶處理后未對抑菌活性產(chǎn)生較大影響,由圖5可知加入蛋白酶的OD580值與原上清液無顯著性差異。故上清液中沒有對木瓜蛋白酶與胰蛋白酶敏感的蛋白類物質(zhì)。

在不同溫度熱處理實驗中,分別在37、60、80、100以及121 ℃處理30 min后,觀察抑菌活性。結(jié)果圖6所示,熱處理并未影響其抑菌性,抑菌率均在84%～87%之間,證明上清液中含有能夠耐高溫的抑菌物質(zhì)。抑菌物質(zhì)的穩(wěn)定性較好,這和杜靜芳等[28]篩選的可以抑制阪崎腸桿菌的乳酸菌研究結(jié)果一致。

表4 不同處理組對玉米儲存的影響

由圖7經(jīng)分析數(shù)據(jù)可知,通過將91號菌株上清液pH調(diào)至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10.0以及用乳酸和乙酸調(diào)節(jié)滅菌水至pH=3.5對照,發(fā)現(xiàn)在pH=4.5時,抑菌活性受到影響,抑菌率降為64.1%、pH=5時,抑菌率急速下降為25.0%,當(dāng)pH大于等于5.5時,91號菌株抑菌活性全部喪失。通過乳酸和乙酸調(diào)節(jié)MRS培養(yǎng)基至pH=3.5發(fā)現(xiàn)48 h無渾濁現(xiàn)象,未有孢子長出,抑菌效果顯著。這與Muhialdin等[29]的研究結(jié)果相似。證明抑菌物質(zhì)受pH變化影響較大,故推測上清液中可能含有酸類抑菌物質(zhì)。

2.6 91號菌株的MIC值

將乳酸菌上清液凍干后稀釋定容至相應(yīng)濃度,以PDB培養(yǎng)基不加粉末為對照組。各濃度培養(yǎng)24 h后肉眼觀察試管有無渾濁現(xiàn)象,觀察發(fā)現(xiàn)在8 mg/mL及以上濃度試管均清澈透明,4 mg/mL略有渾濁,2 mg/mL及以下有明顯渾濁,菌絲生長明顯。故確定8 mg/mL為91號菌株對FusariumverticilliumJF-5-1的最小抑菌濃度。

2.7 91號菌株在玉米防霉中的應(yīng)用

實驗結(jié)果如表4所示,在第3 d,a組和b組均出現(xiàn)不同情況的白色菌絲出現(xiàn),第3 d如圖8所示。c組第9 d根部有菌絲長出,而d組、e組和f組10 d仍未有霉菌長出。總體來說,抑菌效果較為明顯,并且證明了乳酸可以抑制玉米粒霉菌的生長,但上清液中含有其他抑菌物質(zhì)有待進(jìn)一步發(fā)掘。Muhialdin等[30]使用從植物乳桿菌TE10提取的多肽來抑制黃曲霉在玉米新鮮種子上的生長,研究表明加入多肽的抑制組7 d后仍無孢子和菌絲生長,同樣證明了乳酸菌對玉米防腐的應(yīng)用潛力。

圖8 玉米粒3 d后霉菌生長情況

3 結(jié)論

生物防控是以安全性為首要特征的一類研究領(lǐng)域,而用乳酸菌來有效抑霉也是當(dāng)今的研究熱點之一。本研究篩選出的91號菌株具有良好的抑制輪枝鐮孢菌的能力,經(jīng)過16S rDNA鑒定菌株為鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)。該菌株已經(jīng)在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心做了菌株的專利保藏,菌株保藏號為CGMCC No.18210。通過過氧化氫酶處理,蛋白酶處理,溫度調(diào)節(jié)及pH調(diào)節(jié)對91號乳酸菌上清液進(jìn)行處理研究,初步推測其抑菌成分主要為有機(jī)酸,上清液的最小抑菌濃度為8.0 mg/mL。添加91號菌株48 h發(fā)酵上清液可抑制玉米中霉菌生長10 d,延長玉米儲藏期。下步將通過分離純化方法及組學(xué)技術(shù)對具體抑菌物質(zhì)及抑菌機(jī)理進(jìn)一步深入研究,為探究出一種新型安全有效的抑霉、控霉生物防控方式奠定基礎(chǔ)。將91號菌株應(yīng)用在玉米防霉中可顯著抑制輪枝鐮孢菌的生長,延緩玉米的腐敗變質(zhì),保障玉米的質(zhì)量和貨架期,減少霉菌毒素對人體的危害,從而保證我國國民的健康水平,具有很廣闊的應(yīng)用前景。