常學(xué)輝,張良芝

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,河南 鄭州450002;2.河南中醫(yī)藥大學(xué),河南 鄭州450046)

帕金森病(Parkinson＇s disease,PD)屬于中醫(yī)“顫證”“震顫”等范疇,是臨床中老年人多見(jiàn)的一種神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病[1]?？诜幬?、外科手術(shù)治療該病均有一定的局限性,目前潛力較大、臨床應(yīng)用前景較好的治療策略之一是干細(xì)胞移植治療[2]。但有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)移植后,PD患者癥狀雖然有一定的好轉(zhuǎn),但是移植后NSCs的存活率偏低,同時(shí)誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元的轉(zhuǎn)化分化率較低,最終使能發(fā)揮作用的多巴胺神經(jīng)元的數(shù)量減少,不足以達(dá)到治療的目的,使其治療PD的長(zhǎng)期療效受限[3]。龜羚帕安丸是本院腦病科研制的用于治療PD、PD綜合征的中藥復(fù)方,前期臨床研究表明,龜羚帕安丸治療PD臨床療效顯著;前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明,龜羚帕安丸具有明顯的抗細(xì)胞凋亡的作用,具有誘導(dǎo)NSCs分化為成熟多巴胺能神經(jīng)元的作用,并使之最終轉(zhuǎn)化為DA,這可能是龜羚帕安丸治療PD的機(jī)制之一[4-7]。本研究采用6-羥基多巴胺(6-OHDA)立體定向注射法制備PD大鼠模型,觀察NSCs定位移植聯(lián)合龜羚帕安丸口服對(duì)PD模型大鼠中腦黑質(zhì)多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(DAT)、轉(zhuǎn)錄因子-4(Brn-4)表達(dá)的影響,為其進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SD大鼠,SPF級(jí),體質(zhì)量(200±20)g,雄性大鼠90只用于造模,另10只雌性大鼠及5只雄性大鼠用于神經(jīng)干細(xì)胞制備。大鼠購(gòu)于山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(晉)20150001。實(shí)驗(yàn)在河南省中醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室[SYXK(豫)2011-0002]進(jìn)行,采用IVC大鼠獨(dú)立通風(fēng)系統(tǒng),明暗交替各12 h進(jìn)行光照,溫度20～26℃,濕度40%～70%,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 藥物及試劑 美多芭(多巴絲肼片,上海羅氏制藥有限公司,規(guī)格:250 mg,批號(hào):H10930198);龜羚帕安丸(河南省中醫(yī)院院內(nèi)制劑,鄭衛(wèi)制劑Z04010162,規(guī)格:60 g/瓶,批號(hào):Z04010162);阿撲嗎啡(APO,Sigma公司,批號(hào):Z100839);6-羥基多巴胺(6-OHDA,Sigma公司,批號(hào):S30042);4%水合氯醛(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所,批號(hào):20160312);注射用青霉素鈉(華北制藥股份有限公司,批號(hào):F1306208);DMEM/F12培養(yǎng)基(Hy Clone,批號(hào):SH30023．01);2%B27添加劑(Invitrogen,批號(hào):17504-044);25%胰蛋白酶(上?；鶢栴D公司,批號(hào):BYL409267);bFGF(NOVO,批號(hào):C046);Brn-4檢測(cè)試劑盒(Abcam公司,批號(hào):ab104562);DAT檢測(cè)試劑盒(武漢博士德,批號(hào):A4131);SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒均購(gòu)于武漢博士德有限公司,PBS緩沖液(批號(hào)ZM0013)購(gòu)于中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器 大鼠腦立體定向儀(Stoelting公司);高速顱骨鉆(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司);5μL微量進(jìn)樣器(上海安亭微量進(jìn)樣器廠);Olympus光學(xué)顯微鏡。

2 方法

2.1 NSCs的培養(yǎng)與鑒定 根據(jù)文獻(xiàn)制備:在SD大鼠動(dòng)情期時(shí)按照2∶1的雌雄比例合籠,第2日早晨檢查雌鼠陰道栓,并行陰道涂片,如發(fā)現(xiàn)陰道栓(表現(xiàn)為米粒大小、白色),或者陰道涂片在光學(xué)顯微鏡下發(fā)現(xiàn)精子者記為Ed 0.5,雌鼠常規(guī)飼養(yǎng)15 d[8]。頸椎脫臼法處死孕鼠,取出胚胎,摘取胎頭,分離雙側(cè)海馬組織,剪碎,使細(xì)胞液成為均勻懸濁液,制備N(xiāo)SCs,采用Nestin鑒定法,若Nestin陽(yáng)性表達(dá),提示其為神經(jīng)干細(xì)胞。

2.2 藥物制備 美多芭用0.9%氯化鈉注射液稀釋為2.0 mg/mL,現(xiàn)配現(xiàn)用。龜羚帕安丸研末,過(guò)120目篩,用0.9%氯化鈉注射液分別稀釋為0.4、0.2、0.1 mg/mL混懸液,4℃保存,備用。

2.3 PD大鼠模型制備 選用SPF級(jí)SD雄性大鼠,APO以0.5 mg/kg腹腔注射,選擇未出現(xiàn)震顫、旋轉(zhuǎn)等行為的大鼠,稱(chēng)重后用4%水合氯醛按照8 mL/kg腹腔注射麻醉;固定,頭部備皮,消毒,手術(shù)刀沿頭皮正中縱線切1個(gè)1～2 cm的切口,暴露前、后囟門(mén)。參照《大鼠腦立體定位譜圖》,行腦立體定位[大鼠右側(cè)中腦黑質(zhì)致密部(SNC)坐標(biāo):距前囟中心后(A/P)4.6 mm,距前囟中心左右(L/R)1.7 mm,距腦膜表面深度(O/V)7.6 mm],定位后用牙科鉆垂直鉆孔,直至穿透SD大鼠顱骨;用微量取樣器抽取6-OHDA溶液,按1 mm/min的速度緩慢進(jìn)針,至預(yù)定深度后,以1μL/min的速度緩慢推入6-OHDA溶液,留針10 min。緩慢出針后常規(guī)縫合,10萬(wàn)單位青霉素肌內(nèi)注射消毒,連續(xù)局部注射7 d。術(shù)后1周APO按0.5 mg/kg腹腔注射誘導(dǎo)大鼠旋轉(zhuǎn),如SD大鼠出現(xiàn)左側(cè)逆時(shí)針旋轉(zhuǎn),并且在30 min內(nèi)平均旋轉(zhuǎn)圈數(shù)＞7 r/min,則視為PD大鼠模型建立[9]。

2.4 神經(jīng)干細(xì)胞移植 標(biāo)記F2代NSCs球神經(jīng)干細(xì)胞Brdu[10],收集F3代的NSCs液體置于無(wú)菌離心管內(nèi),以1 000 rpm離心5 min;去上清,加入PBS,用氣囊吹打成細(xì)胞密度為106個(gè)/m L的單細(xì)胞懸液。然后按照PD模型腦立體定向方法,選取右側(cè)紋狀體坐標(biāo)(A/P 0.5 mm、L/R 3.0 mm、O/V 5.0 mm),用微量取液器抽取5μL NSCs懸液緩慢注射,其余步驟(備皮、定位、穿刺、術(shù)后縫合消毒等)與PD模型制作相同。

2.5 分組與給藥方法 選擇造模成功的PD模型大鼠60只,稱(chēng)重,按隨機(jī)數(shù)字表法分為中藥高劑量組、中藥中劑量組、中藥低劑量組、美多芭組、NSCs移植對(duì)照組及空白對(duì)照組,每組10只。除空白對(duì)照組給予0.9%氯化鈉注射液5μL注射外,其余各組均移植NSCs懸液5μL。中藥高、中、低劑量組按照3.6、1.8、0.9 g/(kg·d－1)分別灌胃,美多芭組按照50 mg/(kg·d－1)灌胃,NSCs移植對(duì)照組和空白對(duì)照組予以等容積0.9%氯化鈉注射液灌胃。每日灌胃2次,連續(xù)28 d。

2.6 DAT、Brn-4蛋白表達(dá)測(cè)定 末次灌胃后,每組動(dòng)物均快速斷頭取腦,放置于冰盤(pán),快速、完整地剝?nèi)∧X組織,置于含0.1%DEPC的4%多聚甲醛中以4℃固定4～6 h后,分離中腦黑質(zhì)。常規(guī)石蠟包埋,切片,每片厚度為5μm。采用免疫組化法檢測(cè)各組大鼠中腦黑質(zhì)DAT、Brn-4蛋白表達(dá),具體按試劑盒方法操作。在光鏡400倍視野下,每個(gè)切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野,檢測(cè)DAT、Brn-4蛋白表達(dá)數(shù)量,用平均積分光密度表示。石蠟制作、切片及指標(biāo)檢測(cè)均在鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院完成,專(zhuān)人操作。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,符合正態(tài)分布,且方差齊時(shí),采用單因素方差分析;不符合正態(tài)分布,方差不齊時(shí),采用多個(gè)相關(guān)樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

與空白對(duì)照組比較,各治療組大鼠中腦黑質(zhì)DAT、Brn-4蛋白表達(dá)顯著增高(P＜0.05或P＜0.01)。與NSCs移植對(duì)照組比較,美多芭組及中藥高、中劑量組DAT、Brn-4表達(dá)顯著增高,中藥低劑量組DAT表達(dá)顯著增高(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠中腦黑質(zhì)多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體、轉(zhuǎn)錄因子4蛋白的表達(dá)水平(±s)

表1 各組大鼠中腦黑質(zhì)多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體、轉(zhuǎn)錄因子4蛋白的表達(dá)水平(±s)

注:與空白對(duì)照組比較,△P＜0.05,△△P＜0.01;與NSCs移植對(duì)照組比較,▲P＜0.05,▲▲P＜0.01。

組別 只數(shù) DAT表達(dá)水平 Brn-4表達(dá)水平中藥高劑量組 10 113.58±14.06△△▲▲ 113.94±16.79△△▲▲中藥中劑量組 10 147.43±15.84△△▲▲ 132.07±17.60△△▲▲中藥低劑量組 10 83.43±17.16△△▲ 77.19±12.20△美多芭組 10 142.53±12.22△△▲▲ 96.14±19.71△△▲NSCs移植對(duì)照組 10 98.54±7.50△△ 71.21±18.11空白對(duì)照組 10 65.29±9.10 50.72±16.65

4 討論

PD是中老年人的常見(jiàn)病、多發(fā)病,中醫(yī)無(wú)PD病名,臨床一般根據(jù)其癥狀歸于“顫證”“振顫”等范疇。目前大多醫(yī)家認(rèn)為,PD病位在腦,為本虛標(biāo)實(shí)之證,本多為肝腎失調(diào),標(biāo)多為風(fēng)、痰、瘀互結(jié)。筆者依據(jù)腎-腦相關(guān)理論[11],結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn),認(rèn)為PD病位在腦,病理性質(zhì)總屬本虛標(biāo)實(shí),以腎精虧虛為本,以瘀風(fēng)互結(jié)為標(biāo),因腎精虧虛,使腦髓受損、陰虛風(fēng)動(dòng),加之瘀血阻絡(luò),蘊(yùn)塞腦竅而發(fā)本病。PD治療以滋補(bǔ)肝腎、化痰活血為法。龜羚帕安丸是河南省中醫(yī)院自制的治療PD的中藥復(fù)方,主要由龜板膠、羚羊角粉、厚樸、全蝎、威靈仙等藥物組成。方中龜板膠滋陰潛陽(yáng),補(bǔ)腎益血;羚羊角粉助龜板膠滋陰息風(fēng),止痙;全蝎祛風(fēng)止痙通絡(luò),佐助羚羊角粉活血息風(fēng);威靈仙搜風(fēng)通絡(luò),可以改善經(jīng)脈拘攣狀態(tài);厚樸溫中燥濕,消痰。諸藥合用,共奏滋補(bǔ)肝腎、通絡(luò)息風(fēng)、養(yǎng)血活血之功,是治療PD、PD綜合征療效顯著的復(fù)方制劑。

DAT是位于中樞多巴胺能神經(jīng)末梢突觸前膜的糖蛋白分子,在多巴胺能神經(jīng)元之間的信息傳遞過(guò)程中具有重要的作用,DAT能重新攝取已發(fā)揮生理作用的多巴胺(DA),調(diào)控突觸間隙DA水平,并維系突觸前DA的合成和儲(chǔ)存,是控制腦內(nèi)多巴胺水平的關(guān)鍵因素。腦內(nèi)的DA發(fā)揮作用后不會(huì)被直接滅活,其可通過(guò)神經(jīng)突觸前膜上的多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體返回神經(jīng)元細(xì)胞,所以腦內(nèi)DAT含量的多少可以間接反映體內(nèi)黑質(zhì)-紋狀體通路DA能神經(jīng)元的數(shù)量,DAT被當(dāng)作DA能神經(jīng)元的標(biāo)志物[12]。Brn-4是轉(zhuǎn)錄因子POU蛋白家族第3類(lèi)成員之一,研究表明,Brn-4在NSCs向神經(jīng)元分化成熟過(guò)程中具有十分重要的作用[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,美多芭組、中藥各劑量組、NSCs移植對(duì)照組黑質(zhì)DAT、Brn-4表達(dá)均顯著高于空白對(duì)照組(P＜0.05或P＜0.01);美多芭組及中藥高、中劑量組DAT、Brn-4表達(dá)顯著高于NSCs移植對(duì)照(P＜0.05或P＜0.01)。上述結(jié)果表明,美多芭及龜羚帕安丸均有上調(diào)DAT、Brn-4表達(dá)的作用,且效果優(yōu)于單純神經(jīng)干細(xì)胞移植。結(jié)合中醫(yī)“補(bǔ)腎生髓”理論與Brn-4促進(jìn)NSCs向神經(jīng)元細(xì)胞轉(zhuǎn)化,可以推測(cè)其作用機(jī)制可能與Brn-4能改善細(xì)胞微環(huán)境、釋放細(xì)胞外來(lái)信號(hào)等作用有關(guān)。因此,龜羚帕安丸口服聯(lián)合NSCs移植治療PD模型大鼠后,可以通過(guò)檢測(cè)PD大鼠中腦黑質(zhì)Brn-4含量,推測(cè)“腎-腦相關(guān)”理論與神經(jīng)干細(xì)胞-神經(jīng)細(xì)胞的平行關(guān)系。

綜上所述,龜羚帕安丸可能通過(guò)提高DAT、Brn-4蛋白的表達(dá),促進(jìn)NSCs向神經(jīng)元分化及新生神經(jīng)元轉(zhuǎn)向成熟細(xì)胞,提高NSCs移植存活率,這可能是龜羚帕安丸治療PD的作用機(jī)制之一。