顏少帥 張小可 楊現(xiàn)霞 王 虹

1.山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)化學(xué)與制藥工程學(xué)院，山東 泰安 271016；2.大連交通大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116028

迷迭香為唇形科草本植物。迷迭香中含有多種具有生理活性的化學(xué)成分，如：萜類、酚酸類、黃酮類等，其中萜類成分的鼠尾草酸、尾草酚、迷迭香酚和迷迭香酸等是其主要的抗氧活性成分[1-3]。近年來，迷迭香因其含有的天然抗氧化活性成分，在醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域也具有重要研究意義，迷迭香抗氧化劑已成為天然抗氧化劑研究與應(yīng)用中的熱點(diǎn)。臭氧衰老模型是一種急性致衰老模型，在形態(tài)、行為及與衰老相關(guān)的生化指標(biāo)的表征中與自然衰老動物模型具有高度相似性,其制備操作簡單，效果好，成功率高，是國際上公認(rèn)的造模方式。本實(shí)驗(yàn)建立小鼠臭氧衰老模型模擬阿爾茨海默病時腦內(nèi)氧化損傷等病變[4]，以吡拉西坦為陽性對照，采用行為學(xué)測試及生化指標(biāo)檢測等方法，觀察迷迭香提取物對臭氧衰老模型小鼠抗氧化能力的作用并對其可能機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1迷迭香醇提物的制備

通過對水提法和乙醇提取法兩種方法分別進(jìn)行單因素正交實(shí)驗(yàn)研究，以迷迭香提取物總黃酮和迷迭香酸的含量為檢測標(biāo)準(zhǔn)，確定迷迭香提取物的提取方法為乙醇提取法。提取步驟如下：稱取30 g磨碎的迷迭香置于三口燒瓶中，與40%的乙醇溶液按1∶12(m/v)的物料比在70 ℃下反應(yīng)75 min。靜置，減壓抽濾，離心，萃取，旋蒸濃縮，將濃縮后的粘稠物放入烘箱，設(shè)置烘箱溫度為45 ℃，干燥得迷迭香乙醇提取物粉末。經(jīng)亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定迷迭香提取物中總黃酮的含量為43.58%，經(jīng)硫酸亞鐵比色法測定提取物中迷迭香酸的含量為22.12%，經(jīng)苯酚-硫酸比色法測定提取物中多糖含量為19.15%。

1.2試劑與儀器

迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)，上海源葉生物科技有限公司；迷迭香，臨朐安君中藥材種植專業(yè)合作社；吡拉西坦片(華潤雙鶴利民藥業(yè)濟(jì)南有限公司)；丙二醛(MDA)檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所；WFJ7200型紫外-可見分光光度儀(尤尼柯上海儀器公司)；跳臺記錄儀(YLS-3T)，北京吉安得科技有限公司；Morris水迷宮(XR-XM101)，上海欣軟信息科技有限公司；臭氧發(fā)生器(SK-CFG-10)，濟(jì)南三康環(huán)?？萍加邢薰?。

1.3實(shí)驗(yàn)動物

昆明種雄性小鼠(泰邦生物科技有限公司)，雌雄各半，體重平均為18～22 g。生產(chǎn)許可證號SCXK(魯)2003-0011。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(20～25)℃，濕度 40%～60%，12 h光照交替。

1.4 建模與給藥 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后隨機(jī)分為 4組：分別為空白對照組、臭氧模型組、迷迭香組、吡拉西坦對照組，每組小鼠10只。其中迷迭香組灌胃迷迭香醇提物800 mg/(kg·d)，2次/d；吡拉西坦對照組灌胃600 mg/(kg·d), 2次/d；空白對照組和臭氧模型組灌胃 10 mL/kg生理鹽水, 2次/d。除空白對照組小鼠外，其余各組小鼠分別置于體積為0.12 m3且開有通風(fēng)孔的箱子中通入臭氧，臭氧發(fā)生器裝置中的氧氣流量定為0.4 m3/h。每隔1天通1次臭氧，每次25 min。給臭氧后，與空白對照組相比,臭氧模型組小鼠攝食量減少，體重明顯降低，行動遲緩，精神萎靡，皮毛暗淡，眼睛顏色變深且渾濁無光，并偶有呼吸急促、全身顫栗、躁動不安的體征狀況。且隨給臭氧次數(shù)增加,表現(xiàn)愈加明顯。14 d后，臭氧衰老模型建模成功。停止給臭氧、停止給藥，斷食給水24 h后進(jìn)行學(xué)習(xí)行為能力測試和生化指標(biāo)檢測。

1.5 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

Morris 水迷宮由圓水池(直徑 80 cm，高30 cm，水深15 cm)和1個可移動位置的安全臺組成，水溫控制在(22±0.5)℃。水池內(nèi)壁為黑色，水池周圍用黑色不透光的幕布遮住，水面高出安全臺表面0.5 cm，安全臺表面為黑色，小鼠不能看到。將圓形水池分為四個象限，水池上方通過攝像機(jī)與監(jiān)視電視連接，對動物活動進(jìn)行全程跟蹤。實(shí)驗(yàn)過程中水池及周圍環(huán)境保持不變，供小鼠作為空間定位之用。

1.5.1定向游泳實(shí)驗(yàn) 用于測試小鼠對水迷宮學(xué)習(xí)能力。將安全臺固定在第四象限，實(shí)驗(yàn)過程中位置保持不變。在水池上每個象限處標(biāo)定一點(diǎn)作為每次小鼠的入水點(diǎn)，先后將小鼠從 4 個象限的入水點(diǎn)頭朝池壁放入水中，每次以60 s為限，紀(jì)錄小鼠從入水點(diǎn)到達(dá)安全臺所需時間，以所需時間作為其學(xué)習(xí)和記憶的成績。若小鼠在60 s 內(nèi)仍未找到平臺，計(jì)算機(jī)停止跟蹤，將其引導(dǎo)至平臺停留 30 s，記錄時間為60 s。此為獲得性實(shí)驗(yàn)， 2 次/d, 連續(xù)進(jìn)行5天。記錄小鼠尋找并爬上平臺所需時間(逃避潛伏期)。

1.5.2空間探索實(shí)驗(yàn) 用于測量小鼠對平臺空間位置記憶能力。在獲得性實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，隔1天，開始進(jìn)行探查性實(shí)驗(yàn)。將安全臺撤除后，隨機(jī)選擇1個入水點(diǎn)，將小鼠頭朝池壁放入水池中，記錄小鼠第1次到達(dá)安全臺原位置所用的時間及穿越安全臺的次數(shù)，以此作為其空間學(xué)習(xí)記憶的檢測指標(biāo)。

1.6 跳臺實(shí)驗(yàn)

跳臺實(shí)驗(yàn)是一次性刺激回避反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，能較客觀地反映動物經(jīng)過1次刺激后記憶獲得的情況，尤其適用于藥物篩選實(shí)驗(yàn)。將小鼠放入相互隔開的小室中，底面鋪銅柵，可通電，內(nèi)有5 cm高的絕緣平臺作為回避電擊安全區(qū)。設(shè)定電流為0.1 mA，當(dāng)小鼠受到電擊后，會躲避電擊迅速跳上平臺。跳上平臺的小鼠可能會再次或多次跳下平臺受到電擊，電擊后小鼠又會迅速跳回平臺。如此訓(xùn)練5 min，并記錄5 min內(nèi)小鼠跳臺次數(shù)。24 h后重新測試，此次測試條件不變，方法同上，記錄5 min內(nèi)小鼠的跳臺次數(shù)，以此反映記憶保持的情況。

1.7 生化指標(biāo)檢測

跳臺實(shí)驗(yàn)后，禁食不禁水。除空白對照組給生理鹽水之外，其余各組小鼠再分別給臭氧、給藥1次，24 h后摘眼球取血，離心制備血清。按試劑盒操作說明測定血清中MDA含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用采用方差分析，組間兩兩比較用LSD法。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1對臭氧衰老模型小鼠Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)的影響

2.1.1對定向游泳實(shí)驗(yàn)的影響 從D3開始，除臭氧模型組之外，各組小鼠整體出現(xiàn)潛伏期變短并趨于平穩(wěn)的趨勢，說明小鼠經(jīng)過訓(xùn)練后獲得記憶。與空白組比較，臭氧模型組D4(P<0.05)和D5(P<0.01)逃避潛伏期明顯延長，說明本實(shí)驗(yàn)中臭氧模型建模成功；與臭氧模型組比較，迷迭香、吡拉西坦都能明顯縮短逃避潛伏期(P<0.05，P<0.01)，說明迷迭香和吡拉西坦都能有效的改變臭氧模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，但是迷迭香醇提物不如吡拉西坦效果更顯著,見表1。

表1 迷迭香醇提物對小鼠水迷宮逃避潛伏期的影響

2.1.2對空間探索實(shí)驗(yàn)的影響 與空白對照組比較，臭氧模型組小鼠首次找到安全臺原位置的時間最長(P<0.05)，安全臺穿越次數(shù)最少(P<0.05)；與臭氧模型組比較，迷迭香醇提物能減少小鼠找到安全臺的時間，增加安全臺穿越次數(shù)(均P<0.05)，但效果不及吡拉西坦(P<0.05，P<0.01)。見表2。

表2 迷迭香醇提物對小鼠水迷宮探查性實(shí)驗(yàn)的影響

與空白對照組比較，#P<0.05；與臭氧模型組相比，*P<0.05。

2.2對臭氧衰老模型小鼠跳臺實(shí)驗(yàn)的影響

與空白對照組比較，臭氧模型組小鼠跳臺錯誤次數(shù)明顯增多(P<0.05)，說明模型組小鼠對于電擊記憶差，大腦遲鈍；迷迭香和吡拉西坦均能明顯降低錯誤次(均P<0.05)。見圖1。

表3 迷迭香醇提物對小鼠血清MDA的影響

2.3對臭氧衰老模型小鼠MDA的影響

與空白對照組相比較，臭氧模型組血清MDA含量顯著升高(P<0.01)，提示臭氧損傷抗氧化系統(tǒng)，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化。迷迭香和吡拉西坦均能顯著降低血清MDA含量(均P<0.01)，效果相當(dāng)。見表3。

3 討 論

臭氧衰老小鼠模型是根據(jù)衰老自由基理論而設(shè)計(jì)的。作為一種強(qiáng)氧化劑，臭氧能與有機(jī)分子作用產(chǎn)生過量的自由基，影響生物活性，加速機(jī)體功能衰退，誘導(dǎo)衰老[5]。動物實(shí)驗(yàn)證明,臭氧能使胸腺及脾臟免疫器官萎縮,免疫反應(yīng)下降[6],學(xué)習(xí)能力降低，在一定程度上模擬了阿爾茨海默病的發(fā)病特點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，臭氧能使小鼠在形態(tài)、行為上明顯出現(xiàn)衰老指征，在水迷宮及跳臺實(shí)驗(yàn)中學(xué)習(xí)能力降低、空間記憶功能障礙，這與李軍等人[7]報(bào)道的結(jié)果相一致。同時結(jié)果也表明吡拉西坦(腦復(fù)康)、迷迭香醇提物均能不同程度地改善臭氧衰老小鼠的自發(fā)活動和行為學(xué)表現(xiàn)，提高學(xué)習(xí)記憶功能。

研究表明，脂質(zhì)過氧化作用在心血管疾病、老年病等進(jìn)展過程中起著一定的作用。體內(nèi)某些正常物質(zhì)代謝過程及某些藥物或毒物在體內(nèi)代謝變化過程中生成的自由基,可引起脂質(zhì)發(fā)生過氧化作用(LPO),其中間產(chǎn)物丙二醛(MDA)可使生物大分子破壞[8],因此, 測定血清MDA含量可了解體內(nèi)脂質(zhì)過氧化作用的程度,對于研究某些疾病及藥物或毒物的作用非常有意義。本研究結(jié)果顯示臭氧模型組小鼠血清MDA含量顯著升高，而迷迭香能明顯降低小鼠MDA含量，說明迷迭香醇提物能有效的抵御臭氧引起的脂質(zhì)過氧化和自由基損傷。

本研究采用的迷迭香醇提物未經(jīng)純化和精制，內(nèi)含多種有效活性成分，如：酚酸類、黃酮類等。因此不能確定具體是迷迭香中哪一種活性物質(zhì)占主要作用，可能是多種成分的協(xié)同作用，也可能某些成分對其他成分起到拮抗作用。鑒于此，本研究經(jīng)過幾種不同濃度的平行預(yù)示實(shí)驗(yàn)后選取比吡拉西坦?jié)舛萚600 mg/(kg·d)]略大的迷迭香提取物濃度[800 mg/(kg·d)]作為灌胃濃度。目前關(guān)于迷迭香醇提物口服后在動物體內(nèi)的代謝途徑和代謝機(jī)制尚不清楚，但濃度相當(dāng)?shù)拿缘愦继嵛锬苓_(dá)到與吡拉西坦幾乎相當(dāng)?shù)淖饔眯Ч?，可間接說明迷迭香醇提物口服吸收好，具有良好的藥代動力學(xué)特性，對阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)有一定的治療前景。