張 山 董 超 吳澳華 焦鳳萍 申 培 李 剛

山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)公共衛(wèi)生學(xué)院,山東 泰安 271016

真姬菇是常見(jiàn)的藥食同源食用菌，也是我國(guó)食用菌工廠化生產(chǎn)的重要品種之一。其肉厚、味鮮、質(zhì)韌、口感佳，還有獨(dú)特的蟹香味，也被稱為蟹味菇。在日本民間有“香在松茸、味在玉蕈”的說(shuō)法。同時(shí)它還具有預(yù)防衰老、提高免疫力、抗癌、治療便秘等多種藥用價(jià)值[1]。

真菌多糖具有一定的抗癌作用和免疫活性[2],真姬菇多糖功能的研究多關(guān)注于其抗菌作用和抗氧化功能[3]，而對(duì)其抗癌作用研究較少。本研究將采用細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)真姬菇菌糠多糖對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用和促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡的作用，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)和Western blot法檢測(cè)Wnt/β-catenin通路相關(guān)分子的基因和蛋白表達(dá)水平，以探索真姬菇菌糠多糖是否可以通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)HepG2細(xì)胞的凋亡，從而為開(kāi)發(fā)治療肝癌的輔助藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞和多糖溶液 本實(shí)驗(yàn)中采用的HepG2細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存，真姬菇菌糠多糖粉末由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)賈樂(lè)教授提供。

1.1.2主要試劑 1%青霉素鏈霉素、MTT、Trizol、SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒等購(gòu)自泰安聯(lián)星科技有限公司，GAPDH、Bax、β-catenin和Caspase-3等抗體購(gòu)自Abcam公司，DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清FBS等試劑購(gòu)自泰安華鵬生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1多糖溶液配制 將5 g真姬菇菌糠多糖粉末溶于預(yù)熱的10 mL雙蒸水，37 ℃水浴中溶解1 h。3 000 r/min離心15 min，吸上清，采用0.45 μm、0.22 μm的濾膜2次過(guò)濾除菌。硫酸苯酚法測(cè)定多糖溶液濃度，將多糖溶液分裝至1.5 mL Ep管中， -20 ℃冰箱冷凍保存。

1.2.2MTT法測(cè)定真姬菇菌糠多糖抑制HepG2細(xì)胞增殖 加入10%FBS和1%PS的DMEM培養(yǎng)基用于培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，將HepG2細(xì)胞按2×104個(gè)/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)過(guò)液，加入真姬菇菌糠多糖溶液，設(shè)置25 μg/mL和50 μg/mL組、陰性對(duì)照組(細(xì)胞培養(yǎng)液)，每組6個(gè)復(fù)孔。分別在第1、2、3、4和5天后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率，方法如下：每孔中加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，培養(yǎng)4 h，棄去上清，再加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，注意避光、震蕩10 min后采用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞的存活率，細(xì)胞存活率(%)=A藥物組/A對(duì)照組×100%。

1.2.3真姬菇菌糠多糖對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響 將HepG2細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，1×103個(gè)/孔，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，加入真姬菇菌糠多糖溶液，終濃度為50 μg/mL,設(shè)立陰性對(duì)照組(細(xì)胞培養(yǎng)液)和陽(yáng)性對(duì)照組(DOX,5 μmol/L)。繼續(xù)5%CO2、37 ℃培養(yǎng)72 h,采用倒置顯微鏡觀察HepG2細(xì)胞形態(tài)。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白的基因表達(dá)水平 接種HepG2細(xì)胞至12孔板，2×105個(gè)/孔，分為真姬菇菌糠多糖50 μg/mL組和陰性對(duì)照組(細(xì)胞培養(yǎng)液)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模板，采用 SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)β-catenin、Caspase-3、Bax和β-actin的 mRNA水平。引物：β-catenin正向5’-TTTGATGGAGTTGGACATGG-3’，反向 5’-CAGGACTTGGGAGGTATCCA-3’；Caspase-3正向 5’-GCCACGTCTCCACACATCAG-3’，反向 5’-TGGTGCATTTTCGGTTGTTG-3’；Bax正向5’-GATTTCATTTACGAGCGG-3’，反向5’-AGCGTCGA CCTCGAGATC-3’；β-actin正向5’-CAAGAGATGGCCACGGCTGCT-3’，反向5’-TCCTTCT GCATCCTGTCGGCA-3’。反應(yīng)條件95 ℃、30 s，1個(gè)循環(huán)；95 ℃、5 s，60 ℃、10 s，40個(gè)循環(huán)。

1.2.5Western blot檢測(cè)Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況 將HepG2細(xì)胞接種至六孔細(xì)胞培養(yǎng)板，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)24 h后，加入真姬菇菌糠多糖溶液，終濃度為50 μg/mL。48 h后收集細(xì)胞用于Western blot檢測(cè)。RIPA裂解細(xì)胞、離心、取上清、測(cè)定蛋白濃度。采用SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉1 h、孵育一抗(4 ℃過(guò)夜)，采用TBST緩沖液清洗3次，每次放搖床約10 min；孵育二抗，室溫?fù)u床2 h；再用TBST緩沖液清洗3次，如上述方法。采用掃膜儀進(jìn)行掃膜，觀察結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 真姬菇菌糠多糖抑制HepG2細(xì)胞增殖

我們采用MTT法檢測(cè)了真姬菇菌糠多糖對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用，對(duì)組間比較(F=30.956,P<0.001)，時(shí)間效應(yīng) (F=155.487,P<0.001)，交互作用(F=4.063，P<0.001)的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)表1，結(jié)果表明50 μg/mL的真姬菇菌糠多糖具有明顯的抑制細(xì)胞增殖作用，見(jiàn)圖1。

圖1 真姬菇菌糠多糖對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用

表1 陰性對(duì)照組與不同濃度多糖組數(shù)據(jù)的重復(fù)測(cè)量分析

2.2 真姬菇菌糠多糖對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響

同時(shí)，為了探索真姬菇菌糠多糖對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響，我們采用倒置顯微鏡放大200倍觀察了真姬菇菌糠多糖溶液處理后的HepG2細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果見(jiàn)圖2，50 μg/mL真姬菇菌糠多糖處理后的HepG2細(xì)胞發(fā)生明顯皺縮，其形態(tài)與陽(yáng)性對(duì)照組(5 μmol/L DOX)相似，表明真姬菇菌糠多糖可能促使HepG2細(xì)胞發(fā)生了凋亡。

2.3 真姬菇菌糠多糖對(duì)HepG2細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果見(jiàn)表2，與陰性對(duì)照組相比50 μg/mL的真姬菇菌糠多糖可抑制HepG2細(xì)胞中β-catenin(t=3.940，P<0.05)和Caspase-3(t=3.847，P<0.05)基因的表達(dá)水平，但可以上調(diào)Bax(t=3.975，P<0.05)基因的表達(dá)水平，見(jiàn)圖3。

圖3 真姬菇菌糠多糖對(duì)β-catenin、Caspase-3和Bax基因表達(dá)水平的影響(*為P<0.05)

表2 β-catenin、Caspase-3和Bax實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)數(shù)據(jù)及分析

2.4 真姬菇菌糠多糖對(duì)HepG2細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

在本實(shí)驗(yàn)中，為了探索真姬菇菌糠多糖是否對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路產(chǎn)生影響，我們采用Western blot方法檢測(cè)了Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白β-catenin、Caspase-3及其下游分子Bax的表達(dá)情況。結(jié)果見(jiàn)圖4，真姬菇菌糠多糖抑制HepG2細(xì)胞中β-catenin、Caspase-3的蛋白表達(dá)量，上調(diào)了通路下游分子Bax的表達(dá)。

圖4 真姬菇菌糠多糖對(duì)β-catenin、Caspase-3和Bax蛋白表達(dá)量的影響

3 討 論

肝癌的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4-6]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是目前研究的熱點(diǎn)，Wnt蛋白與跨膜受體結(jié)合后可將Wnt信號(hào)傳遞到胞質(zhì)的蛋白上，然后經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)使細(xì)胞內(nèi)的β-catenin水平升高、轉(zhuǎn)位與細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，進(jìn)而激活下游的靶基因發(fā)揮生物學(xué)功能[7-9]。細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子包括：轉(zhuǎn)錄活化因子、T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子等，下游的靶基因包括：survivin、細(xì)胞周期蛋白D1、c-myc等[10]。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路中各成分突變或表達(dá)量的變化均可誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生,在乳腺癌、肝癌等惡性疾病中已檢測(cè)出 Wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)生了異常的活化[11-13]。呂君等[14]發(fā)現(xiàn)APS通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路導(dǎo)致Bcl-2的表達(dá)被抑制，最終導(dǎo)致HepG2細(xì)胞凋亡。包鴻慧等[15]研究發(fā)現(xiàn)真姬菇多糖具有免疫調(diào)節(jié)活性,可以作為免疫調(diào)節(jié)劑應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，是腫瘤靶向藥物研究的熱點(diǎn)。β-catenin不直接參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控，通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子間的相互作用實(shí)現(xiàn)對(duì)下游相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控。Bax是水溶性相關(guān)蛋白，與Bcl-2同源，是Bcl-2基因家族中促細(xì)胞凋亡基因，Bax過(guò)度表達(dá)可拮抗Bcl-2抑制凋亡作用而使促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生程序性死亡。

在本實(shí)驗(yàn)中， MTT實(shí)驗(yàn)顯示50 μg/mL的真姬菇菌糠多糖可以抑制HepG2細(xì)胞增殖，細(xì)胞形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)真姬菇菌糠多糖處理后的HepG2細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡，結(jié)果表明真姬菇菌糠多糖具有促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡和抑制HepG2細(xì)胞增殖的雙重作用。同時(shí)為了進(jìn)一步探索機(jī)制，我們檢測(cè)了真姬菇菌糠多糖對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路中相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)真姬菇菌糠多糖可抑制β-catenin和Caspase-3的表達(dá)，但可上調(diào)Bax的表達(dá)水平。因此，我們推測(cè)真姬菇菌糠多糖可能通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)及上調(diào)其下游的Bax的表達(dá)而促進(jìn)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡，發(fā)揮抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用，從而為將其開(kāi)發(fā)為肝癌治療的輔助藥物提供了理論依據(jù)。