楊璐平 劉方永 徐 凱 王榮榮 高紅莉

山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)1.藥學(xué)院，2.運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)與康復(fù)學(xué)院，山東 泰安 271016

穿山龍，其來源為薯蕷科多年生草本植物穿龍薯蕷DioscoreaNipponicaMakino的干燥根莖，為泰山道地藥材之一，臨床常用于風(fēng)濕痹痛、跌撲損傷、咳嗽氣喘等病證[1]。有研究表明穿山龍及其提取物有一定的抗腦缺血損傷作用[2-3]，但對(duì)其腦保護(hù)的作用機(jī)制尚未闡明。本實(shí)驗(yàn)通過MCAO大鼠模型，探討穿山龍的主要有效成分穿山龍總皂苷的腦保護(hù)作用及其機(jī)制，以期對(duì)其腦血管方面的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

穿山龍購自泰安市永春堂中藥飲片有限公司，經(jīng)山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)中藥學(xué)教研室曲曉蘭副教授鑒定其來源為穿龍薯蕷DioscoreaNipponicaMakino，用藥部位為根莖。穿山龍總皂苷為山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)中藥學(xué)教研室提取，為棕色粉末，純度為55.6%。尼莫地平片(20 mg/片，山東新華制藥有限公司)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(Sigma公司)；蘇木素-伊紅染液(南京建成)，MMP-2兔多克隆抗體、HRP標(biāo)記羊抗兔lgG(北京博奧森)，SOD、MDA試劑盒(南京建成)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，體質(zhì)量200～240 g，共70只。均為雄鼠，SPF級(jí)，合格證號(hào)：SYXK(魯)20140007。放置于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室喂養(yǎng)，室溫20～25 ℃，相對(duì)濕度35%～65%。

1.3 儀器

石蠟切片機(jī)(德國Leica)，IPP圖像采集分析系統(tǒng)(美國Media Cybernetics公司)，紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用)。

1.4 MCAO大鼠模型制備與分組

適應(yīng)喂養(yǎng)7 d后，大鼠隨機(jī)分為5組：模型組、穿山龍總皂苷高劑量組(100 mg/kg)、穿山龍總皂苷低劑量組(50 mg/kg)、尼莫地平組(10 mg/kg)與假手術(shù)組。各組大鼠均是灌胃給予相應(yīng)劑量的藥物，造模前7 d開始給藥，1次/d。等量生理鹽水給予假手術(shù)組與模型組大鼠灌胃。

參照 Longa 等[4]的方法制備MCAO大鼠模型，末次給藥1 h后水合氯醛( 350 mg/kg)ip麻醉大鼠。采用頸部正中切口，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)后找到頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)和頸外動(dòng)脈(ECA)，小心將三者分離。ECA的根部用絲線進(jìn)行結(jié)扎，同時(shí)用動(dòng)脈夾夾閉CCA的近心端，ICA也用動(dòng)脈夾夾閉。用眼科剪在CCA遠(yuǎn)心端上剪一小口，插入前端處理成圓頭的栓線，栓線直徑為0.24～0.26 mm，栓線沿CCA，穿過ICA和ECA的分叉處插入ICA。松開ICA，栓線繼續(xù)緩慢插入約1.8～2.0 cm，以微感阻力為止，結(jié)扎固定拴線。術(shù)中維持大鼠肛溫為37 ℃。假手術(shù)組大鼠手術(shù)操作同上，只是栓線插入長度小于1 cm。大鼠清醒后參照Longa 5級(jí)4分制評(píng)分法[4]對(duì)各組進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，其中評(píng)為1～3分為造模成功，每組選取模型成功者12只納入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 血清SOD及MDA指標(biāo)的測(cè)定

大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分后，取過量10%水合氯醛ip麻醉，腹主動(dòng)脈取血5 mL，常規(guī)方法離心獲得血清。按試劑盒說明書用紫外分光光度計(jì)測(cè)取其吸光度，計(jì)算血清SOD 活性及MDA含量。

1.6 腦梗死范圍的測(cè)定

大鼠取血后，每組隨機(jī)取6只，斷頭后完整剝離大腦，預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈。大腦去掉低位腦干、小腦和嗅球，-20 ℃速凍20 min。取出后將大腦沿冠狀面平均切為6片，每片厚度2 mm。TTC制作成1%的染液，將腦片按順序放入，置于37 ℃避光染色，10 min后翻面1次，繼續(xù)染色10 min。腦組織染色后梗死部位呈現(xiàn)為白色，而正常組織則被染為紅色。腦片經(jīng)4%多聚甲醛固定后用掃描儀掃取圖像。用IPP圖像采集處理系統(tǒng)軟件對(duì)圖像進(jìn)行處理分析，對(duì)腦片的梗死面積用軟件進(jìn)行測(cè)量，梗死體積為梗死面積乘以厚度。

1.7 腦組織病理形態(tài)學(xué)觀察

每組另外6只大鼠4 ℃生理鹽水心臟快速灌注，至右心耳流出液清澈時(shí)更換為4 ℃4%多聚甲醛繼續(xù)灌注進(jìn)行腦內(nèi)固定，斷頭后完整取出大腦。按照常規(guī)方法進(jìn)行腦組織石蠟切片制作。腦組織切片進(jìn)行常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察腦梗死部位神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)變化，采集圖像并進(jìn)行分析。

1.8 腦組織MMP-2的蛋白表達(dá)檢測(cè)

常規(guī)制作腦組織石蠟切片，微波抗原修復(fù)后，滴加1∶100稀釋的MMP-2一抗，置于濕盒中4 ℃過夜。次日滴加HRP標(biāo)記羊抗兔lgG，稀釋比例為1∶50，37 ℃孵育30 min。切片用DAB顯色，蘇木素進(jìn)行復(fù)染。切片經(jīng)脫水、透明后封片。放置于光學(xué)顯微鏡下觀察，以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞漿著色為棕黃色定為陽性細(xì)胞。每組隨機(jī)選取8張切片，每張切片在400倍鏡下選取缺血周邊區(qū)典型的不重疊的5個(gè)視野，采集圖像并用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0測(cè)定陽性細(xì)胞率。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 穿山龍總皂苷對(duì)MCAO大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、腦梗死體積的影響

神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果顯示，除假手術(shù)組外各組大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分均有所提高，特別是模型組大鼠的評(píng)分顯著升高(P<0.01)，提示造模成功。與模型組相比，穿山龍總皂苷高劑量組(100 mg/kg)和尼莫地平組神經(jīng)功能評(píng)分顯著降低(P<0.01或P<0.05)。從TTC染色結(jié)果來看，穿山龍總皂苷高、低劑量組(100 mg/kg，50 mg/kg)均能減小腦梗死體積(P<0.01或P<0.05)。以上結(jié)果表明穿山龍總皂苷能降低MCAO大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分，縮小腦梗死范圍。具體結(jié)果見表1。

表1 穿山龍總皂苷對(duì)MCAO大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、腦梗死體積的影響

2.2 穿山龍總皂苷對(duì)MCAO大鼠血清中MDA、SOD指標(biāo)的影響

檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組與假手術(shù)組有較大差異，血清中MDA含量顯著升高，同時(shí)SOD活性明顯降低(P<0.01)。與模型組相比，穿山龍總皂苷治療組對(duì)MDA、SOD兩個(gè)指標(biāo)顯示出較好的改善作用，其低劑量組能降低MDA含量(P<0.05)，而高劑量組能顯著降低MDA含量同時(shí)升高SOD活性(P<0.01或P<0.05)。結(jié)果見表2。

表2 穿山龍總皂苷對(duì)MCAO大鼠血清MDA含量和SOD活性的影響

2.3 穿山龍總皂苷對(duì)MCAO大鼠腦組織病理形態(tài)的影響

HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組大鼠腦組織形態(tài)基本正常，模型組大鼠的腦組織細(xì)胞數(shù)量則顯著下降，神經(jīng)元出現(xiàn)變性、壞死，核固縮，部分核仁消失，胞體變形。與模型組相比，穿山龍總皂苷治療組腦組織病理形態(tài)得到了不同程度的改善，其中高劑量組改善較為明顯，見圖1。

A.假手術(shù)組；B.模型組；C.穿山龍總皂苷高劑量組；D.穿山龍總皂苷低劑量組；E.尼莫地平對(duì)照組。圖1 各組大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)觀察(HE，×400)

2.4 穿山龍總皂苷對(duì)MCAO大鼠腦組織MMP-2蛋白表達(dá)的影響

模型組腦組織中MMP-2表達(dá)與假手術(shù)組相比顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，穿山龍總皂苷治療組(100 mg/kg，50 mg/kg)的MMP-2蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.01或P<0.05)，尼莫地平組表達(dá)也明顯降低(P<0.05)。具體見表3、圖2。

表3 穿山龍總皂苷對(duì)MCAO大鼠腦組織MMP-2蛋白表達(dá)的影響

A.假手術(shù)組；B.模型組；C.穿山龍總皂苷高劑量組；D.穿山龍總皂苷低劑量組；E.尼莫地平對(duì)照組。圖2 各組免疫組化MMP-2蛋白表達(dá)(DAB，×400)

3 討 論

缺血性腦血管病是腦血管疾病中最常見的類型，中醫(yī)稱為“中風(fēng)”。缺血性腦血管病的發(fā)病比較復(fù)雜，其病理機(jī)制涉及多個(gè)因素，如氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、Ca2+超載、興奮性氨基酸毒性、細(xì)胞凋亡等等[5-6]，其中氧化應(yīng)激、血腦屏障受損、細(xì)胞凋亡是其重要原因。

氧化應(yīng)激是腦缺血損傷早期重要的損傷機(jī)制之一，內(nèi)源性的抗氧化物質(zhì)的耗竭會(huì)造成腦缺血損傷。腦缺血時(shí)，由于自由基的大量堆積和過度的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致大量MDA產(chǎn)生。過量MDA會(huì)導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)以及功能的破壞，造成神經(jīng)毒性損傷及神經(jīng)功能障礙[7]。SOD的功能主要是參與消除氧自由基，它是機(jī)體重要的抗氧化酶，其作用是保護(hù)細(xì)胞，使其不受氧化性損害。SOD活性是反映機(jī)體清除自由基的能力的指標(biāo)[8]，因此SOD和MDA在一定程度上可反映大腦損傷的輕重程度。在腦缺血早期，MMP-2也是造成缺血損傷的因素之一，研究表明，MMP-2參與了血腦屏障的破壞，從而加重腦水腫，使腦損傷加劇。腦缺血損傷時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量氧自由基，而MMP-2等基質(zhì)金屬蛋白酶通過PTK(protein tyrosine kinase)依賴方式被活化，而MMPs的組織抑制劑同時(shí)被減少造成MMPs活化?；罨腗MPs會(huì)造成緊密連接蛋白1的過度降解，血腦屏障受損，從而加重腦水腫[9]。缺血缺氧還可激活某些凋亡相關(guān)基因，同時(shí)大量氧自由基的產(chǎn)生對(duì)神經(jīng)元造成損傷，可誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生[10]。上述病理環(huán)節(jié)互相作用，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死。

本研究結(jié)果顯示穿山龍總皂苷可以降低MCAO大鼠的神經(jīng)行為評(píng)分，減小腦梗死體積，改善腦組織病理形態(tài)，提示穿山龍總皂苷具有一定的腦保護(hù)作用。另外，穿山龍總皂苷可以提高M(jìn)CAO大鼠血清中SOD活性同時(shí)降低MDA含量，降低腦組織中MMP-2的蛋白表達(dá)，因而推測(cè)穿山龍總皂苷的腦保護(hù)作用可能通過減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物同時(shí)提高抗氧化酶活性，調(diào)節(jié)血腦屏障減輕腦水腫而發(fā)揮作用，其詳細(xì)的機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。